一株海洋柴油降解菌qph-9及其固定化方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及微生物技術領域，具體為篩選出一株可高效降解海洋柴油的菌株QPH-9,開發了一種可有效固定該菌株的方法并初步檢測了該固定化方法對石油降解率的影響。
【背景技術】
[0002] 近年來，柴油已成為海洋的主要污染物質之一，主要通過沿海工業排放、海上油 井、輸油管道及船舶泄漏等多種途徑進入海洋，而此類情況不僅會嚴重影響所污染地區的 生態環境，同時也間接阻礙了中國沿海地區的經濟發展。目前，針對柴油污染，尤其是大面 積柴油泄漏，通常采用物理法、化學法以及生物修復的方法予以處理。一些物理方法如人工 打撈等往往適用于突發性溢油的回收并控制溢油的擴散，但是處理效率受天氣、海洋狀況 以及溢油類型影響;而如柴油乳化等化學方法，雖可以暫時清潔海面，但極易促使大量的原 油沉降海底，引起海底荒漠化，進而誘發二次污染。
[0003] 生物修復技術具有成本低、操作簡便、處理效果好等優點，因而現今被公認為最有 前景的海洋污染治理方法。由于自然環境的復雜性，使得直接投加外源高效降解菌在自然 環境下的柴油污染修復中往往難以達到預期效果，這促使污染海洋的生物修復日漸轉向于 依賴海洋微生物的降解作用，尤其是已經適應海底環境的各種土著柴油降解微生物，它們 不僅可以克服海洋中各種極端條件，還可以以柴油為食，有效的對柴油進行分解轉化，從而 改變海洋生態環境。然而，由于許多微生物在水中通常以懸浮狀態生長，菌體極易流失，這 使得降解菌的濃度偏低，對柴油等污染物無法達到明顯的降解效果。
[0004] 微生物固定化技術是從20世紀60年代開始迅速發展起來的一項新技術，主要通過 利用物理或化學的方法將微生物定位于限定的空間區域，具有微生物密度高、反應迅速、微 生物流失少等優點，將其應用于柴油污染的生物治理有著極大的應用潛力和發展前景。

【發明內容】

[0005] 本研究篩選出一株可高效降解海洋柴油的菌株QPH-9,并以沸石作為固定化載體， 系統研究了該固定化材料對微生物的固定化效果以及固定化前后柴油降解菌株QPH-9對柴 油的降解效率。
[0006] 本發明獲得一株可高效降解柴油的細菌，該菌株為QPH - 9 ( Ha 1 i e a mediterranea)，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC Νο·11550〇
[0007] 本發明還公開一種對上文所述的細菌QPH-9的固定化方法，其步驟包括：
[0008] ①活化菌種 QPH-9，菌濃度達 0D600nm = 0 · 927~0 · 933;
[0009] ②將沸石載體進行清洗、煮沸和烘干后，利用排水法準確稱量其體積；
[0010] ③向步驟②所得沸石載體中加入2216E液體培養基，滅菌后，再加入步驟①所得細 菌QPH-9，所加沸石載體顆粒、2216E液體培養基以及菌液的體積比例為（8~12 )mL: 60mL: (0.4~0.6)mL;于28~30°C、80~120rpm/min搖床中培養26~28h后，完成沸石載體對細菌 QPH-9的固定化。其中，載體顆粒、2216E液體培養基以及菌液的體積比例為1 OmL: 60mL: 0.6mL，培養溫度為28°C，搖床轉速為80rpm/min，培養時間為28h時，沸石載體對細菌QPH-9 菌液的固定化效果最佳。
[0011]上文所述的對細菌QPH-9的固定化方法中，步驟①所述活化菌種QPH-9過程中使用 的培養基為2216E液體培養基；培養條件為28~30°C、150~180rpm/min，當培養溫度為28 °C，搖床轉速為150rpm/min時，菌體長勢最好，菌濃度最高為0D600nm = 0.933。
[0012] 本發明上文所述的可高效降解柴油的細菌QPH-9在海洋柴油降解中有廣泛的應用 前景。
[0013] 本發明具有如下優點：
[0014] 1、本發明所述方法獲得的固定化QPH-9菌的操作簡單，且沸石載體顆粒對微生物 無任何毒副污染，沸石載體顆粒可以作為安全有效的吸附載體。
[0015] 2、本發明所述的固定化QPH-9菌的方法所使用的原材料價格低廉，當沸石載體顆 粒完成對菌株QPH-9的固定化后，通過高溫滅菌、清洗處理和煮沸，進而達到對固定化載體 的回收利用，有助于資源的節約和環境的保護。
[0016] 3、通過本發明實施例的數據表明，本發明所述的QPH-9游離菌對柴油的降解率為 49.1 %，而通過本發明所述方法制得的固定化顆粒，具有很好的微生物活性，對柴油具有很 好降解性能，降解率最高可達66.3%，相對于游離菌而言有效提高了 17.2%。
【附圖說明】
[0017] 圖1為菌體的接種量對載體固定化效果的影響。其中，橫坐標為菌體的接種量 (mL)，縱坐標為載體對菌液的吸附量(mL)。向含有10mL載體的60mL2216E液體培養基中，分 別接種〇. 4、0.6、0.8和lmL處于穩定生長期的柴油降解菌QPH-9(0D600nm=0.927~0.933)， 檢測不同接種量對載體固定化效果的影響。結果如圖1所示，載體對菌株的固定化效果隨接 種量的增大呈先上升后下降的趨勢，當接種量為〇. 4~0.6mL時，載體對QPH-9菌液的吸附量 相對較多，于0.6mL時達到最大，即具有最優固定化效果。由此確定固定化過程中菌株的接 種量與培養基的體積比在(〇. 4~0.6)mL: 60mL范圍內，均可以達到較好的固定化效果，當二 者比例為0.6mL:60mL時，固定化效果最佳。
[0018] 圖2為菌株的培養時間對載體固定化效果的影響。其中，橫坐標為菌體對載體的吸 附時間(h)，縱坐標為載體對菌液的吸附量(mL)。向含載體量為10mL的60mL 2216E液體培養 基中接入〇.6mL處于穩定生長期的石油降解菌QPH-9(0D600nm = 0.927~0.933)，于不同溫 度下連續培養，并分別于培養后的20、22、24、26、28、30和3211時測定固定化載體對菌株的吸 附量，進而判斷其固定化效果。實驗結果如圖2所示，沸石對菌株的固定化效率隨時間的延 長呈現增高后降低的趨勢，當培養時間為26~30h時載體對菌株的吸附效果較好，在28h時， 其吸附量達到最高，可達0. lmL。由此確定固定化過程中菌株最適的培養時間為26~28h，并 且于28h時固定化效果最佳。
[0019] 圖3為載體投加量對其固定化效果的影響。其中，橫坐標為載體投加量(mL)，縱坐 標為載體對菌液的吸附量(mL)。由圖3可見，沸石載體對于菌株的固定化效率隨載體量增加 均呈現先增高后降低的變化趨勢。當載體投加量為8~12mL時，載體對菌株的吸附量較大， 于10mL時，吸附量達到最高水平，載體固定化效果最好。由此確定，固定化過程中載體的投 加量與培養基的體積比在8~12mL:60mL范圍內，均可以達到較好的固定化效果，當二者比 例為10mL:60mL時，固定化效果最佳。
[0020] 圖4為固定化菌對柴油的降解效率。其中，橫坐標為游離菌及固定化菌，縱坐標為 二者對柴油的降解效率（％ )。如圖4所示，使用沸石作為載體的實驗組中，游離菌對柴油的 降解率為49.1 %，而固定化菌對柴油的降解率為66.3%，有效提高了 17.2%。由此可見，當 菌株被載體固定化后，可有效提尚其對石油的降解效率。
【具體實施方式】
[0021] 下述非限定性實施例可以使本領域的普通技術人員更全面地理解本發明，但不以 任何方式限制本發明。
[0022] Premix ExTaq Version2.0:購自于寶生物工程(大連)有限公司；引物:合成自上 海生物工程有限公司；2216E瓊脂及液體培養基:購自于青島高科園海博生物技術有限公 司;柴油:市售〇號柴油;沸石;購自于大連匯新鈦設備開發有限公司，顆粒大小為5-8mm。
[0023] 本發明所述的可高效降解柴油的細菌為QPH-9,該菌已于2015年10月28日保藏于 中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號為CGMCC No. 11550,保藏中心地址為:北京市朝 陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101。