專利名稱：制備流行性出血熱疫苗的方法
技術領域：
本發明涉及用于預防接種的流行性出血熱疫苗的制備方法，特別是應用長爪沙鼠腎細胞作培養基質制備單價、雙價和多價流行性出血熱疫苗的方法。
流行性出血熱(Epidemic hemorrhagic fever,EHF)作為一種疾病名稱，是中國的傳統稱謂。《中華人民共和國傳染病防治法》即使用此名稱。然而在各國各地區則有不同的名稱。韓國和朝鮮稱為朝鮮出血熱(KHF)，在俄羅斯遠東地區稱為出血性腎病腎炎(HNN)，在歐洲稱為流行性腎病(NE)。學術界建議規范命名為“腎綜合癥出血熱”(Hemorrhagic fever with renal syndrome,EFRS)。
流行性出血熱是一種以鼠為傳播媒介的自然疫源性疾病，其病原體已確認為病毒，屬布尼亞科的漢坦病毒屬。漢坦(Hanta)病毒分為四型(亞屬)Ⅰ型為漢灘型(Hantaan)，也稱姬鼠型、野鼠型；Ⅱ型為漢城型(Seoul)，也稱家鼠型；Ⅲ型為普馬拉型(Puumala)；Ⅳ型為希望山型(Prospective hili)。在中國發生的主要是Ⅰ型和Ⅱ型。發病地區常常是以某一型別為主，兩種型別同時存在的混合疫區。
流行性出血熱對人的健康和生命危害極大。然而至今尚缺少特異的治療手段。因此積極預防成為人類與流行性出血熱作斗爭的主要努力方向。而接種流行性出血熱疫苗是最簡便有效的預防措施。同時因為上述四個病毒型之間交叉免疫力十分微弱，一種病毒型制備的疫苗(稱為單價疫苗)只能預防一種型別的流行性出血熱，而在混合疫區還需要可以預防兩種或三種型別流行性出血熱的疫苗，即雙價和多價疫苗。
國內外對流行性出血熱疫苗的研制始于本世紀80年代初期。已經研制成功的有純化鼠腦疫苗和細胞培養疫苗。國外有日本、朝鮮、韓國等報告了研制流行性出血熱疫苗成功，但都是Ⅰ型(野鼠型)單價鼠腦滅活疫苗，且均沒有報告接種人體后產生中和抗體的情況。中國在八十年代后期曾組織多個單位分別研制流行性出血熱疫苗，但其性能質量還存在一些不能令人滿意的地方。中國專利公報所載“CN1076865A制備腎綜合癥出血熱疫苗的方法”和“CN 1109782A應用金黃地鼠腎原代細胞生產流行性出血熱疫苗的方法”公開了兩種使用不同病毒培養基質制備流行性出血熱疫苗的方法。
本發明的目的在于提供一種制備流行性出血熱疫苗的方法，特別是在病毒培養基質的選用上獨具特點。這種方法應當便于操作，容易控制質量，所得到的疫苗抗原性強。這種方法不但適用于制備漢坦(Hanta)病毒屬中任何一個型別(亞屬)病毒的單價疫苗，也能用于制備雙價和多價疫苗。
實現本發明目的的技術方案如下。
一．制備單價流行性出血熱疫苗選10-20天齡長爪沙鼠，無菌取腎，剪碎，置裝有玻璃珠的三角燒瓶中，用偏于堿性、含胰酶和卡那霉素的MEM液清洗，加腎重8-12倍量的胰酶溶液，置4℃左右進行消化。12-20小時后倒去胰酶，用MEM液洗滌。搖動三角瓶，使瓶內的玻璃珠撞擊組織塊，加MEM液，收集消化的細胞懸液。如此“搖動三角瓶-加MEM液-收集細胞懸液”重復進行2-4次。將收集的細胞懸液倒入PH7.0-PH7.4，含2-3％小牛血清的MEM生長液中，搖勻后分裝于大玻璃瓶中，置37℃溫室中旋轉培養，2-3天后換一次生長液，再培養2-3天，瓶壁上生長成單層細胞。
取上述生長良好的細胞瓶，倒出培養液，加入含有漢坦(Hanta)病毒屬中任何一種型別病毒的維持液，置35℃溫室中旋轉培養2-3天，倒去病毒液，用PH7.2的0.01MPBS液倒置沖洗，然后加入無牛血清的MEM液，置35℃溫室中旋轉培養4-6天，于超聲波清洗槽中超聲約10分鐘，合并液體，取樣測病毒滴度。
在病毒液中加入β-丙內酯和硫柳汞對病毒滅活。β-丙內酯的用量為收獲病毒量的三千分之一至五千分之一。硫柳汞的用量為收獲病毒量的萬分之一至三萬分之一。將滅活的病毒液搖勻后離心去除細胞碎片，取上清液即為疫苗原液。
在疫苗原液中按0.4mg-0.6mg/ml比例加入氫氧化鋁，按0.05-0.2％比例加入血白蛋白，即為疫苗半成品。經無菌試驗合格，進行分裝，即為成品。
以上方法可用于漢坦病毒(Hanta)族中任何成員(亞屬)病毒型制備相應的單價疫苗。
二．制備雙價或多價流行性出血熱疫苗在制備各型單價疫苗的基礎上，可以按任何組合制備雙價和三價疫苗。其方法是分別量取兩種型別的半成品疫苗，將其等量混合，進行分裝，即為該兩種型別的流行性出血熱雙價疫苗；將三種型別的半成品疫苗等量混合，進行分裝，即為該三種型別的流行性出血熱三價疫苗。
三．對疫苗進行純化對在滅活離心工序中制備得到的疫苗原液，用10萬分子量濾膜進行超濾濃縮50-200倍，濃縮液經Sepharose凝膠過濾和離子交換，將獲得具有抗原活性的液體稀釋至疫苗原液量的一半，進行殘余牛血清含量測定、抗原含量測定和無菌試驗，最后加入人血白蛋白和氫氧化鋁，即為相應的單價或多價流行性出血熱純化疫苗。
本發明流行性出血熱疫苗使用長爪沙鼠腎細胞作感染病毒的基質，較之使用金黃地鼠腎細胞，得到多項積極效果(1)細胞貼壁牢固，在去除牛血清時可以多次沖洗不出現細胞層脫落；(2)易于培養。使用2-3％小牛血清即可；(3)流行性出血熱病毒不使細胞發生病變；(4)流行性出血熱敏感，血凝抗原高。
以β-丙內酯作滅活劑的優點在于，不破壞流行性出血熱病毒的血凝素抗原。血凝素抗原是病毒膜抗原的主要成分，而病毒膜抗原是重要的保護性抗原。保護性抗原刺激產生保護性抗體。而使用福爾馬林作滅活劑是破壞病毒的血凝素抗原的。因此使用β-丙內酯作滅活劑所制備的疫苗，較之使用福爾馬林作滅活劑所制備的疫苗，其抗原性要強得多。
以下通過實施例對本發明作進一步說明。
實施例1制備Ⅰ型流行性出血熱疫苗一．制備細胞單層選15天齡長爪沙鼠，剪斷頸動脈放血致死，置0.2％新潔而滅消毒液中浸泡30分鐘，無菌取腎，剪碎，置裝有玻璃珠的三角燒瓶中，用PH8.0含0.125％胰酶和100單位/ml卡那霉素的MEM液(基礎培養液)清洗一次，再加腎重10倍量的胰酶溶液，置4℃進行消化。16小時后倒去胰酶，用MEM液洗滌一次。搖動三角瓶20次，加MEM液，收集消化的細胞懸液；再搖動三角瓶20次，加MEM液，收集細胞懸液；……如此重復三次后，將收集的細胞懸液倒入PH7.2含3％小牛血清的MEM生長液中，搖勻后分裝于15立升玻璃瓶中，每瓶約含15對腎的1500ml細胞懸液，置37℃溫室中旋轉培養，2天后換一次生長液，再培養3天，使細胞長成單層。
二．種毒培養病毒種選用浙江省衛生防疫站分離并保存的Ⅰ型流行性出血熱病毒株，代號為Z10。保存病毒的維持液為含2％小牛血清、100單位/ml卡那霉素，PH7.2的MEM液。
取上述步驟一制備的生長良好的細胞瓶，倒出培養液，加入含有Z10Ⅰ型病毒的維持液1500ml，置35℃溫室中旋轉培養2天，倒去病毒液，用PH7.2的0.01MPBS液倒置沖洗，每瓶約沖液體2000ml，然后加入1500ml無牛血清的MEM液，35℃溫室中旋轉培養5天，于超聲波清洗槽中超聲10分鐘，合并液體，取樣測病毒滴度。
三．滅活離心在病毒液中加入β-丙內酯和硫柳汞對病毒滅活。β-丙內酯的用量為收獲病毒量的四千分之一。硫柳汞的用量為收獲病毒量的二萬分之一。將滅活的病毒液搖勻后離心去除細胞碎片，取上清液即為疫苗原液。疫苗原液需進行無菌試驗、抗原量測定、殘余牛血清測定和安全試驗。各項試驗和測定均合格者，進入下一道工序。
四．加氫氧化鋁和人血白蛋白疫苗原液中按0.5mg/ml比例加入氫氧化鋁，按0.1％比例加人血白蛋白，即為疫苗半成品。經無菌試驗合格，進行分裝，每支1.1ml，即為成品。
成品疫苗液體需進行外觀檢查、無菌試驗、PH值測定、效力測定、防腐劑試驗、氫氧化鋁含量測定、毒性試驗、硫柳汞含量測定、吸附度試驗。以上檢測全部符和國家流行性出血熱疫苗制、檢規程要求，即為合格的流行性出血熱Ⅰ型滅活疫苗。
實施例2制備Ⅱ型流行性出血熱疫苗制備Ⅱ型流行性出血熱疫苗，在種毒培養時，病毒種選用浙江省衛生防疫站分離并保存的Ⅱ型流行性出血熱病毒株，代號為Z37。其余的工序步驟、所用材料、試驗檢測等均與實施例1“制備Ⅰ型流行性出血熱疫苗”的方法相同。
實施例3制備Ⅲ型流行性出血熱疫苗制備Ⅲ型流行性出血熱疫苗，在種毒培養時，病毒種選用Puumala 1 Ⅲ型流行性出血熱病毒株。其余的工序步驟、所用材料、試驗檢測等均與實施例1“制備Ⅰ型流行性出血熱疫苗”的方法相同。
實施例4制備“Ⅰ型+Ⅱ型”流行性出血熱雙價疫苗分別量取按實施例1制備的Ⅰ型半成品疫苗和按實施例2制得的Ⅱ型半成品疫苗，將其等量混合，進行分裝，每支1.1ml，即為成品“Ⅰ型+Ⅱ型”流行性出血熱雙價疫苗。成品雙價疫苗同樣按實施例1所述成品疫苗的檢測試驗項目、方法進行檢定，達到合格。
按本發明的方法制備的“Ⅰ型+Ⅱ型”雙價疫苗經實際應用，Ⅰ型和Ⅱ型病毒抗體陽轉率分別達到了90％和97％。
實施例5制備“Ⅰ型+Ⅲ型”流行性出血熱雙價疫苗分別量取按實施例1制備的Ⅰ型半成品疫苗和按實施例3制得的Ⅲ型半成品疫苗，將其等量混合，進行分裝，每支1.1ml，即為成品“Ⅰ型+Ⅲ型”流行性出血熱雙價疫苗。成品雙價疫苗同樣按實施例1所述成品疫苗的檢測試驗項目、方法進行檢定，達到合格。
實施例6制備“Ⅰ型+Ⅱ型+Ⅲ型”流行性出血熱多價疫苗分別量取按實施例1制備的Ⅰ型半成品疫苗、按實施例2制得的Ⅱ型半成品疫苗、按實施例3制得的Ⅲ型半成品疫苗，將三種半成品疫苗等量混合，進行分裝，每支1.1ml，即為成品“Ⅰ型+Ⅱ型+Ⅲ型”流行性出血熱多價疫苗。成品多價疫苗同樣按實施例1所述成品疫苗的檢測試驗項目、方法進行檢定，達到合格。
實施例7制備純化疫苗對上述實施例1-4在滅活離心工序中制備得到的疫苗原液，用10萬分子量濾膜進行超濾濃縮100倍，濃縮液經Sepharose凝膠過濾和離子交換，將獲得具有抗原活性的液體稀釋至疫苗原液量的一半，進行殘余牛血清含量測定、抗原含量測定和無菌試驗，最后加入人血白蛋白和氫氧化鋁，分裝每支1.1ml，即為單價或多價流行性出血熱純化疫苗成品。成品純化疫苗同樣按實施例1所述成品疫苗的檢測試驗項目、方法進行檢定，達到合格。
權利要求
1．一種制備流行性出血熱疫苗的方法，其特征在于，采用長爪沙鼠的腎細胞作貼壁培養，選取漢坦(Hanta)病毒屬中任何一種型別的病毒株感染長爪沙鼠腎細胞，經培養后加入β-丙內酯和硫柳汞對病毒滅活，離心去除細胞碎片，再加入氫氧化鋁和人血白蛋白，成為單價流行性出血熱疫苗。
2．根據權利要求1所述的制備流行性出血熱疫苗的方法，其特征在于，將兩種不同型別單價疫苗半成品等量混合，配制分裝，成為雙價流行性出血熱疫苗。
3．根據權利要求1所述的制備流行性出血熱疫苗的方法，其特征在于，將三種不同型別單價疫苗半成品等量混合，配制分裝，成為多價流行性出血熱疫苗。
4．根據權利要求1所述的制備流行性出血熱疫苗的方法，其特征在于，在對長爪沙鼠的腎細胞作貼壁培養時使用PH7.0-PH7.4，含2-3％小牛血清的MEM生長液。
5．根據權利要求1所述的制備流行性出血熱疫苗的方法，其特征在于，用于病毒滅活的β-丙內酯的用量為收獲病毒量的三千分之一至五千分之一，硫柳汞的用量為收獲病毒量的萬分之一至三萬分之一。
6．根據權利要求1所述的制備流行性出血熱疫苗的方法。其特征在于。對在滅活離心工序中制備得到的疫苗原液，用10萬分子量濾膜進行超濾濃縮50-200倍，濃縮液經Sepharose凝膠過濾和離子交換，將獲得具有抗原活性的液體稀釋至疫苗原液量的一半，進行殘余牛血清含量測定、抗原含量測定和無菌試驗，再加入人血白蛋白和氧氧化鋁，成為純化疫苗。
7．根據權利要求1所述的制備流行性出血熱疫苗的方法，其特征在于，在疫苗原液中加入氫氧化鋁的比例為0.4mg-0.6mg/ml，加入人血白蛋白的比例為0.05-0.2％。
全文摘要
一種采用長爪沙鼠的腎細胞作病毒培養基質制備流行性出血熱疫苗的方法,適用于漢坦(Hanta)病毒屬中任何一種型別的病毒株。培養后加入β－丙內酯和硫柳汞對病毒滅活,離心去除細胞碎片,再加入氫氧化鋁和人血白蛋白,成為單價流行性出血熱疫苗。將兩種或者三種不同型別單價疫苗半成品等量混合,配制分裝,成為雙價或者多價流行性出血熱疫苗。
文檔編號A61K39/12GK1235847SQ9810186
公開日1999年11月24日 申請日期1998年5月20日 優先權日1998年5月20日
發明者朱智勇, 唐漢英, 李巖金, 陸群英, 翁景清, 李敏紅, 姚蘋蘋, 傅桂明 申請人:杭州天元生物藥業公司