一種高效價尿促性素的提取及純化方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及蛋白質純化和生物醫藥領域，具體而言，本發明涉及高效價尿促性素的提取及純化方法。
【背景技術】
[0002]尿促性素(HMG)是由人腦下垂體前葉部分分泌的一種糖蛋白促性腺激素，一般是從絕經期或絕經期后婦女的尿液中經提取純化而制得。婦女在行經期間HMG的含量有所波動，但較低，只有婦女進入絕經期或之后的十幾年中，其尿中HMG的含量方達到高峰(60-100iu/L尿)，并能維持在一個穩定的水平上，HMG含有卵泡刺激素(FSH)和黃體生成素(LH)，其所含比例近似1:1。臨床主要用于治療婦女因功能性不排卵所致的不育癥；男性因激素水平低下所引起的精子過少或活力不足。另外，還用于治療諸如婦女閉經、月經不調、男女之性機能失調等癥。
[0003]1928年Ascbheim首先報道了從更年期婦女尿液中發現了活性物質，之后報道雖不少，但真正對HMG的了解和制備，是從20世紀60年代的Donimi開始，并逐漸形成比較規范化的工藝來制備的。我國從20世紀70年代開始研究，80年代正式進入臨床試驗階段，90年代開始大量生產。
[0004]目前，比較經典的制備工藝是高嶺土 -乙醇法制備HMG粗制品，再用各種純化方法進行純化。國內目前常用的純化方法收率偏低(一般小于50%)，成品效價在lOOiu/mg左右。中國專利CN101792482A介紹了 “一種促性腺激素的純化方法”，該方法采用硅酸鋁粉末作為吸附劑提取純化HMG，但其效價僅能達到150iu/mg。

【發明內容】

[0005]本發明的目的在于提供一種高效價HMG的提取及純化方法，與傳統的分離純化方法相比，此方法突破了吸附分離雜蛋白技術難點，使HMG效價可穩定達到500iu/mg以上。
[0006]為實現上述目的，本發明采用以下技術方案予以實現:
1、粗品提取
1.1吸附，按尿量:高嶺土 =100:0.7比例投料。
[0007]取醋酸調尿液pH至3.8-4.8，加高嶺土攪拌2小時，靜置，離心取干吸附物。
[0008]1.2脫附，洗脫液配比為尿液:水:氨水=1000:14:1.5。
[0009]1.2.1在干吸附物中加洗脫液適量，調pH至10左右，攪拌2小時，離心取上清液。
[0010]1.2.2上清液用醋酸調PH5.5，加2倍量乙醇，攪拌均勻，靜置沉淀，將沉淀物用五氧化二磷干燥，得粗品。
[0011]2.HMG中間體提取
2.1將粗品慢慢投入1:30比例的乙酸銨提取液中，在低溫下攪拌2小時，離心取上清液。
[0012]2.2上清液加3倍量95%乙醇，攪拌2小時靜置，離心棄去上清液。
[0013]2.3沉淀物加適量乙醇脫水，再離心棄去上清液，沉淀物用五氧化二磷干燥即得HMG中間體
3.HMG精品提取 3.1協和工序 3.1.1吸附
將HMG中間體用100倍量醋酸鈉緩沖液在低溫下溶解，離心取上清液。上清液加10倍量協和樹脂攪拌2小時，離心棄去上清液。樹脂用醋酸鈉緩沖液反復洗滌，至280nm0D值小于0.25為止。
[0014]3.1.2洗脫，洗脫液為10%乙酸銨-40%乙醇溶液
吸附好的樹脂柱加5倍量洗脫液洗脫，流出液加4倍量95%乙醇，靜置，離心取沉淀物。沉淀物用無水乙醇脫水，離心再取沉淀物，用五氧化二磷干燥即得協和干粉。
[0015]3.2 DEAE-Cellulose 柱層析工序 3.2.1 DEAE-Cellulose 樹脂處理
3.2.1.1將柱中的DEAE-Cellulose樹脂用純化水反沖下來，裝入桶中，用純化水浸沒攪勻，靜置，傾去上清液及細小顆粒，反復三次，純化水浸沒靜置。
[0016]3.2.1.2 將DEAE-Cellulose樹脂濾干，用少量純化水洗滌，濾干后，裝入桶中，用0.5M HC1浸沒，攪拌，過濾，用純化水洗至中性，再分別用0.5M NaOH浸泡，攪拌，過濾，再用純化水洗至中性。
[0017]3.2.1.3將樹脂濾干，用0.05M Tris-HCl緩沖液(pH7.5)反復平衡到pH7.5后，用緩沖液浸沒，待用；
3.2.1.4將上述平衡好的樹脂裝入柱內，柱裝好后，再用0.05M Tris-HCl (pH7.5)緩沖液走柱，以流出液的pH近7.5為標準。
[0018]3.2.2 上樣
3.2.2.1將協和干粉按1:100倍比例溶解于0.05M Tris-HCl (pH7.5)緩沖液中攪拌溶解；
3.2.2.2 上樣，流速控制在50-60ml/min。
[0019]3.2.3 洗滌
上樣結束后，用0.05M Tris-HCl (pH7.5)緩沖液洗滌至流出液0D值在0.25以下，流速控制在60 ml/min左右。
[0020]3.2.4 洗脫
用0.2M Tris-HCl緩沖液(pH7.5)洗脫，流速控制在70ml/min左右，洗脫至流出0D值在0.35以上，滴加乙醇變渾濁后，開始收集流出液，直到0D值在0.35以下，停止收集流出液。
[0021]3.2.5 沉淀
計量流出收集液體積，轉入桶內，加入5倍量(V/V) 95%乙醇，攪拌均勻，然后靜置。
[0022]3.2.6 干燥
3.2.6.1棄去桶內的上清液，沉淀物離心，棄去上清液；
3.2.6.2沉淀物用適量的無水乙醇脫水，離心棄去上清液，重復二次；
3.2.6.3最后，將沉淀物用五氧化二磷干燥即得HMG精品。
[0023]4.注射級HMG提取
4.1取精品HMG加入25倍量(ml)純化水，攪拌溶解。
[0024]4.2溶解液加等體積乙醇，再加總體積8%的醋酸銨溶液，攪拌充分
4.3在不斷攪拌下分別加入精品HMG12倍的0.2M磷酸鈉溶液，純品HMG12倍的0.3M
醋酸鈣溶液。
[0025]4.4用5M氫氧化鈉溶液調pH至8.5，攪拌2小時，離心取上清液。
[0026]4.5上清液用5M鹽酸調pH至6.5-7.0，加10倍量95%乙醇，靜置，離心棄去上清液，沉淀物用無水乙醇洗滌，再離心棄去上清液，沉淀物用五氧化二磷干燥即得注射級HMG。
[0027]本發明提供的提取及純化方法獲得的以FSH和LH為主要成分的尿促性素具有更高的效價，可達300iu/mg以上。
【具體實施方式】
[0028]下面結合【具體實施方式】對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發明，而不是為了限制本發明的范圍。
[0029]實施例:
1、粗品提取 1.1吸附
采集絕經期婦女尿液1000kg，用醋酸調pH值，并用pH3.8-5.4精密試紙測定，調節尿液pH到3.8-4.8之間，加7kg高嶺土，攪拌2小時，靜置，離心取得干吸附物10kg。
[0030]1.2 脫附
1.2.1干吸附物加水14L，25%氨水6L溶解，繼續加氨水調pH至10左右，攪拌2小時，
離心取上清液。
[0031]1.2.2上清液用醋酸調pH5.5，加2倍量乙醇，攪拌均勻，靜置沉淀，將沉淀物用五氧化二磷干燥，得粗品40g。
[0032]2、HMG中間體提取
2.1將粗品慢慢投入1:30比例的2L乙酸銨提取液中，在低溫下攪拌2小時，離心取上清液。
[0033]2.2上清液加95%乙醇6L，攪拌2小時靜置，離心棄去上清液。
[0034]2.3沉淀物加適量乙醇脫水，再離心棄去上清液，沉淀物用五氧化二磷干燥即得HMG中間體12g。
[0035]3、HMG精品提取
3.1協和工序
3.1.1吸附將HMG中間體用1.2L醋酸鈉緩沖液在低溫下溶解，離心取上清液。上清液加0.12kg協和樹脂攪拌2小時，離心棄去上清液。樹脂用醋酸鈉緩沖液反復洗滌，至280nm0D值小于
0.25為止。
[0036]3.1.2洗脫，洗脫液為10%乙酸銨-40%乙醇溶液
吸附好的樹脂柱加6kg洗脫液洗脫，流出液加24L95%乙醇，靜置，離心取沉淀物。沉淀物用無水乙醇脫水，離心再取沉淀物，用五氧化二磷干燥即得協和干粉1.8g。
[0037]3.2 DEAE-Cellulose 柱層析工序 3.2.1 DEAE-Cellulose 樹脂處理
3.2.1.1將柱中的DEAE-Cellulose樹脂用純化水反沖下來，裝入桶中，用純化水浸沒攪勻，靜置，傾去上清液及細小顆粒，反復三次，純化水浸沒靜置。
[0038]3.2.1.2 將DEAE-Cellulose樹脂濾干，用少量純化水洗滌，濾干后，裝入桶中，用0.5M HC1浸沒，攪拌，過濾，用純化水洗至中性，再分別用0.5M NaOH浸泡