-A中：1為CDMw基因 PCR擴增條帶，與預測大小一致 (1056bp) ;2為GH基因 PCR擴增條帶，與預測大小一致（786bp)。圖1-B中：3為pET29a-CDMw 重組質粒；4為pET29a-CDMw重組質粒酶切鑒定結果，從上到下大小（bp)分別為目的片段 CDMw和酶切后載體pET29a ;5為pET29a-CDMm-GH重組質粒；6為pET29a-CDMm-GH重組質粒 酶切鑒定結果，從上到下大小（bp)分別為目的片段GH、CDMm以及酶切后載體pET29a ;
[0026] 圖2是Cl咖啡因脫甲基化酶CDMw重組后的SDS-PAGE電泳圖譜；
[0027] 其中，圖2-A是CDMw基因重組表達結果，圖2-B是CDMm基因表達條件優化后重組 表達結果，圖2-C是CDMm基因與GH基因串聯重組表達結果；圖2中M2為蛋白marker圖， 從上到下大小（kD)分別為 97. 2、66· 4、44· 3、29· 0、21· 0、14· 3 ;圖 2-A 中：1 為 pET29a-CDMw 大腸桿菌重組菌株22度誘導后裂解上清；2為pET29a-CDMw大腸桿菌重組菌株20度誘導 后裂解上清；3為對應包涵體沉淀，目的蛋白與預測大小一致（約為38. 6kD);圖2-B中： 4為pET29a-CDMm大腸桿菌重組菌株誘導前裂解上清；5為pET29a-CDMm大腸桿菌重組菌 株誘導后裂解上清；6為對應包涵體沉淀；圖2-C中：7為不含重組質粒的大腸桿菌重組菌 株誘導后裂解上清；8為pET29a-CDMm-GH大腸桿菌重組菌株22度誘導后裂解上清；9為 pET29a-CDMm-GH大腸桿菌重組菌株20度誘導后裂解上清，與預測大小一致（約分別為 38. 6、28. 8kD);
[0028] 圖3是本發明的生物法轉化可可堿技術原理圖；
[0029] 其中，矩形框代表大腸桿菌菌體，底物咖啡因以及產物可可堿通過進出菌體方式 實現催化轉化；圖中所示的CDM可以為CDMw (野生型）或CDMm(突變體）；
[0030] 圖4是不同工程菌株反應16h時的可可堿轉化率；
[0031] 圖5是不同參數對咖啡因的轉化率影響；
[0032] 其中，正常1反應的反應體系為：反應時間2h，反應體系參見實施例2,實施例5， 其余a、b、c柱形圖分別顯示欠缺組分；
[0033] 圖6是pET29a-CDMm-GH菌株搖瓶小試反應，不同時間點反應液適當稀釋后HPLC 圖譜；
[0034] 其中，圖6中咖啡因的保留時間為8. 48-8. 5分鐘，可可堿的保留時間為6. 16-6. 18 分鐘；圖6-A為反應開始0. 5h ;圖6-B為反應16h時取樣；此時未見底物咖啡因已經完全轉 化生成可可堿；圖6-A :反應起始時前端5. 030分鐘大峰主要成分為前期添加少量NADH ;圖 6-B :后期16h圖譜中5. 437分鐘峰為全細胞催化后殘余蛋白成分或雜質，其大小隨催化作 用時間延長而增大；該物質非咖啡因代謝來源。前期實驗中，對照不含底物空菌中也存在此 峰（未顯示）；
[0035] 圖7是pET29a-CDMm-GH菌株發酵罐發酵，不同時間點底物產物變化圖譜。
【具體實施方式】
[0036] 以下將結合附圖，通過【具體實施方式】對本發明進行詳細描述。
[0037] 實施例中，未注明具體條件的實驗方法，通常按常規條件，如《分子克隆實驗指南》 (J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾著，黃培堂，汪嘉璽，朱厚礎，等譯.第3版，北京：科學出版社， 2002)中所述的方法進行。
[0038] 本發明利用基因工程技術，將全基因合成的C1咖啡因脫甲基化酶基因 CDMw通 過基因重組技術克隆到表達載體并將相應的表達質粒轉化到相應的宿主菌如大腸桿菌 BL21 (DE3)，對表達蛋白的重組細胞進行蛋白電泳以及活性測定。進一步通過易錯PCR篩選 形式獲得高活性、高表達量CDMm序列，通過單一或者與輔酶循環用酶GH基因串聯表達方式 耦合大腸桿菌自身電子傳遞蛋白構建基因工程重組菌株。結果顯示，本發明的重組基因工 程大腸桿菌可催化底物咖啡因專一性反應生成可可堿，具有較高的轉化率。
[0039] 其中，C1咖啡因脫甲基化酶CDMw的核酸序列（序列1)如下所示：
[0041] C1咖啡因脫甲基化酶突變體CDMm的氨基酸序列（序列2)如下所示：
[0043] 實施例1
[0044] Cl咖啡因脫甲基化酶野生型（CDMw)編碼基因的構建、表達研究
[0045] -、引物設計
[0046] 根據C1咖啡因脫甲基化酶全基因序列（優化后，見序列1)，以及大腸桿菌的表達 載體pET-29a特點分別設計了初始構建引物：
[0047] 引物 F :5' -CGCCATATGGAACAGACCATCAACAATAACG-3' (帶下劃線的堿基為 Ndel 識 別位點）；
[0048] 引物 R : 5 ' -CGCGGATCCTTACGTGTAGGAGCGGTCTGATTC-3 '（帶下劃線的堿基為 BamH I識別位點）；
[0049] 二、CDMw的構建、表達與菌體收集
[0050] 分別以F/R為引物，質粒PUC 57-CDMw (南京金斯瑞生物科技有限公司合成）為模 板，擴增CDMw基因，其中PCR所用聚合酶及相應擴增緩沖液、dNTP溶液均由TaKaRa公司購 得。
[0051] PCR 反應體系為：10XBuffer(Mg2+)5yL，dNTP(2. 5mM each)4yL，弓| 物 F (10 μ Μ) 2 μ L，引物 R(10 μ Μ) 2 μ L，模板 2 μ L，ddH20 34. 5 μ L，Pyrobest DNA polymerase 0· 5 yL 總體積 50 yL ;PCR 反應條件為：1、95°C 5min ;2、95°C 30s，60°C 30s，72°C lmin，30 個 循環；3、72°C 5min。
[0052] 結果如圖1所示，經電泳擴增到一條目的大小為lOOObp左右的條帶，CDMw基因全 長（1056bp)，PCR擴增專一性良好（如圖1-A所示），利用瓊脂糖切膠回收試劑盒回收該PCR 產物片段后，采用限制性內切酶Ndel和BamH I將PCR擴增產物定向連接入大腸桿菌表達載 體pET-29a(購自Novagen公司）中相應的位點，連接產物轉化到感受態E. coli ToplO (購 自全式金公司）中，然后在含卡那霉素抗性（50 μ g/mL)LB平板（胰化蛋白胨10g/L ;酵母 提取物5g/L ;NaC110g/L ;瓊脂粉15g/L)培養基上篩選陽性克隆，采用引物F/R(10 μΜ)，菌 落PCR以及酶切鑒定的方法驗證篩選的陽性克隆（轉化子）（如圖1-Β所示），獲得重組表 達質粒命名為pET29a-CDMw，將測序正確的陽性轉化子轉入E. coli BL21 (DE3)(購自全式 金公司）中。將E. coli BL21 (DE3)pET29a-CDMw置于LB液體培養基（胰化蛋白胨10g/L ; 酵母提取物58/1;似(：11(^/1)中37°(：、200印111震蕩培養，至菌密度00600為0.6-0.8左右 時，加入終濃度為0. 2mM的IPTG，10uM ?6(：13于不同溫度誘導18小時，表達C1咖啡因脫甲 基化酶CDMw(如圖2-A所示）分裝0. 3g/管，參見實施例2用于活性測定。
[0053] 實施例2
[0054] HPLC對咖啡因與可可堿定量分析方法的建立以及小試活性檢測體系建立
[0055] -、液相檢測條件
[0056] 實驗儀器：Agilent 1200型HPLC，紫外檢測器。色譜柱：大連依利特Hypersil 0DS24. 6*250mm*5um，柱溫：28°C ;檢測波長：274nm ;流速：0. 5ml/min ;進樣量：10ul ;流動 相A :0. 1%的三乙胺用H3P0J1 pH = 2. 5 ;流動相B :乙腈；等度洗脫：