能快速降解17β-雌二醇的復合菌及制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種能快速降解17β-雌二醇的復合菌，應用該復合菌劑快速降解畜禽養殖廢棄物中的類固醇雌激素一 17β-雌二醇，以減少環境污染并實現畜禽糞便的資源化利用。
【背景技術】
[0002]現代化養殖大量使用的促生長類藥物，加之動物自身分泌的激素，使得畜禽糞便中類固醇雌激素含量非常高，如平均每頭奶牛通過糞便排除的17β—雌二醇當量達到了 165微克/天，通過尿液形式排除的則高達498微克/天，使得畜禽養殖源的類固醇雌激素排放量遠遠超過了污水處理廠排水，成為環境中類固醇雌激素的主要污染源。類固醇雌激素的中毒機制主要包括模擬、干擾或對抗機體內生荷爾蒙原有的正常合成、運輸和釋放，使其無法維持自身的平衡和調節，引起動物界的雌性化現象。類固醇雌激素在水環境中以很低的濃度即可產生嚴重危害，17β —雌二醇在河水中的含量僅為lng/L時就會造成雄魚的雌性化。歐盟規定的12種內分泌干擾物中就包括類固醇雌激速和雌酮，并且17β—雌二醇被明確認為是致癌物質。由于疏水性強和生物可利用行低，特定條件下類固醇雌激素在環境中的滯留期會延長，污染范圍會擴大，環境風險也因此而增加。因此有必要針對畜禽養殖源排放的類固醇雌激素污染物進行有效的源頭治理，在畜禽糞便資源化利用前降解去除類固醇雌激素污染物。
[0003]畜禽養殖源的類固醇雌激素的治理方法主要包括化學法和生物法。化學法主要是利用光催化，其缺點是處理成本高，主要適用于養殖廢水中雌激素的去除，對固態的養殖廢棄物中類固醇雌激素的去除能力非常有限;臭氧可氧化類固醇雌激素而使其降解，但成本非常高，不適宜于小型養殖場，并且如果氧化程度不徹底可產生仍然有雌激素活性的中間代謝產物，因此不宜大規模推廣。生物法主要是利用微生物的新陳代謝作用來降解環境中的類固醇雌激素，由于生物法具有成本低，無二次污染，適用面廣等特點，在畜禽養殖排放源類固醇雌激素的生物治理方面具有明顯的優勢，越來越引起人們的重視。
[0004]國內外主要是從留體雌激素生產企業的廢水和活性污泥中分離獲得高效的類固醇激素降解菌，從污水處理的角度進行的研究。而畜禽養殖是水環境及污水中類固醇激素的主要來源，因此對畜禽養殖過程進行類固醇激素污染的源頭控制，可有效去除水體中的類固醇激素，對傳統的污水處理系統不需要提出更高的要求，否則末端治理時需要對傳統的污水處理技術和單元進行改善和升級才能達到對類固醇激素的有效去除。目前國內外主要是從單一菌株的角度出發，研究其降解機理以及對污水中類固醇激素的去除，并沒有完整地開展畜禽養殖過程中類固醇激素的降解研究和應用。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是解決自然環境下17β_雌二醇降解速率低和單一降解菌環境適應能力低的問題，提供一種能快速降解17β_雌二醇的復合菌。具體而言，本發明是從環境中分離出高適應能力和強降解效果的土著復合菌株，即利用復合菌株之間的協同共生作用和數量結構的自我調節作用來擴大其應用范圍，增強其降解類固醇雌激素的能力。該復合菌可快速降解處理畜禽養殖廢棄物和土壤中的17β-雌二醇，有效降低畜禽養殖中由17β-雌二醇污染帶來的生態和人體健康風險。
[0006]本發明能快速降解17β_雌二醇的復合菌，是由保藏號為CGMCCN0.10814的乙酸鈣不動桿菌Acinetobacter calcoaceticus LM1和保藏號為CGMCC N0.10815的假單胞菌Pseudomonas sp.LYl組成。
[0007]通過大量試驗證實，所述的乙酸鈣不動桿菌LM1和假單胞菌LY1以1:1的細胞數量比混合，對處理畜禽養殖廢棄物和土壤中的17β-雌二醇，降解效率最佳。
[0008]本發明能快速降解17β_雌二醇的復合菌由以下方式獲得:
[0009]1、菌種馴化培養與篩選
[00?0]分別從養豬場、養雞場、養牛場米集堆放的畜禽奠便和廢物處理設施中米集樣品，按照質量比1:1的比例混合，取混合樣品50g加入到500ml無菌水中，150rpm下振蕩提取菌體細胞，將提取液按5 %的比例接入到以20mg/Ll7β—雌二醇(17β —雌二醇)為唯一碳源的無機鹽培養基中馴化培養5天，取培養物再接種至含有17β—雌二醇的新鮮無機鹽培養基中馴化培養，待培養液變渾濁后再接種馴化培養，將最后一次的培養物梯度稀釋后涂布于固體的牛肉膏蛋白胨培養基上培養，挑取單個菌落，劃線純化后分別將單一和復合菌以及睪丸酮叢毛單胞菌ATCC11996的菌懸液加入到17β—雌二醇為唯一碳源的無機鹽培養基中培養，根據17β—雌二醇的降解率最終篩選出可高效協同降解17β—雌二醇的兩株菌，分別命名為LY1 和 LM10
[0011]2、菌種的鑒定與保藏
[0012]用形態觀察、革蘭氏染色和16SrRNA基因序列分析方法，對能夠快速協同降解17β—雌二醇的2種菌株進行鑒定，并于2015年5月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址:北京市朝陽區北辰西路1號院3號，其中乙酸鈣不動桿菌Acinetobacter calcoaceticus LM1 的保藏號CGMCC N0.10814，假單胞菌Pseudomonassp.LYl的保藏號為CGMCC N0.10815。
[0013]所述菌株LM1，通過菌落特征色、革蘭氏染和生理生化檢測試驗，表明具有以下特征及生物特性:在LB瓊脂上經30°C培養24小時，呈乳白色不透明的圓形菌落，直徑1.5mm左右，中央隆起，表面及邊緣均光滑，粘而附于培養基上。革蘭氏染色鏡檢為陰性菌，細胞成桿狀，可形成不同長度的鏈狀，靜止期成球形，常成對。無芽孢。生化特性結果顯示，分離菌株LM1能利用D-葡萄糖、D-甘露糖、D-纖維二糖、其它糖醇類不能利用；不利用苯丙氨酸、鳥氨酸、賴氨酸以及精氨酸;能在檸檬酸鹽(鈉)、丙二酸鹽中生長。氧化酶陰性，觸酶陽性，不產硫化氫，可利用琥珀酸鹽產堿，對卡那霉素無抗性，葡萄糖產酸。
[0014]所述菌株LY1菌株，通過菌落特征色、革蘭氏染和生理生化檢測試驗，表明具有以下特征及生物特性:在LB瓊脂上經30°C培養24小時，菌落中間微凸出，透明，表面濕潤光滑。革蘭氏陰性，短桿狀，0.5?Ι.ΟμπιΧ 1.5?5.Ομπι，不產芽孢，好氧。生化特性結果顯示，利用D-葡萄糖，不能利用D-纖維二糖，可利用檸檬酸鹽(鈉)丙二酸鹽和檸檬酸鹽，乳酸鹽產堿，琥珀酸鹽產堿，對卡那霉素無抗性。
[0015]16S rRNA基因序列分析和同源性比較表明菌株LM1與乙酸鈣不動桿菌的同源性最高，菌株LY1與假單胞屬的菌株同源性最高。綜合上述結果，菌株LM1和LY1分別被鑒定為乙酸鈣不動桿菌和假單胞菌。
[0016]3、復合菌的制備
[0017]首先將菌株LY1和LM1的菌體細胞分別劃線于牛肉膏蛋白胨固體培養基上在25°C下培養24h，然后向長滿菌體細胞的平板中加入無菌水，用玻璃棒使菌體細胞脫離培養基進入無菌水中，將含菌體細胞的懸濁液漩渦振蕩均勻后，再利用無菌水將菌懸液的OD600調節為0.10-0.20(細胞數量為106-107CFU/ml)，將兩株菌的菌懸液以1:1的細胞數量比混合，即得復合菌。
[0018]復合菌劑降解17β_雌二醇的環境因子響應特征測試:
[0019](1)碳氮比對復合菌降解17β—雌二醇的影響
[0020]分別取0.5mL 17β—雌二醇儲備液加入到12個盛有100mL無氮無機鹽培養基(去掉原無機鹽培養基中的硫酸銨)的250mL三角瓶中，向4個三角瓶中分別加入不同