,用來檢測基因修飾的TCR表達水平。具體流程如下，首先細胞經過 FACS染色液(PBS containing 2 %FBS)洗滌兩次，然后加入0 · 2ml (106/ml)于流式細胞管 中，于4°C孵育30分鐘，然后洗滌兩次。死細胞通過樣本上機前加入20μ1 PI(15μg/ml propidium iodide) (Sigma-Aldrich, Saint Louis，M0)以及細胞亞群的劃分來實現分離的 目的。流式數據通過FlowJoS. 1.1進行上機后處理分析。
[0092] 荷瘤鼠模型的建立，本實驗所涉及的方法如下：選擇雌性pmel小鼠（6-8周，每組7 只小鼠）進行顱內腫瘤接種（ICKB16F10-MART-1腫瘤細胞通過含有0.02%EDTA的0.25%胰 酶消化，并用含有血清的培養液洗滌一次來終止胰酶的反應，然后用PBS洗滌兩次。腫瘤細 胞最終以1:1的體積與methylcellulose in zinc option medium混合，5000個細胞稀釋在 5μ1 液體中上樣到 250-μ 1 syringe (Ham i lton, Reno, NV)，選用 25-gauge 針頭。應用 Quitessential Stereotaxic Injector System(Stoelting Co.Wood Dale，IL)注身才到小 鼠的右側腦caudate核中。接種腫瘤細胞5天后，小鼠接受全身5Gy的射線照射。第2天，小鼠 皮下接受0.5-1X 106DC疫苗，或者通過尾靜脈IV回輸IX 107經過序貫轉導anti-MART-1TCR、IL-12/野生型CD107a或IL-12/無信號肽CD107a慢病毒基因修飾的T細胞。鼠的T細胞 取自小鼠的脾臟細胞，利用1 〇ug/ml的刀豆蛋白（Con A)在IL-2 (51U/m 1)存在的條件下活 化;第2天，用慢病毒載體轉導T細胞，然后繼續培養6天，收集細胞，通過小鼠尾靜脈注射T細 胞。DC組小鼠的DC細胞取自小鼠的骨髓細胞，經過體外誘導分化成熟8天，通過腹腔接種。然 后每天記錄小鼠的死亡情況，記錄生長曲線并通過Prism繪圖軟件制圖。星號表示該實驗組 與其它組比較，P〈〇. 001。
[0093] 實施例1融合基因的構建
[0094]融合基因由Invitrogen公司合成，融合基因的長度及序列通過1%的瓊脂糖電泳 及測序證實。
[0095] 構建獲得的IL-12/CD107a融合基因系列的結構如SEQ ID N0. :1、3所示，所編碼的 融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.:2,4所示。
[0096]實施例2慢病毒表達載體的構建
[0097]采用通用方法中"慢病毒載體的構建及T細胞的基因修飾"所述的方法:體外低代 DMEM(含10%的FBS)培養基培養的人源化293T細胞經計數后，傳到15CM的培養皿中，培養皿 的底部經過poly-D-Lysine處理，每個培養皿中鋪20X 106細胞，第二天，每個轉染培養皿中 加入由DNA混合液和Lipofectamine的混合液:混合液的組成如下，取2ml Optimum I并加入 pLenti_MSCV(22 · 5ug)，pMD2 · G(7 · 5ug)，gag/pol (15ug)，pRev( 10ug)，混勾；同時取2ml Optimum I并加入Lipofectamine 160ul(Invitrogen)，混勾。把兩種混懸液混合，放置室溫 孵育5分鐘，然后均勻地滴加到培養皿中。48-72小時后，收獲含有基因工程載體的上清， 2000g離心去除細胞碎片，收集上清，并用0.45uM的濾膜過濾去除可能的污染，分裝并存放 于負80冰箱。根據不同的需要，收集的病毒上清可以進行50000g超速離心，得到更高濃度的 病毒載體。
[0098] 獲得的慢病毒表達載體分別命名為LV-hscIL-12/CD107a、LV-hSCIL-12/無信號肽 CD107a、LV-hscIL-12〇
[0099]實施例3表達IL-12/無信號肽⑶107a融合蛋白的T細胞的制備 [0100] 方法如下:CD3/⑶28磁珠或抗-⑶3抗體激活PBMC，第2天，利用慢病毒基因修飾T細 胞，簡要的方法如下:PBS緩沖液洗滌T細胞3次，按病毒滴度與T細胞的比例3:1加入適量的 慢病毒，2000Xg離心2h，6h后，加入100IU/ml IL-2繼續培養;于第5天進行第2次轉導，或聯 合共轉導。根據細胞生長情況進行分瓶，二周后，根據T細胞所修飾的基因通過流式細胞儀 進行檢查。
[0101]實施例4IL-12/CD107a系列慢病毒基因修飾的人抗腫瘤T細胞實現IL-12瞬時膜表 達
[0102] 在本實施例中，構建了持續性分泌LVV-hscIL-12、hscIL-12/CD107和hscIL-12/無 分泌肽IL-12的慢病毒載體(結構如圖2.所示），其中IL-12基因與⑶107a基因通過氨基酸肽 段SGSG鏈接，所述慢病毒為第三代慢病毒載體，啟動子為MSCV。該載體的5 '及3 ' LTR( long terminal repeat)被改造成SIN-LTR(self-inactivating-LTR)，以降低慢病毒重組的機 率，增強安全性能。
[0103] 為了明確IL_12/CD107a融合蛋白系列在抗腫瘤T細胞的表達情況，依次對T細胞轉 導了抗腫瘤TCR及IL-12/CD107a融合蛋白系列，抗腫瘤T細胞體外培養14天后與腫瘤細胞 526、938共培養。
[0104] 結果觀察到了 IL-12/⑶107a系列的腫瘤抗原反應性的瞬時膜表達的表型，同時也 進一步證實了IL-12/⑶107a可以通過⑶107a的抗原反應性的膜迀移從而實現IL-12膜表達 的理論推測。其中無信號肽⑶107a顯示出高表達水平，可能與IL-12/⑶107a在胞漿內的加 工過程而導致的部分分泌片切割有關。
[0105]實施例5慢病毒載體IL-12/CD107a系列轉導的T細胞與腫瘤共培養可以增強IFNy 的表達
[0106] 在本發明中，為了降低IL-12釋放誘導產生的系統性細胞毒性，構建了瞬時膜表達 的IL-12/CD107a融合蛋白載體系列。
[0107] 如圖3所示，對人的（物種）的T細胞依次轉導抗腫瘤TCR及IL-12/CD107a系列融合 蛋白14天后，與腫瘤細胞526及938共培養，24小時后，上清中IFN γ及IL-12表達水平通過 ELISA試劑盒檢測。
[0108] 結果顯示，持續性IL-12分泌組、IL-12/CD107a系列組較TCR基因修飾T細胞組比 較，可以顯著增強抗腫瘤T細胞與腫瘤的反應性，表現為顯著增強IFNy分泌的水平，P〈 0.001。
[0109] 同圖2中IL-12/CD107a膜表面可以檢測到一致，IL-12/CD107a不能從細胞膜上切 害J，因此混合培養的細胞上清中不能檢到IL-12的分泌。IL-12的表達只能在持續分泌IL-12 的組中檢測到。其它組同持續性分泌IL-12組比較，可以檢測到分泌的IL-12的水平顯著升 高，Ρ〈0·001。
[0110] 因此，這證實了 IL-12/⑶107a系列可以誘導瞬時的IL-12膜表達，并且表達僅限于 T細胞膜表面，不能分泌到培養的上清中，最大程度地降低了IL-12的分泌而導致的系統性 細胞毒性。
[0111] 實施例6慢病毒載體IL-12/無信號肽CD107a轉導的T細胞可以有效避免持續性分 泌IL-12造成的體外T細胞擴增的毒副作用
[0112] 在解決了腫瘤抗原反應性的IL-12膜瞬時表達的技術上和理論上的可行性及增強 抗腫瘤反應性的問題后，本實施例進一步觀察轉導該IL-12/CD107a融合蛋白系列對T細胞 體外擴增的影響。
[0113] 如圖4所示，對T細胞依次轉導抗腫瘤TCR及IL-12/CD107a融合蛋白系列14天后，各 組細胞與對照轉導組(T-cell)的擴增倍數比較，數據分析采用設定T-cell組的擴增倍數為 100%，其它各組的值系與T-cell組的比值。
[0114]結果表明，轉導持續分泌IL-12組較其它各組的擴增倍數顯著降低，p〈0.001。其 中，轉導hscIL-12/無信號肽融合蛋白組同TCR組比較擴增倍數相同，未見顯著差異。但是， 轉導hscIL-12/無信號肽⑶107a融合蛋白組的擴增倍數顯著高于轉導了 hscIL-12/CD107a 融合蛋白組。推測可能的原因是由于CD107a的信號肽在IL-12/CD107a融合蛋白在胞漿內加 工過程中導致的分泌肽部分切割，從而導致IL-12從融合蛋白上的斷裂，進而分泌而導致的 系統性細胞毒性。
[0115]實施例7慢病毒載體hscIL-12/CD107a系列轉導鼠 T細胞介導的細胞回輸治療顯著 延長荷瘤小鼠的生存
[0116] 在清楚了 IL_12/CD107a的腫瘤抗原反應性膜瞬時表達、腫瘤抗原反應的增效性及 體外擴增的基礎上，在本實施例中，進一步采用了臨床前荷瘤小鼠模型，觀測體內抑瘤效 應。方法如下：
[0117] 選擇雌性pmel小鼠（每組7只小鼠）通過B16F10細胞植入顱內（5000細胞/只）（IC)5 天，細胞回輸前1天小鼠接受5Gy全身放療。pme 1小鼠是轉基因小鼠，其T細胞通過轉基因修 飾穩定表達抗腫瘤TCR，可以識別B16F10細胞上的腫瘤抗原gplOO。（Overwi jk，Tsung et al.1998)鼠的T細胞取自小鼠的脾臟細胞，通過lOug/ml的刀豆蛋白（Con A)在IL-2(5IU/ ml)存在的條件下活化;第2天，用慢病毒載體轉導T細胞，然后繼續培養6天，收集細胞，通過 小鼠尾靜脈注射（IV) 5X 106個T細胞。DC組小鼠的DC細胞取自骨髓細胞，經過體外誘導分化 成熟8天，通過腹腔接種IX 106細胞。如圖5所示，DC和T細胞的各組說明見右邊標識。星號 (*)表示轉導IL-12該實驗組與其它組比較，p〈0.001;星號（**)表示轉導IL-12/無信號肽 ⑶107a組的生存期顯著優于IL-12/⑶107a組。其中持續分泌IL-12組表現為顯著的系統性 細胞毒性，小鼠于細胞回輸后4-7天全部死亡。
[0118] 討論
[0119] CD107a是一種表達于溶酶體上的跨膜蛋白，它的N-端位于溶酶體腔囊一側， (Eskelinen 2006)C-端是一小段肽段，朝向胞楽;一側，當抗腫瘤T細胞在識別腫瘤抗原時， 溶酶體與T細胞膜融合而發生T細胞或NK細胞的脫顆粒效應，即T細胞或NK細胞釋放效應分 子顆粒酶(Granzyme B)及穿孔素