珠母貝基質蛋白及其應用
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及生物技術領域，具體地，本發明涉及一種蛋白及其應用。
【背景技術】
[0002] 骨質疏松癥是常見的骨代謝障礙性疾病，具體表現為骨量減少、骨組織顯微結構 受損、骨小梁數量減少、骨脆性增加、骨折風險升高等等，其中骨折是退行性骨質疏松癥最 常見和最嚴重的并發癥。骨質疏松癥發病緩慢，不易察覺，一旦發病往往較為嚴重。目前臨 床上對骨質疏松癥的藥物治療主要有兩個思路：一是抑制破骨細胞的骨吸收；二是促進新 骨形成。骨缺損指骨的結構完整性被破壞，同樣是一種臨床常見病，通常采用自行愈合或手 術干預治療。
[0003] PFMGl蛋白是一種在合浦珠母貝外套膜中高表達的基質蛋白，PFMGl與合浦珠母 貝中的生物礦化過程有著密切關系。
[0004] 然而，PFMGl蛋白的體外合成、純化和功能仍有待進一步研究。

【發明內容】

[0005] 本申請是基于發明人對以下事實和問題的發現和認識作出的：
[0006] PFMGl蛋白多為不溶性表達，在體外合成中，獲得的蛋白純度和產量均較低；此 外，現有對PFMGl的功能研究僅局限于體外結晶實驗以及pfmgl基因對成骨細胞內一些發 育相關基因的影響，并未深入細致的探討PFMGl蛋白的具體功能。
[0007] 本發明旨在至少在一定程度上解決相關技術中的技術問題之一。為此，本發明提 出了一種具有高水溶性的PFMGl蛋白以及制備這種高水溶性PFMGl蛋白的方法。本發明提 出的高水溶性PFMGl蛋白具有促進成骨細胞增殖、分化和礦化的功能。
[0008] 在本發明的第一方面，本發明提出了一種蛋白。根據本發明的實施例，所述蛋白具 有SEQ ID NO :1所不的氣基酸序列。
[0009] ARKRWWRRATKKVELKPEIGRGGDWKVSGGISISWRKKRSIEKQGKFNIELTLNPCDLMSYDSNKDGW THEDIKHIFDNEKLAEVFFSEADENDDEQISTSEFKDFKSRINQCVKD(SEQ ID Ν0：1)〇
[0010] SEQ ID NO :1是PFMGl蛋白氨基酸序列去掉疏水性較強的信號肽氨基酸系列之后 的PFMGl蛋白片段。根據本發明的實施例，所述蛋白具有高水溶性的特點，所述蛋白的水溶 性較PFMGl蛋白顯著提高。
[0011] 在本發明的第二方面，本發明提出了一種基因。根據本發明的實施例，所述基因具 有SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。
[0012] GCGAGAAAACGATGGTGGAGGAGGGCCACGAAAAAAGTTGAACTGAAACCGGAAATAGGGAGAGGAGGA GATTGGAAGGTCTCGGGAGGAATATCTATCTCATGGCGAAAGAAGAGAAGCATAGAGAAACAAGGAAAATTCAACAT AGAGTTGACGTTGAATCCATGCGATCTCATGTCTTATGACTCGAACAAGGACGGAGTGGTTACCCATGAAGATATAA AACATATATTTGATAATGAAAAGTTGGCTGAAGTGTTCTTTTCGGAGGCTGATGAAAACGATGATGAACAGATATCG ACCAGTGAATTTAAAGATTTCAAAAGTCGTATCAACCAATGCGTAAAGGATTAA(SEQ ID NO ：2)〇
[0013] SEQ ID NO :2是pfmgl基因的核苷酸序列去掉疏水性較強的信號肽的核苷酸序 列之后的Pfmgl基因片段。SEQ ID NO :2可在有效啟動子的控制下，啟動表達具有SEQ ID NO :1所不的氣基酸序列的蛋白。根據本發明的實施例，所述基因表達蛋白具有尚水溶性的 特點，所述基因表達蛋白的水溶性較PFMGl蛋白顯著提高。
[0014] 在本發明的第三方面，本發明提出了一種表達載體。根據本發明的實施例，所述 表達載體包括本發明所提出的基因。根據本發明的實施例，所述表達載體能夠高表達所述 基因，從而大量獲得本發明所提出的蛋白，所述蛋白的產量與現有體外合成的PFMGl蛋白 相比，產量顯著提高；并且如前所述，所述蛋白具有高水溶性的特點，所述蛋白的水溶性較 PFMGl蛋白顯者提尚。
[0015] 根據本發明的實施例，上述表達載體還可以進一步具有如下附加技術特征至少之
[0016] 根據本發明的實施例，所述表達載體為pGEX-6p_l載體。根據本發明的實施例，所 述表達載體在IPTG誘導下，能夠高表達本發明所提出蛋白的GST融合蛋白形式，該融合蛋 白與GST標簽注結合，進而進行洗脫處理，能夠獲得高純度的所述蛋白，所述蛋白的純度與 現有體外合成的PFMGl蛋白相比，純度顯著提高。
[0017] 在本發明的第四方面，本發明提出了一種重組細胞。根據本發明的實施例，所述重 組細胞含有本發明所提出的基因。根據本發明的實施例，所述重組細胞能夠高表達本發明 所提出的基因，從而大量獲得本發明所提出的蛋白，所述蛋白的產量和純度與現有體外合 成的PFMGl蛋白相比，產量和純度均顯著提高；并且如前所述，所述蛋白具有高水溶性的特 點，所述蛋白的水溶性較PFMGl蛋白顯著提高。
[0018] 在本發明的第五方面，本發明提出了一種制備重組細胞的方法。根據本發明的實 施例，所述方法包括：將本發明所提出的表達載體引入宿主細胞中。根據本發明的實施例， 本發明所提出的制備重組細胞的方法能夠大量獲得高活性的本發明所提出的重組細胞，進 而大量獲得本發明所提出的蛋白，所述蛋白的產量和純度與現有體外合成的PFMGl蛋白相 比，產量和純度均顯著提高；并且如前所述，所述蛋白具有高水溶性的特點，所述蛋白的水 溶性較PFMGl蛋白顯著提高。
[0019] 根據本發明的實施例，上述制備重組細胞的方法還可以進一步具有如下附加技術 特征至少之一：
[0020] 根據本發明的實施例，所述宿主細胞是大腸桿菌（E. coli)細胞或其衍生細胞。優 選地，所述細胞的培養液為2 X YT培養液。根據本發明的實施例，大腸桿菌細胞或其衍生細 胞可以進一步提尚所述重組細胞的量和活性，從而進一步提尚所述蛋白的表達。
[0021] 在本發明的第六方面，本發明提出了一種制備本發明所提出蛋白的方法。根據本 發明的實施例，所述方法包括：在適于所述蛋白表達的條件下，培養本發明所提出的重組細 胞，以便獲得所述蛋白。根據本發明的實施例，本發明提出的方法能夠大量獲得高純度的所 述蛋白，所述蛋白具有高水溶性、高純度的特點。
[0022] 在本發明的第六方面，本發明提出了本發明所提出的蛋白在制備藥物中的用途。 根據本發明的實施例，所述藥物用于：（1)促進成骨細胞的增殖；(2)促進成骨細胞的分化； (3)促進成骨細胞的礦化；(4)預防或治療骨質疏松；（5)促進骨折愈合；(6)修復骨缺損； 或（7)修復齒缺損。發明人通過大量的研究實驗發現，本發明所提出的蛋白能夠顯著促進 成骨細胞的增殖、成骨細胞中堿性磷酸酶ALP的活性、成骨細胞的礦化以及特異性指標基 因 Opn, Ocn, Osx, Runx2 mRNA的表達。根據本發明的實施例，本發明所提出的蛋白用于制備 藥物，所述藥物具有促進成骨細胞的增殖；促進成骨細胞的分化；促進成骨細胞的礦化；預 防或治療骨質疏松；促進骨折愈合；修復骨缺損或修復齒缺損的顯著療效。
[0023] 在本發明的第七方面，本發明提出了一種藥物組合物。根據本發明的實施例，所述 藥物組合物以本發明所提出的蛋白作為活性成分。發明人通過大量的研究實驗發現，本發 明所提出的蛋白能夠顯著促進成骨細胞的增殖、成骨細胞中堿性磷酸酶ALP的活性、成骨 細胞的礦化以及特異性指標基因 mRNA的表達。根據本發明的實施例，以所述蛋白為活性成 分的藥物組合物可以顯著促進成骨細胞的增殖、顯著促進成骨細胞的分化、顯著促進成骨 細胞的礦化、預防或治療骨質疏松、促進骨折愈合、修復骨缺損或修復齒缺損。
[0024] 根據本發明的一些實施例，本發明所提出的以本發明所提出的蛋白作為活性成分 的藥物組合物還可以包括藥物上可接受的載體，且藥物組合物的劑型和給藥方式不受特別 限制，所述載體、劑型和給藥方式的選擇以不影響或增強本發明所提出蛋白的活性為前提。 對于口服給藥，該藥物上可接受的載體可以包括粘合劑，潤滑劑，崩解劑