血管保護藥物組合物及其用圖
【專利摘要】本發明公開了一種血管保護藥物組合物，所述的藥物組合物的活性成分僅為天麻素和薯蕷皂苷元，所述天麻素和薯蕷皂苷元的摩爾比為10～6:1～4。本發明也公開了一種血管保護藥物組合物，所述的藥物組合物包括摩爾比為10～6:1～4的天麻素和薯蕷皂苷元。本發明還公開了上述藥物組合物在制備血管保護藥物制劑中的用途。
【專利說明】
血管保護藥物組合物及其用途
技術領域
[0001]本發明涉及一種血管保護藥物組合物及其用途，尤其是源自天然藥材提取物的血 管保護藥物組合物及其用途。
【背景技術】
[0002]血管新生(Angiogenesis)是在原有血管的基礎上形成新血管的過程，多發生于癌 癥、癡呆、心血管疾病、糖尿病等多種疾病中。血管新生包括分裂和出芽兩個步驟。基底膜降 解和內皮細胞粘附性降低導致血管穩定性破壞，內皮細胞迀移和內皮干細胞增殖引起血管 出芽，內皮細胞和周細胞的募集導致管腔周圍區域生成新的管腔，逐步形成成熟管腔。血管 新生受到血管生成開關的控制。血管生成開關包括血管生成促進因子和血管生成抑制因 子。當二者處于平衡狀態時，血管穩定，若二者穩態失衡，會促進或抑制血管生成。促血管生 成因子包括VEGF，bFGF，PDGF，AngII等細胞因子，信號介質包括PKC，PI3K，Akt等 ；血管生成 抑制因子包括PEDF等。腦組織處于缺氧狀態時，缺氧反應元件如HIF-Ia會誘導促血管生成 因子的表達，促進內皮細胞增殖和分化、促進細胞迀移，導致血管新生。
[0003] 申請號為01813403.3的中國專利申請公開了一種具有血管保護和抗氧化作用的 制劑，含有從檸檬中得到的松油烯以及維生素 E和/或輔酶Q。上述制劑主要用于預防動脈粥 樣硬化。申請號為200480017771.6的中國專利申請公開了一種血管保護劑，包含聚二十級 醇、生育三烯酚和/或番茄紅素、procyanidole低聚物以及富含ω-3、ω-6不飽和脂肪酸的 植物油。上述血管保護劑主要用于預防和治療由血漿脂質過剩引起的血管損傷。由此可知， 目前用于缺氧狀態下的血管保護制劑并不多見。
[0004] 目前，天然藥材提取物在血管保護劑方面的應用已有研究。例如，申請號為 201110302835.9的中國專利申請公開了一種杜仲化學成分作為血管保護劑的新用途。該杜 仲提取物中包含至少一種選自以下的成分:京尼平苷、漢黃芩素、千葉素 Α、α_氧-β-D-葡萄 吡喃糖基-4,2'，三羥基二氫查耳酮、和白樺脂酸。上述杜仲提取物可以用作有效的血管 保護劑和/或降血壓劑，用于治療和/或預防血管增生性疾病。又如，申請號為 201210184134.4的中國專利申請公開了一種水杉皮提取物，由于其含有較豐富的原花色素 以及多酚類成分，具有很強的自由基清除作用和抗氧化能力、酪氨酸酶抑制作用、葡萄糖 苷酶抑制作用和心血管保護作用。但是，相對于大量的天然藥材，天然藥材提取物在血管保 護劑方面的相關報道仍然是少量的。

【發明內容】

[0005] 為了尋找更多的可用作血管保護劑的天然藥材提取物，本申請的發明人進行了深 入研究。本發明的一個目的就在于提供一種血管保護藥物組合物。本發明的另一個目的在 于提供上述血管保護藥物組合物的用途。
[0006] 本發明提供一種血管保護藥物組合物，所述的藥物組合物的活性成分僅為天麻素 和薯蕷皂苷元，所述天麻素和薯蕷皂苷元的摩爾比為10~6:1~4。優選地，所述天麻素和薯 蕷皂苷元的摩爾比為10~7:1~3。根據本發明的一個【具體實施方式】，所述天麻素和薯蕷皂 苷元的摩爾比為8:2。
[0007] 本發明還提供一種血管保護藥物組合物，所述的藥物組合物包括摩爾比為10~6: 1~4的天麻素和薯蕷皂苷元。優選地，所述的藥物組合物包括摩爾比為10~7:1~3的天麻 素和薯蕷皂苷元。根據本發明的一個【具體實施方式】，所述的藥物組合物包括摩爾比為8:2的 天麻素和薯蕷皂苷元。
[0008] 本發明中，所述天麻素的化學SC13H18〇7，CAS登記號為62499-27-8,結構式如下：
[0009]

[0010] 本發明中，所述薯蕷皂苷元的化學式是C27H42〇3，CAS登記號為512-04-9,結構式如 下：
[0011]
[0012] 本發明還提供一種血管保護藥物制劑，所述藥物制劑含有上述血管保護藥物組合 物和藥學上可接受的輔料。根據本發明的藥物制劑，每單位劑量的藥物制劑中包括2~IOmg 天麻素和0.1~5mg薯蕷皂苷元;優選包括3~6mg天麻素和1~3mg薯蕷皂苷元;更優選包括 4.7mg天麻素和1.7mg薯截阜苷元。
[0013] 本發明的藥物制劑形式沒有特別限制，可以為經口服、舌下、經皮、經肌肉或皮下、 皮膚粘膜、靜脈途徑給藥的多種劑型，例如顆粒劑、片劑(包括含片、咀嚼片）、丸劑(包括滴 丸)或膠囊劑。本發明所提供的各種藥物劑型均可以以藥學常規方法制備而成。本發明的藥 物組合物可以另外含有無藥用活性的天然或合成添加劑或輔劑，例如粘合劑、崩解劑、潤滑 劑、分離劑、溶劑、穩定劑等。本發明的粘合劑的具體實例包括但不限于淀粉、微晶纖維素、 藻酸鹽、明膠、糖、纖維素醚和聚乙烯吡咯烷酮等。本發明的崩解劑的具體實例包括但不限 于淀粉和羥乙基淀粉等。本發明的潤滑劑和分離劑包括但不限于滑石、硬脂酸鹽(例如硬脂 酸鈣和硬脂酸鎂）、碳酸鎂、碳酸鈣、纖維素、氧化鎂、膠態硅膠、硅酸鹽(例如硅酸鈉、硅酸 鎂、硅酸鈣和硅酸鋁)等。本發明的溶劑的具體實例為水。本發明的穩定劑包括但不限于淀 粉衍生物等。
[0014] 本發明也提供上述藥物組合物在制備血管保護藥物制劑中的用途。優選地，所述 的血管保護藥物制劑用于在缺氧狀態下控制血管新生。更優選地，所述的血管保護藥物制 劑通過降低缺氧誘導因子HIF-Ia和血管內皮生長因子VEGF的表達來控制血管新生。
【附圖說明】
[0015] 圖1.不同摩爾濃度配比的天麻素和薯蕷皂苷元下缺氧HUVECs的存活率。
[0016] 圖2.不同摩爾濃度配比的天麻素和薯蕷皂苷元下的缺氧HUVECs中的活性氧含量。
[0017]圖3.不同組別的缺氧HUVECs的細胞比例；其中，給藥組的天麻素和薯蕷皂苷元的 摩爾濃度配比為8:2。
[0018]圖4.不同組別VEGF的western blot表達;其中，給藥組的天麻素和薯截阜苷元的 摩爾濃度配比為8:2。
[0019]圖5.不同組別HIF-Ia的western blot表達；其中，給藥組的天麻素和薯截阜苷元 的摩爾濃度配比為8:2。
[0020]圖6.不同組別iNOS的western blot表達;其中，給藥組的天麻素和薯截阜苷元的 摩爾濃度配比為8:2。
[0021]圖7.不同組別eNOS的western blot表達;其中，給藥組的天麻素和薯截阜苷元的 摩爾濃度配比為8:2。
【具體實施方式】
[0022]下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明，但本發明的保護范圍并不限于 此。
[0023]〈藥品與儀器〉
[0024] 本發明的實施例的藥品與試劑如下：
[0025] 天麻素標準品：中國藥品生物制品檢定所，批號。
[0026] 署預阜昔兀標準品：中國藥品生物制品檢定所，批號。
[0027] VEGF抗體：英國 Abcam公司，Ab46154。
[0028] HIF-la 抗體:英國 Abcam 公司，Ab2185。
[0029] iNOS 抗體：英國 Abeam 公司，Abl5323。
[0030] eNOS 抗體：美國 ImmunoWay 公司，YM3164。
[0031]山羊抗兔IgG(H+L)，HRP:天德悅(北京)生物科技有限責任公司。
[0032] DEMD/F12培養基：美國Gibco公司，批號929215。
[0033] 胎牛血清(FBS):美國Hyclone公司，批號AUB34148。
[0034] 明膠:美國西格瑪奧德里奇公司（Sigma)，批號G7765。
[0035] I型膠原酶:美國西格瑪奧德里奇公司，批號C9722。
[0036] 胰蛋白酶:Amresco公司，北京拜爾迪生物技術公司分裝。
[0037] ECM培養基：美國ScienCell公司，批號1001。
[0038] Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒：上海碧云天生物技術有限公司，批號 C1063〇
[0039] CCK-8試劑盒：日本同仁化學研究所，批號FQ659。
[0040] 卩85:稱取恥(：18.(^，1((：10.28，詘2?〇4〇.28，恥2冊〇4.12!12〇2.98，加入三蒸水定 容至1000 mL，調節pH 7.2，0.22μπι濾膜過濾除菌，分裝。4°C儲存，-20 °C凍存。
[00411 DMEM/F12培養液:將1袋DMEM/F12干粉培養基溶于三蒸水后，加入1.2g NaHCO3,磁 力攪拌直至顆粒完全溶解，加水至1000mL，4°C靜置2h，瓶底無沉淀時使用0.22ym濾膜過濾 除菌，分裝。4 °C儲存，-20 °C凍存。
[0042] 0.05%胰蛋白酶/0.02%EDTA消化液:分別稱取0.05g胰蛋白酶、0.02g EDTA粉末 (Amresco公司，北京拜爾迪生物技術公司分裝），充分溶于IOOmL PBS中，0.22μπι微孔濾膜過 濾除菌，分裝，-20 °C保存備用。
[0043] 3 % BSA-TBST: 3 % w/v牛血清白蛋白 BSA，I X TBS(Tr is-HCl緩沖鹽溶液），0 · 1 % Tween-20。
[0044] 5%脫脂奶粉4851':5%1八脫脂奶粉，1\185(1>4-!1(：1緩沖鹽溶液），0.1% Tween-20〇
[0045] TBST: I X TBS( Tr is-HCl緩沖鹽溶液），0 · 1 % Tween-20 〇
[0046] 天麻素溶液:稱取I.OOmg的天麻素，溶于ImL的三蒸水中，配置成濃度為3493μΜ的 天麻素母液，4 °C儲存，使用時采用DMEM/F12培養液稀釋。
[0047] 薯蕷皂苷元溶液:稱取2. OSmg薯蕷皂苷元，溶于250yL的無水乙醇中，配制成濃度 為20mM的母液，4 °C儲存，使用時采用DMEM/F12培養液稀釋。
[0048] 本發明的實施例的主要實驗儀器如下： 全自動流式細胞分析儀 美國貝克曼庫爾特
[0049] (Beckman Coulter), FC500 倒置焚光顯微鏡 日本奧林巴司(Olympus)， LX-B1 多功能微孔板檢測儀 美國分子儀器公司 Frcsco低溫冷凍禺心機 賽默飛世爾(Thermo)公司 MultiSkan3酶標儀 賽默飛世爾(Thermo)公司 Mini P-4電漆槽 凱元信瑞儀器有限公司 (Cavoy)
[0050]濕轉電泳槽 凱元信瑞儀器有限公司 (Cavoy) 電泳儀 伯樂公司(Bio-Rad) 半干槽 伯樂公司(Bio-Rad) 水平脫色搖床 海門市其林貝爾儀器制造 有限公司
[0051 ]〈受試細胞的制備〉
[0052] 下面介紹作為受試細胞的人臍靜脈血管內皮細胞HUVEC的分離培養過程。
[0053] 1.實驗準備
[0054] 25cm2細胞培養瓶用2 %的明膠包被，于4 °C冰箱中過夜，用之前在37 °C細胞培養箱 中放置30min以上，吸棄明膠后，PBS沖洗3次。
[0055] 500mL藍口玻璃瓶于高壓滅菌鍋中滅菌后，加入300mL預冷的PBS，用以運輸臍帶。
[0056] 2 .HUVECs的分離培養
[0057] (1)取臍帶:在無菌條件下，剖腹產手術后立即取新生兒臍帶，臍帶應表面色澤白 嫩，有光澤，并且去除彎曲、血腫、兩端有夾痕的部分后，臍帶的長度為15~30cm，擠壓除凈 臍靜脈內的殘血后，立即投入4 °C預冷的PBS中，6h內完成HUVECs分離。
[0058] (2)沖洗:在超凈工作臺內，用PBS將臍帶表面殘血沖洗干凈后放入彎盤中，臍靜脈 的一端插入大鼠灌胃器，并用止血鉗固定，大鼠灌胃器另一端連接50mL注射器，用PBS緩沖 液緩慢注射，沖洗臍靜脈內殘留的血栓，反復沖洗直至流出的液體變為無色后，再用PBS繼 續沖洗，沖洗過程中動作應緩慢。
[0059] (3)消化:將10~15mL 0.1%1型膠原酶緩慢注入臍靜脈內，直至有膠原酶流出，用 止血鉗夾緊臍帶的膠原酶流出端，繼續注入膠原酶至臍靜脈完全充盈為止，于37°C培養箱 中孵育5~8min，消化結束后抽出消化液，再次注入膠原酶進行消化，消化2次后，用20~ 30mL PBS沖洗臍帶，將消化液和沖洗液一并收集入離心管內。
[0060] (4)收集細胞：1000 rpm離心10min，用PBS重懸、洗滌細胞兩次，1500rpm離心10min， 收集細胞。
[0061 ] (5)細胞培養：以IOmL ECM培養液重懸，制成單細胞懸液，接種于用2%明膠包被的 25cm2細胞培養瓶內，于37 °C、5 % CO2培養箱培養。
[0062] (6)換液:細胞培養72h后，普通倒置顯微鏡下觀察細胞的生長狀況，換液。換液時， 小心吸出培養液后，加入5mL ECM培養液，置37 °C、5 %⑶:^培養箱繼續培養。每2~3d換液1 次，并密切觀察細胞的生長情況，3~5d后，細胞會生長融合成片，即可傳代。
[0063] 3 .HUVECs 傳代培養
[0064] HUVECs生長融合到90 %左右時，可以進行傳代培養。首先，傾倒出培養液，用PBS洗 滌細胞1次，然后加入800yL的0.05 %胰酶/0.02 %EDTA消化液，消化1~2min，鏡下觀察細胞 皺縮變圓時，加入3mL含10 % FBS的ECM培養液終止消化，反復輕輕吹打瓶底，使細胞脫落，收 集細胞懸液，1500rpm離心5min，棄上清，按1:3接種于培養瓶中。第2~5代生長狀態良好的 HUVECs即可用于實驗。
[0065]〈缺氧HUVECs存活率〉
[0066]為了研究不同摩爾濃度配比的天麻素和薯蕷皂苷元的組合對缺氧HUVECs存活率 的影響，進行如下實驗：
[0067] 取第2~5代的HUVECs，將細胞以1\104個/孔接種于96孔板，每孔加入20(^1^含 10%FBS的DMEM/F12的完全培養基于37°C、5%C02的培養箱中培養，培養12h后，更換為無血 清的DMEM/F12的培養基繼續培養12h。
[0068] 將細胞分為正常對照組（給予無血清的DMEM/F12培養液），模型組(給予無血清的 DMEM/F12培養液)和給藥組(給予天麻素(Gas)和薯蕷皂苷元(Dio)的組合物，二者總共20μ Μ，稀釋液為無血清的DMEM/F12培養液）；給藥組按照摩爾濃度配比分組如下 :Gas:Di〇(10: 0)，Gas:Dio(9:l)，Gas:Dio(8:2)，Gas:Dio(7:3)，Gas:Dio(6:4)，Gas:Dio(5:5)，Gas:Dio (0:10)。正常對照組在CO2培養箱中培養;模型組于三氣培養箱（I % O2，5 % CO2，94 %N2)中培 養；給藥組于三氣培養箱（1 % O2，5 %⑶2，94 %N2)中培養。三組分別培養12h后，更換為含 10%CCK-8(2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2!1-四唑單鈉 鹽）的DMEM/F12培養液，37 °C孵育3h。使用多功能微孔板檢測儀，于450nm處測定OD值。實驗 重復3次。
[0069]在缺氧的同時給予不同配比的天麻素和薯蕷皂苷元，作用12h后測定細胞存活率。 不同摩爾濃度配比的天麻素和薯蕷皂苷元下缺氧HUVECs的存活率參見圖1。由圖可知，缺氧 12h顯著影響細胞的存活率42.18% (P〈0.05)。對于不同摩爾濃度配比的天麻素和薯蕷皂苷 元，在Gas :Dio = 9 :1，8: 2,7 :3,6:4,5 :5時，可以明顯提高缺氧損傷的HUVECs的存活率(P〈 0·01)〇
[0070]〈缺氧HUVECs中活性氧含量〉
[0071]為了研究不同摩爾濃度配比的天麻素和薯蕷皂苷元的組合物對缺氧HUVECs中活 性氧(ROS)含量的影響，進行如下實驗：
[0072]使用全自動流式細胞分析儀檢測細胞內ROS的含量，操作方法如下：
[0073] (1)取第2~5代的!1爪^8，用0.05%胰蛋白酶/0.02^^0了厶消化計數后以6\105 個/孔接種于6孔板，于含10%FBS的DMEM/F12的培養基中培養12h，然后更換為無血清的培 養基繼續培養12h使細胞同步化。
[0074] (2)將細胞分為正常對照組(給予無血清的DMEM/F12培養液），模型組(給予無血清 的DMEM/F12培養液)和給藥組(給予天麻素 (Gas)和薯蕷皂苷元(Dio)的組合物，二者總共20 μΜ，稀釋液為無血清的DMEM/F12培養液）；給藥組按照摩爾濃度配比分組如下:Gas:Di 〇(10: 0)，Gas:Dio(9:l)，Gas:Dio(8:2)，Gas:Dio(7:3)，Gas:Dio(6:4)，Gas:Dio(5:5)，Gas:Dio (0:10)。正常對照組在CO2培養箱中培養;模型組于三氣培養箱（I % O2，5 % CO2，94 %N2)中培 養;給藥組于三氣培養箱（1 % 〇2，5 %⑶2，94 % N2)中培養。三組分別培養12h后，按活性氧檢 測試劑盒的說明書進行操作：
[0075]①按照1:1000用無血清培養基稀釋DCFH-DAU' ,7'-二氯熒光黃雙醋酸鹽），收集 細胞，將細胞懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，37 °C細胞培養箱內孵育20min，每隔3~5min顛倒 混勻，使探針和細胞充分接觸。
[0076]②用無血清細胞培養液洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。
[0077]③全自動流式細胞分析儀檢測細胞ROS含量。數據以X 土s表示，采用SPSS17.0統計 軟件進行分析。組間比較首先分析各組數據是否服從正態分布并檢驗方差齊性，如服從正 態分布且方差齊則進行One-Way ANOVA Dunnett t-test單側檢驗。如果方差不齊，進行對 數轉化后，再進行方差分析。
[0078] ROS包括O2'過氧化氫及羥化物等。DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細胞膜， 進入細胞后，在細胞內被酯酶水解為不能透過細胞膜的DCFH，細胞內的ROS可以將無熒光的 DCFH氧化為有熒光的DCF(二氯熒光素），通過檢測DCF的熒光，可定量測定細胞內ROS的水 平。不同摩爾濃度配比的天麻素和薯蕷皂苷元下的缺氧HUVECs中的活性氧(ROS)含量參見 圖2。由圖可知，缺氧12h后可刺激HUVECs產生大量R0S，與正常組相比具有顯著性差異(P〈 0.05)。細胞處于缺氧狀態時，天麻素和薯蕷皂苷元的7種比例均可以顯著減少缺氧細胞中 ROS 含量(Ρ〈0·01)。
[0079] 〈缺氧HUVECs凋亡的保護作用〉
[0080] 為了研究天麻素和薯蕷皂苷元的組合物對缺氧HUVECs凋亡的保護作用，進行如下 實驗：
[0081] (1)取對數生長期的HUVECs，消化計數后以3 X IO5個/孔接種于6孔板，于含10% FBS的DMEM/F12的培養基中培養12h，然后更換為無血清的培養基繼續培養12h使細胞同步 化。
[0082] (2)將細胞分為正常對照組(給予無血清的DMEM/F12培養液），模型組(給予無血清 的DMEM/F12培養液)和給藥組(給予天麻素(Gas)和薯蕷皂苷元(Dio)的組合物，二者總共20 μΜ，稀釋液為無血清的DMEM/F12培養液）；給藥組按照摩爾濃度配比分組如下:Gas:Di 〇(10: 0)，Gas:Dio(9:l)，Gas:Dio(8:2)，Gas:Dio(7:3)，Gas:Dio(6:4)，Gas:Dio(5:5)，Gas:Dio (0:10)。正常對照組在CO2培養箱中培養;模型組于三氣培養箱（I % O2，5 % CO2，94 %N2)中培 養;給藥組于三氣培養箱（1 % 〇2，5 % CO2，94 % N2)中培養。三組分別培養12h后，按Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒的說明書進行操作：
[0083]①把細胞培養液吸出至離心管內，PBS洗滌貼壁細胞一次，加入適量胰酶消化液消 化細胞。室溫孵育至輕輕吹打可以使貼壁細胞吹打下來時，吸除胰酶細胞消化液。
[0084]②加入步驟①中收集的細胞培養液，稍混勻，轉移到離心管內，1000 rpm離心5min， 棄上清，收集細胞，用PBS輕輕重懸細胞并計數。
[0085] ③取重懸的細胞，1000 rpm離心5min，棄上清，加入195yL Annexin V-FITC結合液 輕輕重懸細胞。
[0086]④加入5yL Annexin V-FITC，輕輕混勻。
[0087] ⑤加入IOyL碘化丙啶染色液，輕輕混勻。
[0088] ⑥室溫(20-25。〇避光孵育10~2011^11，隨后置于冰浴中。
[0089] ⑦隨即進行流式細胞儀檢測，Annexin V-FITC為綠色熒光，碘化丙啶(PI)為紅色 熒光。
[0090] ⑧結果判斷:AnnexinV-FITC(-)PK-)正常細胞，Annexin V-FITC(-)PI( + )機械損 傷細胞，AnnexinV-FITC( + )PI( + )早期凋亡細胞，AnnexinV-FITC( + )PI(_)晚期凋亡和壞死 細胞。
[0091] 實驗結果參見圖3。由圖可知，與正常組細胞相比，模型組正常細胞的比例顯著降 低，早凋和晚凋、壞死細胞的比例顯著增加(P〈〇.05)。給予天麻素(Gas)和薯蕷皂苷元(Dio) 的組合物后，正常細胞的比例由59.17%增加到68.80% (P〈0.001);早期凋亡細胞比例由 17.97 %降低到14.23% (P〈0.05)，晚期凋亡和壞死的細胞比例由21.8%下降到16.3% (P〈 ο.οοι)〇
[0092] 〈缺氧HUVECs蛋白表達〉
[0093]為了研究天麻素和薯蕷皂苷元的組合物對缺氧HUVECs蛋白表達的影響，進行如下 實驗：
[0094] (I)HUVECs全蛋白樣品制備
[0095] 使用第2代至第5代HUVECs接種于25cm2培養瓶，10%FBS的DMEM/F12的完全培養基 于37 °C、5 % CO2的培養箱中培養，培養12h后，更換為無血清的DMEM/F12的培養基繼續培養 12h使細胞生長同步化。將細胞分為正常對照組（給予無血清的DMEM/F12培養液），模型組 (給予無血清的DMEM/F12培養液）和給藥組（給予天麻素(Gas)和薯蕷皂苷元(Dio)的組合 物，二者總共20μΜ，稀釋液為無血清的DMEM/F12培養液）；給藥組按照摩爾濃度配比分組如 下：Gas:Dio(10:0)，Gas:Dio(9:1)，Gas:Dio(8:2)，Gas:Dio(7:3)，Gas:Dio(6:4)，Gas:Dio (5 : 5)，Gas : Dio(0 :10)。棄培養液，正常對照組在⑶2培養箱中培養;模型組于三氣培養箱 (1%〇2,5%0)2,94%吣）中培養 ；給藥組于三氣培養箱（1%02,5%邙2,94%吣）中培養。三組 分別培養12h后，棄培養基，用0.05 %胰蛋白酶/0.02 %EDTA消化液消化收集細胞至離心管， 1000 rpm離心5min，棄上清，PBS重懸細胞，將細胞移至1.5mL離心管，1000 rpm離心5min，棄上 清，以細胞數量I X IO7加入ImL裂解液，輕輕吹打充分重懸細胞，冰上裂解20min，13000rpm 離心20min，收集上清液，即HUVECs全蛋白樣品，-20 °C儲存，待測。
[0096] (2)western blot實驗
[0097] ①根據目的蛋白的分子量，配置8%分離膠，灌膠至玻璃板的2/3處，然后膠上加一 層水封膠，靜置，當水和膠之間有一條折射線時，膠已充分聚合，倒去上層水，用吸水紙將水 吸干。配置5%的濃縮膠，將剩余空間灌滿，插入梳子，靜置待膠聚合。將聚合后的膠放入電 泳槽，加入電泳緩沖液。
[0098]②拔掉梳子后，在加樣孔中分別加入待檢測蛋白樣品（15yg/孔）。
[00"] ③電轉條件:濃縮膠恒壓90V，約20min;分離膠恒壓160V，通過預染蛋白marker來 確定電泳停止時間。
[0100]④轉膜:濕轉法，轉膜條件為，300mA恒流;0.45μπι孔徑PVDF膜，轉膜時間IOmin。轉 膜完成后麗春紅染色試劑對膜進行染色，觀察轉膜效果。
[0101]⑤封閉：將膜完全浸沒于3%BSA-TBST中，水平搖床孵育30min。
[0102] ⑥一抗孵育：3%BSA_TBST稀釋一抗，HIF-Ia抗體（1:1000)，eN0S抗體（1:1000)， iNOS抗體（I: 1000)，VEGF抗體（I :2000) ,β-actin抗體(1:10000)4°C水平搖床孵育過夜。次 日洗膜，TBST洗5次，每次3min。
[0103] ⑦二抗孵育：5%脫脂奶粉-TBST稀釋二抗，山羊抗兔IgG(H+L)HRP(l:10000)，室溫 孵育40min。洗膜，TBST洗6次，每次3min。
[0104] ⑧顯影與定影:ECL滴加到膜的蛋白面，反應3min;膠片曝光：IOs~5min(曝光時間 隨不同光強度而調整），顯影2min，定影。
[0105] ⑨圖像分析：圖片掃描后，用凝膠成像系統ver. 4.00(上海天能科技有限公司， Tanon 2500全自動數碼凝膠成像分析系統）軟件對圖像進行分析。數據以X士s表示，采用 SPSS17.0統計軟件進行分析。組間比較首先分析各組數據是否服從正態分布并檢驗方差齊 性，如服從正態分布且方差齊則進行One-Way ANOVA Dunnett t-test單側檢驗。如果方差 不齊，進行對數轉化后，再進行方差分析。
[0106] 實驗結果參見圖4~7。由圖可知，與空白組相比，模型組HUVECs的VEGF增加，無顯 著性差異，HIF-IcuiNOS的表達顯著增加，eNOS的表達顯著減少(P〈0.05)，給予天麻素(Gas) 和薯蕷皂苷元(Dio)的組合物后，VEGF、HIF-la、iNOS的表達顯著減少，eNOS的表達顯著增加 (Ρ〈0·05)。
[0107] 由上述實驗結果可知，本發明的天麻素與薯蕷皂苷元的組合物可以降低缺氧 HUVECs早期凋亡和晚期凋亡細胞的比例，增加正常細胞的比例；尤其是當天麻素與薯蕷皂 苷元的比例8:2時，可以顯著降低缺氧HUVECs早期凋亡和晚期凋亡細胞的比例，增加正常細 胞的比例。氧化應激在中樞神經系統退行性疾病的病理進程中發揮著重要的作用，缺氧導 致的氧化還原失衡會誘導內源性ROS(包括O 2'過氧化氫及羥化物等）的產生，一旦體內過 氧化物清除系統的清除能力低于ROS的產生速度，ROS的堆積會導致細胞毒性，誘導細胞凋 亡或退化。eNOS正常狀態下僅產生少量的Ν0,可調節神經系統的功能；當細胞處于缺氧狀態 時，iNOS的表達增加，產生大量NO，誘導VEGF的表達，最終導致血管新生。HIF-Ia作為血管生 成的刺激因子，在缺氧條件下表達顯著增加，血管生成增加，可部分恢復缺血部位的供血情 況，在缺氧適應方面發揮重要作用，而HIF-Ia-旦過度表達，會導致血管生成過度增加，不 利于缺氧的恢復，對病理性部位造成進一步損傷。在給予本發明的組合物后，HIF-Ia和VEGF 表達降低，表明其能夠有效控制血管新生，避免血管新生過度造成的不良影響;本發明的組 合物可以降低缺氧HUVECs中iNOS的表達，增加 eNOS的表達，使二者趨于正常水平，表明本發 明的組合物能夠通過調控氧化應激水平，降低細胞內ROS的含量，使細胞氧化還原處于平衡 狀態。因此，本發明的組合物可以降低缺氧HUVECs的凋亡，控制缺氧造成的血管新生，并且 通過調控氧化應激，使缺氧細胞的氧化還原恢復正常水平。
[0108] 實施例1
[0109] 將23.5g天麻素、8.5g薯蕷皂苷元、818g淀粉、100g微晶纖維素和50g羧甲基淀粉鈉 混合后，于壓片機上壓片為5000個片劑，每片藥品含有4.7mg天麻素、1.7mg薯蕷皂苷元。 [0110] 實施例2 將20g天麻素、12g薯蕷皂苷元、818g淀粉、100g微晶纖維素和50g羧甲基淀粉鈉混 合后，于壓片機上壓片為5000個片劑，每片藥品含有4mg天麻素、Img薯蕷皂苷元。
[0112] 實施例3
[0113]將16g天麻素、16g薯蕷皂苷元、818g淀粉、100g微晶纖維素和50g羧甲基淀粉鈉混 合后，于壓片機上壓片為5000個片劑，每片藥品含有3.2mg天麻素、3.2mg薯蕷皂苷元。
[0114]本發明并不限于上述實施方式，在不背離本發明的實質內容的情況下，本領域技 術人員可以想到的任何變形、改進、替換均落入本發明的范圍。
【主權項】
1. 一種血管保護藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物的活性成分僅為天麻素 和薯蕷皂苷元，所述天麻素和薯蕷皂苷元的摩爾比為10~6:1~4。2. 根據權利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述天麻素和薯蕷皂苷元的摩爾比 為10~7:1~3〇3. 根據權利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述天麻素和薯蕷皂苷元的摩爾比 為 8:2〇4. 一種血管保護藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物包括摩爾比為10~6:1~ 4的天麻素和薯蕷皂苷元。5. 根據權利要求4所述的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物包括摩爾比為10 ~7:1~3的天麻素和薯蕷皂苷元。6. 根據權利要求4所述的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物包括摩爾比為8: 2的天麻素和薯蕷皂苷元。7. -種血管保護藥物制劑，其特征在于，所述藥物制劑含有根據權利要求1~6任一項 所述的藥物組合物和藥學上可接受的輔料，每單位劑量的藥物制劑中包括2~10mg天麻素 和0.1~5mg薯截阜苷元。8. 根據權利要求1~6任一項所述的藥物組合物在制備血管保護藥物制劑中的用途。9. 根據權利要求8所述的用途，其特征在于，所述的血管保護劑用于在缺氧狀態下控制 血管新生。10. 根據權利要求8所述的用途，其特征在于，所述的血管保護劑通過降低缺氧誘導因 子HIF-la和血管內皮生長因子VEGF的表達來控制血管新生。
【文檔編號】A61K31/7034GK106074581SQ201610515787
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月1日
【發明人】李志勇, 葉田園, 李彥文
【申請人】中央民族大學