越南槐內生細菌b22在防治三七黑斑病中的應用
【技術領域】
[00011本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種越南槐內生細菌B22在防治三七黑斑病 中的應用。
【背景技術】
[0002] 現代農業對植物病害的防治過度依賴于化學農藥的使用，大量化學農藥的施放不 僅對生態環境具有長期的破壞作用，也引起農產品品質下降，農藥殘留超標、病原菌的耐藥 性以及對人畜有害等諸多問題。尋找更為安全、有效的病害防治方法具有重大的意義，利用 生物的方法來防治植物病害可以有效解決上述問題。
[0003] 三七(Panax notoginseng F.H.chen)又名田七、金不換等，具有顯著的活血化瘀、 消腫定痛功效，是一種中國傳統名貴藥材。以三七為主要原料制成的中成藥如"云南白藥" 和"片仔癀"等廣為流傳。近年來，對三七原材料的需求日益增長。但是栽培過程中的真菌病 害嚴重影響了三七生長。目前，在三七種植上，防治真菌病害過度依賴化學農藥，大量化學 農藥的使用不僅影響了三七的品質，也造成了三七藥材的大量農藥殘留。
[0004] 三七黑斑病能侵染三七植株和地下根系，以莖、葉、花軸受害較重，根部感染后呈 褐色濕腐狀，四季均可發生，三七園棚內溫度高、濕度大，施肥不當都有可能使病害蔓延加 重，一般常年發病率在5%-20%之間，嚴重時高達60%以上。其癥狀大都由三七黑斑病菌 Alternaria panax Whetzel(簡稱A.panax)危害所致。
[0005] 這個真菌病害是造成多年來三七產品質量和產量下降的主要原因之一。在廣西三 七的傳統道地產區，由于低海拔及高溫多濕的氣象條件，這種病害往往是同時發生的，造成 了三七的大量減產甚至絕收，給種植戶帶來了巨大的經濟損失。為了控制這個真菌病害，大 量的化學農藥被使用，造成了三七產品的大量農藥殘留，嚴重的污染了環境，大大的威脅了 人們的健康。因此，開展生物防治三七真菌病害對三七產業的可持續發展是非常迫切和必 要的。為此篩選出能同時拮抗這種病害的拮抗菌具有重大意義，篩選進而開發利用拮抗菌 也是有效控制三七真菌病害最具發展潛力的防治措施之一。
[0006] 公開于該【背景技術】部分的信息僅僅旨在增加對本發明的總體背景的理解，而不應 當被視為承認或以任何形式暗示該信息構成已為本領域一般技術人員所公知的現有技術。

【發明內容】

[0007] 本發明的目的在于提供一種越南槐內生細菌B22在防治三七黑斑病中的應用，從 而能有效的防治三七種植過程中出現的三七黑斑病，從而提高三七的產量以及質量。
[0008] 為實現上述目的，本發明提供的技術方案如下：
[0009] -種越南槐內生細菌B22,越南槐內生菌B22的分類命名為微桿菌 (Microbacterium sp.)B22,菌株的16S rDNA基因序列表如SEQ ID NO. 1所述，保藏單位：中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址:北京市朝陽區北辰西路1號院3 號中國科學院微生物研究所，保藏日期:2015年09月29日，保藏號:CGMCC No. 11463。
[0010]優選的是，所述越南槐內生細菌B22代謝產物的制備方法為：將越南槐內生細菌 B22接種于NB液體培養基中，置于溫度為28°C、轉速為130r/min條件下發酵培養10天，所得 發酵物經減壓濃縮干燥后，加入發酵物2倍的甲醇并超聲40min，然后離心，取上清液減壓濃 縮得到菌株發酵物的甲醇粗提物，即為越南槐內生細菌B22代謝產物。
[0011]優選的是，所述越南槐內生細菌B22接種于含1000ml NB液體培養基。
[00?2]優選的是，所述的NB液體培養基含牛肉浸膏3g，酵母膏lg，蛋白胨5g，鹿糖10g，培 養基pH值為7.0。
[0013]如上述制備所得越南槐內生細菌B22的代謝產物在防治三七黑斑病中的應用。
[0014] 與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：
[0015] 本發明首次從藥用植物越南槐的根中分離篩選到一株越南槐內生細菌 (Burkholderia sp.)B22,該菌對三七黑斑病菌具有很強的抑制作用，為三七真菌病害的生 物防治領域帶來廣闊的應用前景。
【附圖說明】
[0016] 圖1是本發明越南槐內生細菌B22與三七黑斑病的平板對峙培養，其中F為三七黑 斑病菌(Alternaria panax Whetzel)，a為空白對照，b為實驗組。
[0017]圖2是本發明越南槐內生細菌B22菌株形態特征，其中，al為菌落形態，b 1為菌體形 ??τ 〇
[0018]圖3為越南槐內生細菌Β22菌株基于16S rDNA基因序列構建的系統發育樹。
[0019]圖4是根據本發明菌株越南槐內生細菌B22的代謝產物對三七黑斑病菌的菌絲生 長的抑制效果;其中第1、第5個為空白對照即不含藥的PDA平板;第2、第3、第4個為陽性對照 多菌靈粉劑;第6、第7、第8為B22菌株的代謝產物，且濃度分別為2mg/ml，4mg/ml，8mg/ml; L 為三七黑斑病菌Alternaria panax Whetz〇
【具體實施方式】
[0020] 下面結合【具體實施方式】進行詳細描述，但應當理解本發明的保護范圍并不受具體 實施方式的限制。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施 例中所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。甲醇為市購分析純甲醇。 2X TagMasterMix購自寶生物工程有限公司（Takara)，Primer_l、Primer_2由華大基因合 成。
[0021] 實施例1
[0022]菌株的分離、篩選及鑒定 [0023] 一、菌株的分離
[0024]供試材料:采自廣西天等縣石灰巖地區的野生越南槐。
[0025]供試菌株:由廣西大學植物病理研究所提供。
[0026]培養基：1000ml NA培養基：牛肉浸膏3g，酵母膏lg，蛋白胨5g，鹿糖10g，瓊脂15g， pH 7.0〇
[0027] 表面消毒:將長為6-8cm、寬為l-2cm新鮮健康的越南槐根用流水沖洗30min以沖干 凈泥沙，然后將洗凈的越南槐根用無菌水漂洗2次，風干表面水分，移到超凈工作臺，在無菌 條件下，將越南槐根用體積濃度為75%乙醇浸泡lmin，無菌水漂洗2次，次氯酸鈉(有效氯 1 % )浸泡2min，無菌水洗3次，無菌吸水紙吸干表面備用。
[0028]菌株的分離、純化:表面消毒好的越南槐根，無菌條件下，用無菌木片刮去表皮，用 無菌枝剪剪去越南槐根的兩端，余下部分用無菌小刀和無菌鑷子分開木質部和韌皮部，分 別取0.5cm長的組織塊，用無菌枝剪剪碎并加無菌水研磨，研磨充分后加無菌水定容至5ml 并靜置lOmin，取0.5ml上清液梯度稀釋10~105倍，分別取100yL稀釋液涂布到ΝΑ平板上，每 個稀釋濃度重復3次，取最后一次漂洗液涂布在ΝΑ平板上，作為陰性對照。ΝΑ平板置于培養 箱28°C恒溫培養24~96h，挑取不同形態菌落反復劃線純化，將純化的菌株，即越南槐內生 細菌用20 %甘油保存。
[0029]將分離到的越南槐內生細菌接種于LA平板上，28°C下培養24h后待用。將三七黑斑 病菌接種于PDA平板，28°C下培養3天后待用。
[0030]二、篩選
[0031 ]采用平板對峙法對供試越南槐內生細菌進行菌體抑菌活性的初篩。
[0032]首先，無菌條件下，用滅菌打孔器將三七黑斑病菌制成6mm菌餅;在處理中，將三七 黑斑病菌菌餅轉接到含NA的培養皿中央，然后在距離菌餅2cm的位置，將分離到的越南槐內 生細菌菌株接上一條細菌線，每株內生細菌重復3皿;在對照組中，只接三七黑斑病菌菌餅， 不接越南槐內生細菌，重復3皿。然后，在28°C下培養，定期觀測。待對照組中真菌長滿培養 皿時，在處理組中，測量三七黑斑病菌菌餅中心到越南槐內生細菌線中心之間三七黑斑病 菌的生長半徑為處理生長半徑;在對照組中，三七黑斑病菌的生長半徑為對照生長半徑。最 后，根據以下公式，計算抑菌率：
[0033] 對照生長量=對照生長半徑-菌餅半徑 [0034] 處理生長量=處理生長半徑-菌餅半徑
[0035]
[0036] 結果共得到3株對三七黑斑病菌抑制作用都很強的拮抗越南槐內生細菌菌株，其 中一株名稱為B22,對三七黑斑病菌的抑制率為57 %。
[0037] 三、鑒定
[0038](一）菌株形態特征
[0039]菌落形態特征觀察:將待鑒定的菌株接種在NA培養基上，置于28°C培養24h，觀察 菌株的菌落形態特征。
[0040]菌體形態特征觀察:取上述在NA培養基上培養24h的菌株進行革蘭氏染色并鏡檢， 將所觀察到的形態結果顯微照相，如圖2所示。
[0041 ](二)菌株16S rDNA序列及其系統發育學分析
[0042] DNA模板的制備：
[0043] 試劑：（1)裂解緩沖液：Tris-Ac(pH 7.8)40mM，NaAc 20mM，EDTA lmM，SDS l%(w/ v)；
[0044] (2)5M NaCl溶液。
[0045] DNA 提取：
[0046] (a)將1.5ml細菌過夜培養液培養物置于微量離心管（EP管）內，12000rpm離心 0.5min，棄去上清液，保留沉淀物；
[0047] (b)在沉淀物中加入400μ1裂解緩沖液，用吸管反復吹打使之重懸；
[0048] (c)加入200ul 5Μ NaCl，充分混勻，12000rpm離心10min，取600μ1 上清液；
[0049] (d)加入等體積的酚/氯仿（1:1)，混勻，離心（12000rpm，10min)，將上清液轉入另 一干凈的EP管中；
[0050] (e)向步驟(d)中獲得的上清液中加入等體積氯仿，混勻，離心（12000rpm，lOmin)， 將上清液轉入另一干凈的EP管中；
[0051] (f)向步驟(e)中所得上清液中加入等體積的異丙醇，混勻，置于室溫lOmin，離心 (12000rpm，15min)，棄去上清液，保留沉淀物；
[0052] (g)用體積濃度為70%乙醇洗滌步驟(f)所得沉淀物，晾干，即為DNA;
[0053] (h)將步驟(g)中已干的DNA溶于30μ1雙蒸水(ddH20)中，-20°C保存。
[0054] PCR擴增 16S rDNA序列：
[0055] (l)PCR儀：ABI 3730-XL DNA測序儀（Applied Biosystems，USA);
[0056] (2)擴增引物：27F(5/-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 /)如SEQIDN0·