一種從甘蔗葉片上分離赤腐病菌的簡易方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種病菌的分離方法，特別涉及一種從甘蔗葉片上分離赤腐病菌的簡易方法。
【背景技術】
[0002]赤腐病是甘蔗生產上的一種重要真菌性病害。病原菌主要通過孢子借風雨、霧、露、昆蟲及流水傳播，病菌主要由傷口侵入。甘蔗赤腐病可常年發病，螟蟲及飛虱為害重的易發病，冬春甘蔗栽培季節土壤過濕或偏酸，甘蔗萌芽生長受抑時發病重。甘蔗赤腐病菌常產生變種，形成很多形態小種和生理小種。因此，明確不同蔗區的生理小種以及優勢種，對選育赤腐病抗病甘蔗品種以及科學防控該病害具有重要的意義。而病原的大量收集是研究該病害最重要的基礎之一。
[0003]在我國，甘蔗赤腐病主要發生在葉片中脈上，其病原菌是半知菌亞門鐮孢炭疽菌(Colletotrichum falcatum Went)。目前關于甘鹿赤腐病菌的分離多采用傳統組織分離方法。常規分離方法對病害組織表面消毒要求嚴格，分離過程需全程在無菌條件下進行。常規分離方法的缺陷在于:I)操作過程嚴格要求無菌條件，需要準備消毒酒精、無菌水、剪刀、鑷子等相關器材;2)較為耗時，正常情況下，分離一個樣本至少需要10?20分鐘，對于田間大量采集樣本分離病原十分困難;3)甘蔗葉脈部分高度木質化，無菌條件下對樣本組織的分離切割較為困難;4)植物組織放置在培養基中培養病原菌的過程中容易受到植物組織中內生細菌的污染而致使病原菌分離失敗或降低病原菌分離的效率。《一種小麥紋枯病菌的分離方法》專利申請公開了對小麥紋枯病菌的分離方法，該方法需要用到75%酒精對植物組織進行消毒，然后用無菌水洗滌植物組織表面的酒精;處理3?4個植物組織樣本后需更新酒精、無菌水、裝酒精和無菌水的器皿、無菌的鑷子、解剖刀以及剪刀等。對于大量分離樣本的病原真菌，需要消耗大量的酒精，同時還需提前準備無菌水和大量無菌的器皿。無菌水的準備從高溫(121°C)滅菌到冷卻到可使用的室溫至少需要4個小時。耗時較長，且成本相對較高。《一種分離植物病原真菌的方法》專利申請，公開了一種對植物病原真菌的分離方法，但是該方法是直接將植物組織放置在培養基中培養，植物組織中的內生細菌同時也可以在培養基中生長，且細菌的生長速度通常較真菌的生長速度快，可造成目標病原菌的分離失敗，或分離出來的目標病原真菌容易與細菌混合生長，增加后面的純化目標病原真菌的次數，降低分離效率。因此，開發一種分離甘蔗赤腐病菌的簡易方法成為提高病原收集效率的迫切需要。
[0004]公開于該【背景技術】部分的信息僅僅旨在增加對本發明的總體背景的理解，而不應當被視為承認或以任何形式暗示該信息構成已為本領域一般技術人員所公知的現有技術。

【發明內容】

[0005]本發明的目的在于提供一種從甘蔗葉片上分離赤腐病菌的簡易方法，從而克服現有技術中對操作環境嚴格、對病菌分尚耗時長、且成本較尚的缺點。
[0006]為實現上述目的，本發明提供的技術方案如下:
[0007]一種從甘蔗葉片上分離赤腐病菌的簡易方法，包含以下操作步驟:
[0008](I)取有甘蔗赤腐病癥狀的甘蔗葉片，用自來水將甘蔗葉片表面的塵土清洗干凈，晾干；
[0009](2)將步驟(I)中晾干后的甘蔗葉片放入密封容器中再置于溫度為25?30°C環境中放置5?7天；
[0010](3)挑取步驟(2)中放置5?7天后甘蔗葉片赤腐病發病部位長出的白色菌絲，接入培養基中25?28°C培養2?3天；
[0011](4)將步驟(3)中培養所得菌落邊緣菌絲轉入新的培養基中25?28°C培養2?3天，重復操作I?2次，即得純化的赤腐病病原菌。
[0012]優選的是，步驟(2)中所述甘蔗葉片從發病部位經剪切成片段或從甘蔗葉片發病部位處折疊后放入溫度為25?30°C環境中。
[0013]優選的是，所述的密封容器為自封袋或塑料馬甲袋。
[0014]優選的是，其中所述的每個自封袋或塑料馬甲袋只放置一個甘蔗葉片樣本。
[0015]優選的是，步驟(3)、步驟(4)中所述培養基為TOA平板培養基，即馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板培養基。
[0016]本發明方法可以一次性同時處理幾十個到幾百個樣品。
[0017]雖然甘蔗赤腐病菌主要侵染甘蔗葉片中脈下表皮組織，病斑后期引起中脈表層組織破裂，在適當的環境下病原菌才有可能從葉脈組織中生長出來，但發明人發現，發病的葉脈部位經過剪斷或者折斷后，在本發明方法操作條件下，剪切口或折傷處較容易長出病原菌菌絲體，經過多次的純化，可獲得用于植物病理學研究的病原菌。
[0018]與現有技術相比，本發明具有如下有益效果:
[0019]本發明方法降低了赤腐病病原真菌分離過程中的能耗，簡易、高效地獲得目標病原真菌;尤其對于分離大量樣本病原真菌，更有效、及時的實現了分離赤腐病病原真菌，大大縮短了工作時間，提高了工作效率、降低了工作強度，同時降低目標病原菌與其他微生物混合生長的幾率，減少了純化病原菌的次數，也提高了后期純化目標病原真菌的純化效率。
【附圖說明】
[0020]圖1是感染赤腐病的甘蔗葉片。
[0021]圖2是從甘蔗葉片發病部位長出的病原菌菌絲。
【具體實施方式】
[0022]下面結合【具體實施方式】進行詳細描述，但應當理解本發明的保護范圍并不受【具體實施方式】的限制。甘蔗葉片樣品來自廣西農業科學院甘蔗研究所繁殖場。
[0023]實施例1
[0024]—種從甘蔗葉片上分離赤腐病菌的簡易方法，操作步驟為:
[0025](I)取明顯有甘蔗赤腐病癥狀的甘蔗葉片，用自來水將甘蔗葉片表面的塵土清洗干凈，晾干；
[0026](2)將步驟(I)中晾干后的甘蔗葉片從發病部位剪切成適當大小片段，放入潔凈的自封袋中，密封，每個自封袋放置一個樣本甘蔗葉片，避免病原交叉感染，然后將自封袋放在溫度為25°C環境中放置7天，放置期間甘蔗葉片由于呼吸產生的水分以及溫度造成甘蔗葉片保持在一個高溫高濕的條件下，侵染甘蔗葉片的病原菌通過吸收葉片組織的營養，迅速從發病部位的剪切口產生大量的白色菌絲體；
[0027](3)用潔凈的解剖刀挑取步驟(2)中甘蔗葉