技術領域

本公開(kai)的(de)實施方案包(bao)(bao)括核酸(suan)(suan)擴增、核酸(suan)(suan)操作、遺傳學、醫學等領(ling)域。本公開(kai)的(de)實施方案的(de)領(ling)域涉及包(bao)(bao)括例如(ru)來自(zi)一個或多個細(xi)胞的(de)基因組(zu)或轉錄(lu)組(zu)的(de)擴增。

發明背景

出(chu)于(yu)對(dui)單(dan)細胞(bao)(bao)異質(zhi)性的(de)(de)(de)巨(ju)大興趣，人(ren)(ren)們最近嘗試利(li)用全基因(yin)(yin)組(zu)擴增和(he)穩(wen)健性(robustness)進(jin)行(xing)單(dan)細胞(bao)(bao)基因(yin)(yin)組(zu)測序(Navin等(deng)(deng)(deng)人(ren)(ren)，2011；Fan等(deng)(deng)(deng)人(ren)(ren)，2011；Lao等(deng)(deng)(deng)人(ren)(ren)，2008；Hou等(deng)(deng)(deng)人(ren)(ren)，2012；Cheng等(deng)(deng)(deng)人(ren)(ren)，2011；Telenius等(deng)(deng)(deng)人(ren)(ren),1992；Zhang等(deng)(deng)(deng)人(ren)(ren),2006；Zhang等(deng)(deng)(deng)人(ren)(ren),1992)。然而(er)，迄(qi)今為止(zhi)，所使用的(de)(de)(de)方(fang)法(fa)通常都受(shou)限于(yu)相(xiang)對(dui)較低的(de)(de)(de)覆蓋率。聚合酶鏈反應(PCR)是對(dui)特定區域(yu)的(de)(de)(de)DNA擴增的(de)(de)(de)金標準(zhun)。依賴于(yu)使用隨機引物的(de)(de)(de)指(zhi)數擴增，基于(yu)PCR的(de)(de)(de)全基因(yin)(yin)組(zu)擴增方(fang)法(fa)引入(ru)了(le)強的(de)(de)(de)序列依賴性偏(pian)差，因(yin)(yin)此(ci)對(dui)整個基因(yin)(yin)組(zu)均一(yi)代表是不理想的(de)(de)(de)。已經開發了(le)多重置換擴增(MDA)以(yi)克服PCR的(de)(de)(de)這些(xie)缺點(Dean等(deng)(deng)(deng)人(ren)(ren)，2002；Dean等(deng)(deng)(deng)人(ren)(ren)，2001)，但是MDA仍然顯示有(you)不可(ke)忽(hu)略的(de)(de)(de)偏(pian)差。出(chu)于(yu)這些(xie)原(yuan)因(yin)(yin)，對(dui)允(yun)許精(jing)確(que)檢測單(dan)個核苷酸變體(SNV)的(de)(de)(de)單(dan)個體類細胞(bao)(bao)全基因(yin)(yin)組(zu)測序還沒有(you)可(ke)靠(kao)的(de)(de)(de)報道。

為(wei)實現用于單(dan)細胞的(de)(de)(de)(de)(de)全基(ji)因(yin)(yin)組SNV，并(bing)且(qie)具有可媲美大量測(ce)序(xu)的(de)(de)(de)(de)(de)精確度(du)，主要的(de)(de)(de)(de)(de)技術(shu)障礙(ai)在(zai)(zai)于現有技術(shu)中(zhong)(zhong)在(zai)(zai)非(fei)線性(xing)(xing)擴(kuo)(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)中(zhong)(zhong)產(chan)(chan)(chan)生(sheng)(sheng)并(bing)繁衍的(de)(de)(de)(de)(de)擴(kuo)(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)錯(cuo)(cuo)(cuo)(cuo)(cuo)誤(wu)。在(zai)(zai)非(fei)線性(xing)(xing)擴(kuo)(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)中(zhong)(zhong)，聚合酶產(chan)(chan)(chan)生(sheng)(sheng)的(de)(de)(de)(de)(de)錯(cuo)(cuo)(cuo)(cuo)(cuo)誤(wu)會(hui)在(zai)(zai)隨后(hou)的(de)(de)(de)(de)(de)循環中(zhong)(zhong)以新(xin)合成產(chan)(chan)(chan)物(wu)用作模(mo)(mo)板(ban)(ban)時(shi)被(bei)拷(kao)(kao)貝(bei)。對于常規PCR擴(kuo)(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)有成千(qian)上(shang)萬的(de)(de)(de)(de)(de)模(mo)(mo)板(ban)(ban)可用于起始，這些錯(cuo)(cuo)(cuo)(cuo)(cuo)誤(wu)不會(hui)引起任何問題(ti)，因(yin)(yin)為(wei)具體(ti)拷(kao)(kao)貝(bei)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)每個隨機錯(cuo)(cuo)(cuo)(cuo)(cuo)誤(wu)都(dou)(dou)由大量的(de)(de)(de)(de)(de)其(qi)他獨立拷(kao)(kao)貝(bei)所稀釋(shi)。然而，對于單(dan)細胞擴(kuo)(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)，情況卻并(bing)不相(xiang)同，因(yin)(yin)為(wei)一個細胞只有每個獨特染色體(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)一份拷(kao)(kao)貝(bei)作為(wei)模(mo)(mo)板(ban)(ban)。在(zai)(zai)非(fei)線性(xing)(xing)擴(kuo)(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)中(zhong)(zhong)，第一個循環中(zhong)(zhong)產(chan)(chan)(chan)生(sheng)(sheng)的(de)(de)(de)(de)(de)錯(cuo)(cuo)(cuo)(cuo)(cuo)誤(wu)將被(bei)半數的(de)(de)(de)(de)(de)DNA產(chan)(chan)(chan)物(wu)所有，而這些錯(cuo)(cuo)(cuo)(cuo)(cuo)誤(wu)將持續(xu)被(bei)以類似的(de)(de)(de)(de)(de)百分比拷(kao)(kao)貝(bei)。最終在(zai)(zai)測(ce)序(xu)數據中(zhong)(zhong)，不能(neng)將這些錯(cuo)(cuo)(cuo)(cuo)(cuo)誤(wu)與該單(dan)細胞中(zhong)(zhong)真正的(de)(de)(de)(de)(de)雜合子變體(ti)相(xiang)區(qu)分。更(geng)重要地，這種假陽(yang)性(xing)(xing)率不能(neng)通過簡單(dan)地增(zeng)(zeng)(zeng)加測(ce)序(xu)深度(du)而減少。為(wei)了克(ke)服該技術(shu)問題(ti)，需要進行(xing)線性(xing)(xing)擴(kuo)(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)。當(dang)擴(kuo)(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)是(shi)線性(xing)(xing)時(shi)，所有DNA產(chan)(chan)(chan)物(wu)都(dou)(dou)直(zhi)接由原始模(mo)(mo)板(ban)(ban)拷(kao)(kao)貝(bei)而來。因(yin)(yin)此(ci)，擴(kuo)(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)錯(cuo)(cuo)(cuo)(cuo)(cuo)誤(wu)是(shi)獨立產(chan)(chan)(chan)生(sheng)(sheng)的(de)(de)(de)(de)(de)，并(bing)可在(zai)(zai)線性(xing)(xing)擴(kuo)(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)產(chan)(chan)(chan)物(wu)中(zhong)(zhong)稀釋(shi)。

發明簡述

本發明針對的(de)(de)是(shi)用于擴增大量核(he)酸(suan)(suan)的(de)(de)系統、方(fang)法和組(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)合物。在具(ju)體實施方(fang)案中，所述(shu)多種(zhong)核(he)酸(suan)(suan)是(shi)一個(ge)(ge)(ge)或(huo)(huo)(huo)(huo)多個(ge)(ge)(ge)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)或(huo)(huo)(huo)(huo)無(wu)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)材(cai)(cai)料的(de)(de)完全或(huo)(huo)(huo)(huo)部分(fen)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)組(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)或(huo)(huo)(huo)(huo)者一個(ge)(ge)(ge)或(huo)(huo)(huo)(huo)多個(ge)(ge)(ge)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)或(huo)(huo)(huo)(huo)無(wu)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)材(cai)(cai)料的(de)(de)轉(zhuan)錄組(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)，例(li)如或(huo)(huo)(huo)(huo)表觀(guan)(guan)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)組(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)，即(ji)在二硫化物轉(zhuan)化后的(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)組(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)中的(de)(de)稀有(you)核(he)酸(suan)(suan)材(cai)(cai)料，又例(li)如選(xuan)定的(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)組(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)，即(ji)染色質沉淀后基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)組(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)中的(de)(de)稀有(you)核(he)酸(suan)(suan)材(cai)(cai)料。所述(shu)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)組(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)或(huo)(huo)(huo)(huo)轉(zhuan)錄組(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)可(ke)以來自(zi)單(dan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)或(huo)(huo)(huo)(huo)多個(ge)(ge)(ge)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)，例(li)如兩(liang)個(ge)(ge)(ge)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、三個(ge)(ge)(ge)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、四(si)個(ge)(ge)(ge)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、五個(ge)(ge)(ge)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)等(deng)。在其(qi)(qi)中基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)組(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)或(huo)(huo)(huo)(huo)轉(zhuan)錄組(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)或(huo)(huo)(huo)(huo)表觀(guan)(guan)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)組(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)或(huo)(huo)(huo)(huo)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)組(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)的(de)(de)靶(ba)向區來自(zi)多個(ge)(ge)(ge)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)實施方(fang)案中，所述(shu)多個(ge)(ge)(ge)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)可(ke)以是(shi)相同的(de)(de)類型、基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)型或(huo)(huo)(huo)(huo)表型。在其(qi)(qi)中核(he)酸(suan)(suan)源(yuan)自(zi)多個(ge)(ge)(ge)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)情(qing)況下，例(li)如，所述(shu)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)可(ke)來自(zi)相同來源(yuan)或(huo)(huo)(huo)(huo)來自(zi)相同組(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)織。在某些實施方(fang)案中，細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)是(shi)胎兒(er)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、癌細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、疑似癌性細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)等(deng)。無(wu)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)核(he)酸(suan)(suan)材(cai)(cai)料包括(kuo)存在于血液或(huo)(huo)(huo)(huo)其(qi)(qi)他體液中的(de)(de)核(he)酸(suan)(suan)。

本(ben)(ben)公(gong)開(kai)(kai)的(de)(de)(de)(de)實施方案一(yi)般涉(she)及用于擴(kuo)增基(ji)因組序(xu)列，如(ru)單(dan)細(xi)胞(bao)或(huo)(huo)(huo)任選多細(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)(de)全基(ji)因組的(de)(de)(de)(de)方法和組合物。本(ben)(ben)公(gong)開(kai)(kai)的(de)(de)(de)(de)實施方案一(yi)般還涉(she)及用于擴(kuo)增部分(fen)或(huo)(huo)(huo)全部轉錄(lu)組，如(ru)單(dan)細(xi)胞(bao)或(huo)(huo)(huo)任選多細(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)(de)整個轉錄(lu)組的(de)(de)(de)(de)方法和組合物。本(ben)(ben)領域(yu)技術(shu)人員會認識到(dao)本(ben)(ben)公(gong)開(kai)(kai)的(de)(de)(de)(de)方法允許從(cong)基(ji)因組或(huo)(huo)(huo)轉錄(lu)組中(zhong)對(dui)具體核酸進(jin)行(xing)線(xian)性擴(kuo)增，其中(zhong)本(ben)(ben)發明的(de)(de)(de)(de)所(suo)得(de)產(chan)(chan)物是(shi)大量擴(kuo)增子(代(dai)表部分(fen)或(huo)(huo)(huo)全部的(de)(de)(de)(de)各(ge)自基(ji)因組或(huo)(huo)(huo)轉錄(lu)組)，且至少在一(yi)些情況下線(xian)性產(chan)(chan)生(sheng)的(de)(de)(de)(de)擴(kuo)增子會進(jin)一(yi)步以(yi)線(xian)性或(huo)(huo)(huo)非線(xian)性方式(如(ru)通過PCR)得(de)到(dao)擴(kuo)增。

本(ben)公(gong)開的實施方(fang)(fang)(fang)案(an)包括(kuo)用于在(zai)整個基因組上以(yi)高(gao)均一性(xing)和(he)高(gao)保真度(du)對(dui)單(dan)細(xi)胞(bao)(bao)(或(huo)任(ren)選多細(xi)胞(bao)(bao))進行(xing)全基因組擴增的方(fang)(fang)(fang)法。此類方(fang)(fang)(fang)法允許例(li)如(ru)拷(kao)貝(bei)數變異(CNV)和(he)單(dan)核苷(gan)酸變異(SNV)的精確檢(jian)(jian)測(ce)(ce)，并且任(ren)選地例(li)如(ru)通過標準高(gao)通量測(ce)(ce)序平臺或(huo)微陣(zhen)列或(huo)基于PCR基因分型(xing)按(an)照本(ben)發明的方(fang)(fang)(fang)法來檢(jian)(jian)測(ce)(ce)CNV或(huo)SNV的存在(zai)。

本(ben)公開的(de)(de)(de)(de)(de)方(fang)法的(de)(de)(de)(de)(de)實施方(fang)案提供兩隊本(ben)領域中(zhong)當前(qian)使用的(de)(de)(de)(de)(de)方(fang)法的(de)(de)(de)(de)(de)顯著改進。例如，通過從覆蓋全(quan)基(ji)因(yin)組的(de)(de)(de)(de)(de)原(yuan)始單細(xi)胞DNA片段(duan)的(de)(de)(de)(de)(de)線性擴(kuo)(kuo)增(zeng)(即，從單細(xi)胞DNA模板產(chan)生擴(kuo)(kuo)增(zeng)子(zi)的(de)(de)(de)(de)(de)獨立拷貝(bei))進行SNV檢(jian)測(ce)的(de)(de)(de)(de)(de)精確(que)(que)度相對(dui)于本(ben)領域中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)方(fang)法得到(dao)大大提高(gao)。線性擴(kuo)(kuo)增(zeng)允許(xu)對(dui)擴(kuo)(kuo)增(zeng)錯(cuo)誤的(de)(de)(de)(de)(de)有效過濾，因(yin)此實現例如與用于SNP檢(jian)測(ce)的(de)(de)(de)(de)(de)大量測(ce)序相當的(de)(de)(de)(de)(de)精度。本(ben)文提供的(de)(de)(de)(de)(de)方(fang)法的(de)(de)(de)(de)(de)具體(ti)實施方(fang)案為(wei)每(mei)(mei)個獨立拷貝(bei)的(de)(de)(de)(de)(de)擴(kuo)(kuo)增(zeng)子(zi)引入“條(tiao)形碼”。該條(tiao)形碼允許(xu)確(que)(que)定在基(ji)因(yin)組上的(de)(de)(de)(de)(de)每(mei)(mei)個基(ji)因(yin)座的(de)(de)(de)(de)(de)假陽(yang)性率。

本文提(ti)供了可用于(yu)對提(ti)取(qu)自(zi)一(yi)(yi)個(ge)單細(xi)(xi)胞(bao)的DNA片段(duan)進行(xing)擴(kuo)增的方法，盡管在一(yi)(yi)些情況下(xia)DNA可提(ti)取(qu)自(zi)多于(yu)一(yi)(yi)個(ge)細(xi)(xi)胞(bao)。因此，至少某些方法允(yun)許(xu)對一(yi)(yi)個(ge)單細(xi)(xi)胞(bao)進行(xing)均(jun)一(yi)(yi)的全(quan)基因組(zu)擴(kuo)增，其允(yun)許(xu)通(tong)過標準高通(tong)量測序平臺精確檢測拷(kao)貝(bei)數變異(CNV)和單核(he)苷酸(suan)變異(SNV)。

本(ben)(ben)公開的實施(shi)方案允許使(shi)用(yong)精(jing)確的線性擴增方法，其將為一(yi)個且(qie)僅一(yi)個細(xi)胞提供(gong)精(jing)確的SNV檢(jian)測。在(zai)(zai)特定情(qing)況下，不需要親緣細(xi)胞來過濾假陽性。本(ben)(ben)公開的實施(shi)方案對本(ben)(ben)領域的一(yi)個改進在(zai)(zai)于允許使(shi)用(yong)組織(zhi)學臨床樣品作(zuo)為待擴增核酸的細(xi)胞來源。

本文提供了方法用于通(tong)過將不同的(de)DNA片段分離成(cheng)數百萬個(ge)小體(ti)積反(fan)應(ying)區(qu)室并在(zai)無不同擴增(zeng)子之(zhi)間的(de)干(gan)擾和競(jing)爭(zheng)下(xia)進行擴增(zeng)而消(xiao)除擴增(zeng)中(zhong)(zhong)的(de)偏差。因此，在(zai)具體(ti)實施方案(an)中(zhong)(zhong)，單(dan)個(ge)擴增(zeng)子存在(zai)于反(fan)應(ying)孔中(zhong)(zhong)用于例(li)如通(tong)過PCR而擴增(zeng)。在(zai)某些方面，反(fan)應(ying)區(qu)室中(zhong)(zhong)的(de)反(fan)應(ying)體(ti)積為飛升至(zhi)納升的(de)體(ti)積。

本(ben)文提供(gong)的(de)方法的(de)實施方案通過(guo)在微流(liu)體裝(zhuang)置中(zhong)分開的(de)反(fan)應區(qu)室中(zhong)進行每個(ge)DNA片段的(de)擴(kuo)增(zeng)(zeng)或通過(guo)例如乳化(hua)劑產生的(de)分離反(fan)應液(ye)滴而顯著(zhu)改善均一(yi)性(xing)。在一(yi)些情(qing)況下，在具有小至飛升體積的(de)數千或更(geng)多個(ge)反(fan)應區(qu)室中(zhong)進行各自(zi)的(de)擴(kuo)增(zeng)(zeng)。在具體方面(mian)，擴(kuo)增(zeng)(zeng)在每個(ge)單獨的(de)反(fan)應中(zhong)飽和，非(fei)線性(xing)擴(kuo)增(zeng)(zeng)(測序依賴性(xing)PCR偏差或MDA的(de)擴(kuo)增(zeng)(zeng)偏差)得(de)到最小化(hua)。

在(zai)具體(ti)實施方案中(zhong)，所述方法使用的聚合酶具有強的置換強度以及高的與(yu)引(yin)物-DNA復合物的結(jie)合常數。

在(zai)一(yi)(yi)個(ge)實(shi)(shi)施(shi)方(fang)(fang)案(an)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)，有從(cong)一(yi)(yi)個(ge)或(huo)(huo)多(duo)(duo)個(ge)細胞線(xian)性產(chan)(chan)(chan)(chan)生(sheng)(sheng)擴增(zeng)(zeng)(zeng)子(zi)(zi)的(de)(de)(de)方(fang)(fang)法(fa)，包(bao)括(kuo)以下(xia)步(bu)(bu)驟(zou)(zou)：將(jiang)來自所(suo)(suo)(suo)述一(yi)(yi)個(ge)或(huo)(huo)多(duo)(duo)個(ge)細胞的(de)(de)(de)核(he)(he)(he)(he)酸(suan)(suan)接(jie)(jie)觸第一(yi)(yi)大(da)(da)量(liang)(liang)引(yin)物(wu)(wu)和(he)包(bao)含(han)鏈置換活(huo)性的(de)(de)(de)聚合(he)(he)酶(mei)，所(suo)(suo)(suo)述接(jie)(jie)觸發(fa)生(sheng)(sheng)于(yu)(yu)0℃至(zhi)約35℃的(de)(de)(de)溫度(du)(du)范圍條件(jian)下(xia)，其(qi)(qi)(qi)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)所(suo)(suo)(suo)述引(yin)物(wu)(wu)與所(suo)(suo)(suo)述核(he)(he)(he)(he)酸(suan)(suan)退(tui)火(huo)(huo)(huo)，且所(suo)(suo)(suo)述引(yin)物(wu)(wu)通過聚合(he)(he)酶(mei)得到延(yan)伸(shen)，其(qi)(qi)(qi)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)所(suo)(suo)(suo)述第一(yi)(yi)大(da)(da)量(liang)(liang)引(yin)物(wu)(wu)具(ju)有以下(xia)特征：a)富(fu)含(han)40％-60％的(de)(de)(de)G或(huo)(huo)富(fu)含(han)40％-60％的(de)(de)(de)C；及b)包(bao)含(han)限制(zhi)性內(nei)切核(he)(he)(he)(he)酸(suan)(suan)酶(mei)位(wei)點，從(cong)而(er)(er)產(chan)(chan)(chan)(chan)生(sheng)(sheng)包(bao)含(han)引(yin)物(wu)(wu)退(tui)火(huo)(huo)(huo)的(de)(de)(de)核(he)(he)(he)(he)酸(suan)(suan)模(mo)(mo)板(ban)的(de)(de)(de)混(hun)(hun)合(he)(he)物(wu)(wu)；對引(yin)物(wu)(wu)退(tui)火(huo)(huo)(huo)的(de)(de)(de)核(he)(he)(he)(he)酸(suan)(suan)模(mo)(mo)板(ban)進(jin)行(xing)兩(liang)輪(lun)或(huo)(huo)多(duo)(duo)輪(lun)延(yan)伸(shen)、解(jie)鏈和(he)退(tui)火(huo)(huo)(huo)步(bu)(bu)驟(zou)(zou)，由此(ci)(ci)產(chan)(chan)(chan)(chan)生(sheng)(sheng)核(he)(he)(he)(he)酸(suan)(suan)模(mo)(mo)板(ban)、線(xian)性產(chan)(chan)(chan)(chan)生(sheng)(sheng)的(de)(de)(de)半(ban)擴增(zeng)(zeng)(zeng)子(zi)(zi)和(he)非線(xian)性產(chan)(chan)(chan)(chan)生(sheng)(sheng)的(de)(de)(de)全(quan)擴增(zeng)(zeng)(zeng)子(zi)(zi)的(de)(de)(de)混(hun)(hun)合(he)(he)物(wu)(wu)；將(jiang)所(suo)(suo)(suo)述混(hun)(hun)合(he)(he)物(wu)(wu)置于(yu)(yu)能(neng)使全(quan)擴增(zeng)(zeng)(zeng)子(zi)(zi)的(de)(de)(de)兩(liang)個(ge)末端能(neng)夠彼此(ci)(ci)退(tui)火(huo)(huo)(huo)的(de)(de)(de)條件(jian)下(xia)，從(cong)而(er)(er)產(chan)(chan)(chan)(chan)生(sheng)(sheng)成環(huan)的(de)(de)(de)全(quan)擴增(zeng)(zeng)(zeng)子(zi)(zi)；將(jiang)所(suo)(suo)(suo)述成環(huan)的(de)(de)(de)全(quan)擴增(zeng)(zeng)(zeng)子(zi)(zi)接(jie)(jie)觸限制(zhi)性內(nei)切核(he)(he)(he)(he)酸(suan)(suan)酶(mei)，從(cong)而(er)(er)使得全(quan)擴增(zeng)(zeng)(zeng)子(zi)(zi)不(bu)能(neng)與第一(yi)(yi)大(da)(da)量(liang)(liang)引(yin)物(wu)(wu)或(huo)(huo)第二大(da)(da)量(liang)(liang)引(yin)物(wu)(wu)退(tui)火(huo)(huo)(huo)，其(qi)(qi)(qi)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)第二大(da)(da)量(liang)(liang)引(yin)物(wu)(wu)富(fu)含(han)40％-60％的(de)(de)(de)G或(huo)(huo)C；以及使第一(yi)(yi)大(da)(da)量(liang)(liang)引(yin)物(wu)(wu)或(huo)(huo)第二大(da)(da)量(liang)(liang)引(yin)物(wu)(wu)與混(hun)(hun)合(he)(he)物(wu)(wu)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)剩余的(de)(de)(de)線(xian)性產(chan)(chan)(chan)(chan)生(sheng)(sheng)的(de)(de)(de)半(ban)擴增(zeng)(zeng)(zeng)子(zi)(zi)退(tui)火(huo)(huo)(huo)并延(yan)伸(shen)，其(qi)(qi)(qi)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)所(suo)(suo)(suo)述退(tui)火(huo)(huo)(huo)和(he)延(yan)伸(shen)在(zai)核(he)(he)(he)(he)酸(suan)(suan)不(bu)會進(jin)一(yi)(yi)步(bu)(bu)解(jie)鏈的(de)(de)(de)情(qing)況(kuang)下(xia)發(fa)生(sheng)(sheng)，由此(ci)(ci)產(chan)(chan)(chan)(chan)生(sheng)(sheng)線(xian)性產(chan)(chan)(chan)(chan)生(sheng)(sheng)的(de)(de)(de)全(quan)擴增(zeng)(zeng)(zeng)子(zi)(zi)。在(zai)一(yi)(yi)個(ge)具(ju)體的(de)(de)(de)實(shi)(shi)施(shi)方(fang)(fang)案(an)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)，該方(fang)(fang)法(fa)進(jin)一(yi)(yi)步(bu)(bu)包(bao)含(han)使線(xian)性產(chan)(chan)(chan)(chan)生(sheng)(sheng)的(de)(de)(de)全(quan)擴增(zeng)(zeng)(zeng)子(zi)(zi)進(jin)行(xing)擴增(zeng)(zeng)(zeng)的(de)(de)(de)步(bu)(bu)驟(zou)(zou)。在(zai)一(yi)(yi)個(ge)實(shi)(shi)施(shi)方(fang)(fang)案(an)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)，本(ben)公開(kai)的(de)(de)(de)方(fang)(fang)法(fa)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)所(suo)(suo)(suo)用的(de)(de)(de)聚合(he)(he)酶(mei)缺乏外切核(he)(he)(he)(he)酸(suan)(suan)酶(mei)活(huo)性。在(zai)具(ju)體實(shi)(shi)施(shi)方(fang)(fang)案(an)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)，混(hun)(hun)合(he)(he)步(bu)(bu)驟(zou)(zou)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)接(jie)(jie)觸發(fa)生(sheng)(sheng)于(yu)(yu)低于(yu)(yu)60℃的(de)(de)(de)溫度(du)(du)下(xia)。在(zai)一(yi)(yi)些情(qing)況(kuang)下(xia)，所(suo)(suo)(suo)述方(fang)(fang)法(fa)另外提供了包(bao)括(kuo)從(cong)一(yi)(yi)個(ge)或(huo)(huo)多(duo)(duo)個(ge)細胞獲(huo)得核(he)(he)(he)(he)酸(suan)(suan)，例如通過裂解(jie)細胞和(he)從(cong)細胞提取合(he)(he)適。在(zai)具(ju)體實(shi)(shi)施(shi)方(fang)(fang)案(an)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)，所(suo)(suo)(suo)述核(he)(he)(he)(he)酸(suan)(suan)包(bao)括(kuo)基因(yin)組DNA。在(zai)一(yi)(yi)些情(qing)況(kuang)下(xia)，所(suo)(suo)(suo)述核(he)(he)(he)(he)酸(suan)(suan)包(bao)括(kuo)RNA且所(suo)(suo)(suo)述方(fang)(fang)法(fa)進(jin)一(yi)(yi)步(bu)(bu)包(bao)括(kuo)從(cong)RNA產(chan)(chan)(chan)(chan)生(sheng)(sheng)cDNA的(de)(de)(de)步(bu)(bu)驟(zou)(zou)。

在(zai)本公開的實(shi)(shi)施方式中，可使用特(te)定的引(yin)物(wu)(wu)，至少包括第(di)一(yi)或第(di)二(er)大量(liang)引(yin)物(wu)(wu)。在(zai)具體實(shi)(shi)施方案(an)中，第(di)一(yi)、第(di)二(er)或二(er)者的引(yin)物(wu)(wu)包含下式：

X_nY_mZ_p，

其中n大于2且X為富含40％-60％的G或富含40％-60％的C，其中Y是任意核苷酸并且m為3-8個核苷酸，其中當X_n是富含G時Z是G或者當X_n是(shi)富含C時(shi)Z是(shi)C，p是(shi)2-4個(ge)核苷酸。在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)具體(ti)(ti)情(qing)況下(xia)(xia)，m為5個(ge)核苷酸；p是(shi)3個(ge)核苷酸；n是(shi)20-40個(ge)核苷酸；n是(shi)25-35個(ge)核苷酸；或n是(shi)24-28個(ge)核苷酸。在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)一個(ge)具體(ti)(ti)的(de)實施(shi)方案(an)中，聚(ju)合(he)(he)酶是(shi)Bst大片段或pyrophage 3173聚(ju)合(he)(he)酶。在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)特定情(qing)況下(xia)(xia)，引(yin)物(wu)退火(huo)(huo)的(de)核酸模(mo)板的(de)延伸步驟(zou)在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)30℃至65℃的(de)溫(wen)(wen)度(du)(du)(du)范圍(wei)內(nei)發生。在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)具體(ti)(ti)實施(shi)方案(an)中，在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)引(yin)物(wu)退火(huo)(huo)的(de)核酸模(mo)板的(de)延伸之后，核酸在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)至少90℃的(de)溫(wen)(wen)度(du)(du)(du)下(xia)(xia)解鏈。在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)某(mou)些(xie)情(qing)況下(xia)(xia)，在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)核酸解鏈后，將核酸冷卻(que)至低(di)于(yu)引(yin)物(wu)解鏈溫(wen)(wen)度(du)(du)(du)的(de)溫(wen)(wen)度(du)(du)(du)，并加(jia)入(ru)(ru)可熱(re)滅(mie)活的(de)聚(ju)合(he)(he)酶。在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)一些(xie)情(qing)況下(xia)(xia)，在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)加(jia)入(ru)(ru)可熱(re)滅(mie)活的(de)聚(ju)合(he)(he)酶之后，在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)低(di)于(yu)PCR引(yin)物(wu)的(de)Tm的(de)溫(wen)(wen)度(du)(du)(du)和高于(yu)PCR引(yin)物(wu)的(de)Tm的(de)溫(wen)(wen)度(du)(du)(du)之間，例如(ru)在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)58℃-67℃的(de)溫(wen)(wen)度(du)(du)(du)進行熱(re)循環。在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)一些(xie)情(qing)況下(xia)(xia)，熱(re)循環可以包括10-30個(ge)循環。在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)具體(ti)(ti)實施(shi)方案(an)中，對聚(ju)合(he)(he)酶進行熱(re)滅(mie)活，隨后加(jia)入(ru)(ru)限制(zhi)性內(nei)切核酸酶。

在一(yi)些(xie)實(shi)(shi)施方(fang)(fang)(fang)案中(zhong)，對(dui)有(you)引物(wu)退火(huo)的核(he)酸模板進(jin)(jin)行三至十(shi)個(ge)連續的延伸、解鏈和退火(huo)步(bu)驟(zou)。在某些(xie)方(fang)(fang)(fang)面，限制性(xing)(xing)內切核(he)酸酶(mei)能夠(gou)在超過50℃的溫(wen)度下消化(hua)核(he)酸，例如(ru)BtsCI/BseGI。在某些(xie)實(shi)(shi)施方(fang)(fang)(fang)案中(zhong)，通過聚合酶(mei)鏈反應(PCR)或環介(jie)導的等溫(wen)擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)(LAMP)對(dui)線(xian)(xian)性(xing)(xing)產生的全擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)子(zi)進(jin)(jin)行擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)。在具體實(shi)(shi)施方(fang)(fang)(fang)案中(zhong)，至少大多數線(xian)(xian)性(xing)(xing)產生的全擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)子(zi)是彼(bi)此分(fen)開的。在特(te)定方(fang)(fang)(fang)面，至少大多數線(xian)(xian)性(xing)(xing)產生的全擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)子(zi)各(ge)自被置于分(fen)開的容器中(zhong)，例如(ru)微孔(kong)基底(di)的孔(kong)中(zhong)。在某些(xie)實(shi)(shi)施方(fang)(fang)(fang)案中(zhong)，這些(xie)孔(kong)包含一(yi)種(zhong)或多種(zhong)擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)反應試劑。

在(zai)(zai)(zai)具(ju)體實施方(fang)(fang)案(an)中(zhong)，對(dui)分開包(bao)含(han)的(de)(de)擴(kuo)增(zeng)(zeng)子(zi)進(jin)(jin)行(xing)擴(kuo)增(zeng)(zeng)，例如進(jin)(jin)行(xing)PCR或(huo)(huo)(huo)LAMP。在(zai)(zai)(zai)一(yi)些(xie)實施方(fang)(fang)案(an)中(zhong)，對(dui)線(xian)性產(chan)生(sheng)的(de)(de)全(quan)擴(kuo)增(zeng)(zeng)子(zi)經(jing)受尿嘧(mi)啶-DNA-糖基化酶(mei)和DNA糖基化酶(mei)-裂解(jie)酶(mei)內切(qie)核(he)(he)酸(suan)酶(mei)VIII混合物的(de)(de)作用(yong)，然后經(jing)受S1核(he)(he)酸(suan)酶(mei)或(huo)(huo)(huo)T4聚合酶(mei)的(de)(de)作用(yong)。在(zai)(zai)(zai)具(ju)體實施方(fang)(fang)案(an)中(zhong)，對(dui)線(xian)性產(chan)生(sheng)的(de)(de)全(quan)擴(kuo)增(zeng)(zeng)子(zi)進(jin)(jin)行(xing)測(ce)序或(huo)(huo)(huo)進(jin)(jin)行(xing)文庫(ku)構建(jian)。在(zai)(zai)(zai)具(ju)體實施方(fang)(fang)案(an)中(zhong)，測(ce)定(ding)一(yi)個(ge)(ge)(ge)或(huo)(huo)(huo)多(duo)個(ge)(ge)(ge)線(xian)性產(chan)生(sheng)的(de)(de)全(quan)擴(kuo)增(zeng)(zeng)子(zi)的(de)(de)某個(ge)(ge)(ge)核(he)(he)苷酸(suan)或(huo)(huo)(huo)核(he)(he)苷酸(suan)序列，例如代表核(he)(he)酸(suan)突(tu)變的(de)(de)擴(kuo)增(zeng)(zeng)子(zi)中(zhong)突(tu)變。在(zai)(zai)(zai)具(ju)體實施方(fang)(fang)案(an)中(zhong)，所(suo)(suo)(suo)述突(tu)變是(shi)疾病相(xiang)關突(tu)變。在(zai)(zai)(zai)具(ju)體實施方(fang)(fang)案(an)中(zhong)，所(suo)(suo)(suo)述一(yi)個(ge)(ge)(ge)或(huo)(huo)(huo)多(duo)個(ge)(ge)(ge)細(xi)胞來(lai)自胎兒、嬰兒、兒童或(huo)(huo)(huo)成人。所(suo)(suo)(suo)述一(yi)個(ge)(ge)(ge)或(huo)(huo)(huo)多(duo)個(ge)(ge)(ge)細(xi)胞可以固(gu)定(ding)于(yu)組織學制(zhi)備物中(zhong)。然而(er)，在(zai)(zai)(zai)一(yi)些(xie)情(qing)(qing)況(kuang)下，所(suo)(suo)(suo)述一(yi)個(ge)(ge)(ge)或(huo)(huo)(huo)多(duo)個(ge)(ge)(ge)細(xi)胞是(shi)新鮮的(de)(de)。所(suo)(suo)(suo)述一(yi)個(ge)(ge)(ge)或(huo)(huo)(huo)多(duo)個(ge)(ge)(ge)細(xi)胞可以從(cong)具(ju)有醫(yi)學病況(kuang)或(huo)(huo)(huo)懷疑患醫(yi)學病況(kuang)(例如遺傳性疾病)的(de)(de)個(ge)(ge)(ge)體獲得。在(zai)(zai)(zai)特定(ding)情(qing)(qing)況(kuang)下，所(suo)(suo)(suo)述醫(yi)學病況(kuang)包(bao)括癌癥。

在(zai)一(yi)個(ge)(ge)(ge)實(shi)(shi)施(shi)(shi)方(fang)(fang)案(an)(an)中(zhong)(zhong)，一(yi)種方(fang)(fang)法測定(ding)(ding)來(lai)(lai)(lai)自個(ge)(ge)(ge)體的(de)(de)核(he)(he)(he)酸(suan)(suan)從而鑒定(ding)(ding)個(ge)(ge)(ge)體的(de)(de)醫(yi)學病(bing)況(kuang)(kuang)(kuang)或(huo)鑒定(ding)(ding)個(ge)(ge)(ge)體具(ju)有所述(shu)醫(yi)學病(bing)況(kuang)(kuang)(kuang)的(de)(de)風險(xian)，包(bao)括(kuo)將通過本公開的(de)(de)方(fang)(fang)法從個(ge)(ge)(ge)體樣品(pin)所得的(de)(de)線性產(chan)(chan)生(sheng)的(de)(de)全(quan)擴(kuo)(kuo)增(zeng)子(zi)的(de)(de)部(bu)(bu)分或(huo)全(quan)部(bu)(bu)序列與標準(zhun)品(pin)進(jin)行比對的(de)(de)步(bu)驟。在(zai)具(ju)體實(shi)(shi)施(shi)(shi)方(fang)(fang)案(an)(an)中(zhong)(zhong)，所述(shu)核(he)(he)(he)酸(suan)(suan)包(bao)括(kuo)基(ji)(ji)因組DNA。在(zai)一(yi)些情況(kuang)(kuang)(kuang)下，所述(shu)核(he)(he)(he)酸(suan)(suan)包(bao)括(kuo)從來(lai)(lai)(lai)自樣品(pin)的(de)(de)RNA產(chan)(chan)生(sheng)的(de)(de)cDNA。標準(zhun)品(pin)可以(yi)(yi)包(bao)含來(lai)(lai)(lai)自個(ge)(ge)(ge)體正(zheng)常(chang)細(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)核(he)(he)(he)酸(suan)(suan)，例如來(lai)(lai)(lai)自一(yi)個(ge)(ge)(ge)或(huo)多個(ge)(ge)(ge)其他個(ge)(ge)(ge)體的(de)(de)正(zheng)常(chang)細(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)核(he)(he)(he)酸(suan)(suan)。在(zai)具(ju)體實(shi)(shi)施(shi)(shi)方(fang)(fang)案(an)(an)中(zhong)(zhong)，來(lai)(lai)(lai)自個(ge)(ge)(ge)體樣品(pin)中(zhong)(zhong)的(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)中(zhong)(zhong)核(he)(he)(he)酸(suan)(suan)的(de)(de)表(biao)達水平以(yi)(yi)線性產(chan)(chan)生(sheng)的(de)(de)全(quan)擴(kuo)(kuo)增(zeng)子(zi)的(de)(de)數目表(biao)示(shi)。在(zai)一(yi)些情況(kuang)(kuang)(kuang)下，比較步(bu)驟包(bao)括(kuo)將來(lai)(lai)(lai)自個(ge)(ge)(ge)體樣品(pin)中(zhong)(zhong)的(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)至少一(yi)些線性產(chan)(chan)生(sheng)的(de)(de)全(quan)擴(kuo)(kuo)增(zeng)子(zi)的(de)(de)數目與標準(zhun)品(pin)進(jin)行比較。在(zai)具(ju)體實(shi)(shi)施(shi)(shi)方(fang)(fang)案(an)(an)中(zhong)(zhong)，所述(shu)至少一(yi)些線性產(chan)(chan)生(sheng)的(de)(de)全(quan)擴(kuo)(kuo)增(zeng)子(zi)包(bao)含一(yi)個(ge)(ge)(ge)或(huo)多個(ge)(ge)(ge)具(ju)體基(ji)(ji)因。在(zai)某些實(shi)(shi)施(shi)(shi)方(fang)(fang)案(an)(an)中(zhong)(zhong)，比較步(bu)驟包(bao)括(kuo)測定(ding)(ding)線性產(chan)(chan)生(sheng)的(de)(de)全(quan)擴(kuo)(kuo)增(zeng)子(zi)與標準(zhun)品(pin)相比其中(zhong)(zhong)一(yi)種或(huo)多種特定(ding)(ding)核(he)(he)(he)苷酸(suan)(suan)是否(fou)存在(zai)

前文(wen)(wen)已經相當(dang)廣(guang)泛(fan)地(di)概述(shu)(shu)了本(ben)(ben)(ben)發(fa)(fa)明(ming)(ming)(ming)的(de)(de)(de)(de)特(te)征和(he)(he)(he)技(ji)術優勢，以便可(ke)(ke)以更好地(di)理解(jie)下(xia)文(wen)(wen)對本(ben)(ben)(ben)發(fa)(fa)明(ming)(ming)(ming)的(de)(de)(de)(de)詳(xiang)細描(miao)述(shu)(shu)。下(xia)文(wen)(wen)將描(miao)述(shu)(shu)形(xing)成本(ben)(ben)(ben)發(fa)(fa)明(ming)(ming)(ming)權利要求的(de)(de)(de)(de)主(zhu)題的(de)(de)(de)(de)本(ben)(ben)(ben)發(fa)(fa)明(ming)(ming)(ming)的(de)(de)(de)(de)附(fu)加特(te)征和(he)(he)(he)優勢。本(ben)(ben)(ben)領(ling)域技(ji)術人(ren)員應當(dang)理解(jie)，所公開的(de)(de)(de)(de)概念和(he)(he)(he)具體實施方式可(ke)(ke)以容易地(di)用作修改或設計用于實現本(ben)(ben)(ben)發(fa)(fa)明(ming)(ming)(ming)的(de)(de)(de)(de)相同(tong)目的(de)(de)(de)(de)的(de)(de)(de)(de)其(qi)他結(jie)構的(de)(de)(de)(de)基礎。本(ben)(ben)(ben)領(ling)域技(ji)術人(ren)員還應該認識到，這樣的(de)(de)(de)(de)等價的(de)(de)(de)(de)構建不(bu)脫(tuo)離如所附(fu)權利要求中闡述(shu)(shu)的(de)(de)(de)(de)本(ben)(ben)(ben)發(fa)(fa)明(ming)(ming)(ming)的(de)(de)(de)(de)精神和(he)(he)(he)范圍。被認為是(shi)本(ben)(ben)(ben)發(fa)(fa)明(ming)(ming)(ming)特(te)征的(de)(de)(de)(de)新(xin)穎特(te)征當(dang)結(jie)合(he)附(fu)圖考慮(lv)時，將從下(xia)面的(de)(de)(de)(de)描(miao)述(shu)(shu)中更好地(di)得到理解(jie)，包括其(qi)組(zu)織(zhi)和(he)(he)(he)操作方法，以及進(jin)一步(bu)的(de)(de)(de)(de)目的(de)(de)(de)(de)和(he)(he)(he)優點。然而(er)，應當(dang)清(qing)楚地(di)理解(jie)，每個(ge)附(fu)圖僅(jin)僅(jin)是(shi)為了說明(ming)(ming)(ming)和(he)(he)(he)描(miao)述(shu)(shu)的(de)(de)(de)(de)目的(de)(de)(de)(de)，而(er)不(bu)旨(zhi)在作為限制本(ben)(ben)(ben)發(fa)(fa)明(ming)(ming)(ming)的(de)(de)(de)(de)定義。

附圖簡述

為了更完全地理解(jie)本發明，參(can)考以(yi)下結合附圖的描述，其中(zhong)：

圖(tu)1示例顯示了一種已知的(de)(de)(de)稱為(wei)基于(yu)(yu)多重(zhong)(zhong)退火(huo)和成環(huan)(huan)的(de)(de)(de)擴增(zeng)(zeng)(zeng)(zeng)循(xun)(xun)環(huan)(huan)(MALBAC)的(de)(de)(de)擴增(zeng)(zeng)(zeng)(zeng)形式。低偏(pian)差單(dan)細胞全(quan)基因(yin)(yin)組(zu)擴增(zeng)(zeng)(zeng)(zeng)(WGA)。(左)MALBAC工作(zuo)流程。將基因(yin)(yin)組(zu)DNA解鏈為(wei)單(dan)鏈DNA分子后，裂解單(dan)細胞。在附加的(de)(de)(de)PCR擴增(zeng)(zeng)(zeng)(zeng)前進行MALBAC預擴增(zeng)(zeng)(zeng)(zeng)。首(shou)先，MALBAC引(yin)物隨機退火(huo)于(yu)(yu)單(dan)鏈DNA分子上，并由具有(you)置換活性的(de)(de)(de)聚合(he)酶(mei)延伸，產生(sheng)半擴增(zeng)(zeng)(zeng)(zeng)子。在下一個循(xun)(xun)環(huan)(huan)中，生(sheng)成兩(liang)端都具有(you)互(hu)補(bu)(bu)序列的(de)(de)(de)單(dan)鏈擴增(zeng)(zeng)(zeng)(zeng)子。3'末端在中等溫(wen)度下通(tong)過形成環(huan)(huan)而得到保護，這防止嵌合(he)體的(de)(de)(de)形成和進一步的(de)(de)(de)擴增(zeng)(zeng)(zeng)(zeng)。將上述(shu)循(xun)(xun)環(huan)(huan)重(zhong)(zhong)復5次以(yi)產生(sheng)具有(you)重(zhong)(zhong)疊基因(yin)(yin)組(zu)覆(fu)蓋的(de)(de)(de)擴增(zeng)(zeng)(zeng)(zeng)子，其在兩(liang)端都含有(you)通(tong)用(yong)互(hu)補(bu)(bu)序列用(yong)于(yu)(yu)隨后的(de)(de)(de)PCR擴增(zeng)(zeng)(zeng)(zeng)；

圖2提供了本發(fa)明擴(kuo)(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)方案的(de)(de)一個實施方案的(de)(de)概況。在該方案中，不使用(yong)在MALBAC中產(chan)生(sheng)(sheng)的(de)(de)全擴(kuo)(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)子(zi)(zi)(zi)(zi)用(yong)于PCR擴(kuo)(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)。相反，例如(ru)(ru)通過消化移除成(cheng)環(huan)的(de)(de)全擴(kuo)(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)子(zi)(zi)(zi)(zi)的(de)(de)引(yin)物序列。之后(hou)，可以(yi)對于從原始基因組模板線性產(chan)生(sheng)(sheng)的(de)(de)半擴(kuo)(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)子(zi)(zi)(zi)(zi)線性地再產(chan)生(sheng)(sheng)全擴(kuo)(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)子(zi)(zi)(zi)(zi)。這種完全線性擴(kuo)(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)的(de)(de)全擴(kuo)(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)子(zi)(zi)(zi)(zi)用(yong)于下列PCR擴(kuo)(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)，例如(ru)(ru)；

圖3示出條(tiao)形(xing)碼(ma)測序(xu)的(de)(de)(de)(de)概況。測序(xu)的(de)(de)(de)(de)讀數是(shi)(shi)對齊的(de)(de)(de)(de)。有兩種可(ke)能(neng)的(de)(de)(de)(de)雜合子突(tu)(tu)變(bian)(bian)，由(you)紅色和(he)(he)藍(lan)(lan)色點(dian)(在黑白圖中，它們分別是(shi)(shi)各(ge)欄中左邊和(he)(he)右邊的(de)(de)(de)(de)點(dian))表(biao)示。在左側(ce)，測序(xu)讀數不具有條(tiao)形(xing)碼(ma)，因此得(de)到兩種突(tu)(tu)變(bian)(bian)。相(xiang)比(bi)較，右側(ce)的(de)(de)(de)(de)測序(xu)讀出具有條(tiao)形(xing)碼(ma)α、β、γ和(he)(he)ζ，其代表(biao)在線性擴增中生成的(de)(de)(de)(de)獨立DNA拷貝。顯然，相(xiang)比(bi)于(yu)由(you)藍(lan)(lan)色點(dian)標(biao)記(ji)的(de)(de)(de)(de)突(tu)(tu)變(bian)(bian)(由(you)具有兩個不同條(tiao)形(xing)碼(ma)的(de)(de)(de)(de)讀數表(biao)示)，由(you)紅色點(dian)標(biao)記(ji)的(de)(de)(de)(de)突(tu)(tu)變(bian)(bian)是(shi)(shi)明顯的(de)(de)(de)(de)假陽性(由(you)僅(jin)有一個條(tiao)形(xing)碼(ma)的(de)(de)(de)(de)讀數表(biao)示)；

圖4示出了(le)線性產生半擴增子的實例。

圖5示出了(le)線性產生(sheng)全擴(kuo)增子的實例。

圖6提供(gong)了微滴或(huo)孔中全基因組擴增的實例。

圖(tu)7展示了使用具體酶在引物中移除引物序列。

圖8：早期腫瘤發展概況。在(zai)前體中，可以(yi)預(yu)期突變(bian)數(shu)目有限。在(zai)發育不(bu)良中，可以(yi)預(yu)期，與瘤形成相比，細胞積累了顯著數(shu)量的突變(bian)和高(gao)程(cheng)度(du)的基因組異質性(xing)。

圖(tu)9：產率和(he)擴(kuo)(kuo)增(zeng)循(xun)環(huan)數(shu)之間(jian)的(de)線性關系(xi)(xi)。該數(shu)據表明線性擴(kuo)(kuo)增(zeng)的(de)成(cheng)功(gong)。x軸(zhou)表示(shi)預擴(kuo)(kuo)增(zeng)循(xun)環(huan)數(shu)。y軸(zhou)表示(shi)qPCR測量的(de)擴(kuo)(kuo)增(zeng)子產率。線性關系(xi)(xi)確認達到了線性擴(kuo)(kuo)增(zeng)。實驗(yan)步驟(zou)按照實施例1中的(de)描述進(jin)行。

圖10：該圖表示(shi)(shi)例(li)(li)顯示(shi)(shi)了線性擴(kuo)(kuo)(kuo)增后的(de)(de)(de)(de)步(bu)驟的(de)(de)(de)(de)實例(li)(li)。線性產生(sheng)的(de)(de)(de)(de)DNA半擴(kuo)(kuo)(kuo)增子(zi)或全擴(kuo)(kuo)(kuo)增子(zi)被分到(dao)多個(ge)管中。因此在(zai)不同管中擴(kuo)(kuo)(kuo)增獨立的(de)(de)(de)(de)線性拷貝。使用來自各個(ge)管的(de)(de)(de)(de)擴(kuo)(kuo)(kuo)增DNA構建測序(xu)文庫(ku)，并用下(xia)一代(dai)測序(xu)儀進行測序(xu)。下(xia)圖示(shi)(shi)出(chu)測序(xu)數據(ju)的(de)(de)(de)(de)快照結果。可(ke)以看到(dao)各個(ge)染色體間都有類似的(de)(de)(de)(de)平均覆蓋(gai)。該數據(ju)包括六個(ge)文庫(ku)，其由線性擴(kuo)(kuo)(kuo)增的(de)(de)(de)(de)擴(kuo)(kuo)(kuo)增子(zi)分入的(de)(de)(de)(de)16管中的(de)(de)(de)(de)6個(ge)而構建。

圖(tu)11：下一代測(ce)(ce)序結果表(biao)明線性擴增(zeng)允許(xu)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)到生殖系(xi)/體細(xi)胞突變(bian)(bian)并(bing)鑒定出擴增(zeng)錯(cuo)誤。對其作圖(tu)示(shi)出了(le)來自測(ce)(ce)序實驗的(de)讀數，如圖(tu)10中(zhong)(zhong)(zhong)所描述。真突變(bian)(bian)和(he)假陽性讀數的(de)典型形式在作圖(tu)中(zhong)(zhong)(zhong)表(biao)示(shi)。右圖(tu)中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)突變(bian)(bian)顯示(shi)在與已有數據庫相比而測(ce)(ce)序的(de)細(xi)胞中(zhong)(zhong)(zhong)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)到從頭開始的(de)突變(bian)(bian)。

發明詳述

I.定義

如本文所使用的，術語“半(ban)擴(kuo)增子”指代僅在(zai)一個末端由(you)引物序列延伸而(er)生(sheng)成的多核苷酸。其(qi)是全擴(kuo)增子的半(ban)產物。

如本(ben)文(wen)所使用的，術語“擴增子”指代用作(zuo)PCR反應中模(mo)板的多核苷酸。

如(ru)本文所使(shi)用的，術語“全擴增子”指(zhi)代在兩(liang)個末端(duan)都(dou)有(彼此不同或互補(bu))的引(yin)物序列，容易進行PCR擴增。

如(ru)本文所使用(yong)的(de)，術語(yu)“線(xian)性擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)”表(biao)示(shi)直(zhi)接從原始(shi)模(mo)板拷(kao)(kao)貝(bei)的(de)擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)產(chan)(chan)(chan)物(wu)(wu)，所以DNA產(chan)(chan)(chan)物(wu)(wu)的(de)增(zeng)(zeng)(zeng)加是線(xian)性的(de)。相反，對于非線(xian)性擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)，產(chan)(chan)(chan)物(wu)(wu)拷(kao)(kao)貝(bei)自原始(shi)模(mo)板和拷(kao)(kao)貝(bei)而來的(de)產(chan)(chan)(chan)物(wu)(wu)二者。例(li)如(ru)PCR反應就是一(yi)種典型的(de)非線(xian)性擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)，其中(zhong)產(chan)(chan)(chan)物(wu)(wu)以指數形式增(zeng)(zeng)(zeng)加。在(zai)特(te)(te)定(ding)(ding)(ding)方面，特(te)(te)定(ding)(ding)(ding)模(mo)板的(de)線(xian)性擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)被限定(ding)(ding)(ding)為大(da)量(liang)的(de)模(mo)板拷(kao)(kao)貝(bei)中(zhong)的(de)每份(fen)(或大(da)部分)特(te)(te)定(ding)(ding)(ding)模(mo)板的(de)拷(kao)(kao)貝(bei)都是由該特(te)(te)定(ding)(ding)(ding)模(mo)板直(zhi)接產(chan)(chan)(chan)生(sheng)。在(zai)特(te)(te)定(ding)(ding)(ding)模(mo)板的(de)非線(xian)性擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)中(zhong)，模(mo)板的(de)拷(kao)(kao)貝(bei)可由特(te)(te)定(ding)(ding)(ding)模(mo)板的(de)另(ling)一(yi)份(fen)拷(kao)(kao)貝(bei)產(chan)(chan)(chan)生(sheng)。

II.通用實施方案

本(ben)公(gong)開(kai)的(de)實施方(fang)案提供了用于從(cong)(cong)一(yi)個(ge)或多個(ge)細胞中(zhong)擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)部(bu)(bu)(bu)分(fen)(fen)或全(quan)(quan)部(bu)(bu)(bu)核(he)酸(suan)的(de)擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)方(fang)法(fa)(fa)。在(zai)具(ju)體方(fang)面，所述核(he)酸(suan)是細胞的(de)部(bu)(bu)(bu)分(fen)(fen)或全(quan)(quan)部(bu)(bu)(bu)基因(yin)組(zu)或者細胞的(de)部(bu)(bu)(bu)分(fen)(fen)或全(quan)(quan)部(bu)(bu)(bu)mRNA，由逆轉錄自mRNA的(de)cDNA表示。這些(xie)擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)方(fang)法(fa)(fa)生(sheng)成(cheng)線(xian)性(xing)(xing)(xing)產(chan)生(sheng)的(de)半擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)子和(he)非線(xian)性(xing)(xing)(xing)產(chan)生(sheng)的(de)全(quan)(quan)擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)子，隨后(hou)非線(xian)性(xing)(xing)(xing)產(chan)生(sheng)的(de)全(quan)(quan)擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)子幾乎都用生(sheng)物素化的(de)PCR引(yin)物轉化為雙鏈(lian)DNA，然后(hou)通(tong)(tong)過(guo)鏈(lian)霉親和(he)素磁珠反應提取，或在(zai)方(fang)法(fa)(fa)的(de)隨后(hou)步(bu)驟中(zhong)有效地(di)(di)從(cong)(cong)沉淀物中(zhong)移除(例如(ru)(ru)通(tong)(tong)過(guo)使其不能(neng)由具(ju)體一(yi)組(zu)引(yin)物退火)，其后(hou)線(xian)性(xing)(xing)(xing)產(chan)生(sheng)的(de)半擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)子經(jing)過(guo)退火和(he)延伸步(bu)驟，而(er)不經(jing)過(guo)解(jie)鏈(lian)步(bu)驟，從(cong)(cong)而(er)產(chan)生(sheng)線(xian)性(xing)(xing)(xing)產(chan)生(sheng)的(de)全(quan)(quan)擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)子。然后(hou)任選地(di)(di)解(jie)鏈(lian)所述線(xian)性(xing)(xing)(xing)產(chan)生(sheng)的(de)全(quan)(quan)擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)子并(bing)進行其他方(fang)法(fa)(fa)，如(ru)(ru)線(xian)性(xing)(xing)(xing)或非線(xian)性(xing)(xing)(xing)擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)(例如(ru)(ru)通(tong)(tong)過(guo)PCR)。

根(gen)據本公開的某(mou)些方面(mian)，反應(ying)混合(he)物(wu)中來自單細(xi)(xi)胞(bao)或多個細(xi)(xi)胞(bao)的DNA由至(zhi)少一(yi)種DNA聚合(he)酶進行擴增。

根據一(yi)個(ge)方面，單(dan)細胞核(he)(he)酸(suan)擴(kuo)增(zeng)或(huo)(huo)多個(ge)細胞核(he)(he)酸(suan)擴(kuo)增(zeng)之(zhi)前(qian)將來自樣品的雙鏈(lian)(lian)(lian)DNA變(bian)性(xing)至(zhi)允(yun)許(xu)引物退火于(yu)DNA的單(dan)鏈(lian)(lian)(lian)狀態(tai)。隨后，反(fan)應溫度降低至(zhi)允(yun)許(xu)第(di)一(yi)種引物3’末(mo)端(duan)隨機核(he)(he)苷酸(suan)退火至(zhi)DNA形成雜(za)交(jiao)雙螺(luo)旋的溫度。雜(za)交(jiao)雙螺(luo)旋形成后，在孵育時期內反(fan)應混合物中存在的或(huo)(huo)此時加入的一(yi)種或(huo)(huo)多種DNA聚合酶從(cong)第(di)一(yi)種引物的3’末(mo)端(duan)延伸互補DNA鏈(lian)(lian)(lian)。DNA聚合酶可包(bao)含(han)或(huo)(huo)不含(han)5’-3’外(wai)切核(he)(he)酸(suan)酶活性(xing)或(huo)(huo)鏈(lian)(lian)(lian)置換活性(xing)。

圖1示出一(yi)(yi)種(zhong)稱為MALBAC的(de)(de)(de)(de)在(zai)先技術方法的(de)(de)(de)(de)概況，本(ben)發明是(shi)對其(qi)(qi)的(de)(de)(de)(de)改(gai)進(jin)(jin)。裂解(jie)單(dan)細胞，接著將(jiang)基(ji)因組DNA解(jie)鏈(lian)(lian)成(cheng)(cheng)單(dan)鏈(lian)(lian)DNA分(fen)(fen)子。在(zai)附加的(de)(de)(de)(de)PCR擴(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)前進(jin)(jin)行MALBAC預擴(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)。首先，MALBAC引物隨(sui)機退火至單(dan)鏈(lian)(lian)DNA分(fen)(fen)子上(shang)并由具有(you)置(zhi)換活性的(de)(de)(de)(de)聚合(he)酶進(jin)(jin)行延伸，形(xing)成(cheng)(cheng)半擴(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)子。在(zai)下一(yi)(yi)個(ge)循環(huan)，生(sheng)成(cheng)(cheng)兩端(duan)都(dou)有(you)互(hu)補序列的(de)(de)(de)(de)單(dan)鏈(lian)(lian)擴(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)子。3'末(mo)端(duan)在(zai)中等溫度下通過形(xing)成(cheng)(cheng)環(huan)而得(de)到(dao)保護，這防止嵌合(he)體的(de)(de)(de)(de)形(xing)成(cheng)(cheng)和進(jin)(jin)一(yi)(yi)步的(de)(de)(de)(de)擴(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)。將(jiang)上(shang)述循環(huan)重(zhong)(zhong)復約(例如)5次以(yi)產生(sheng)具有(you)重(zhong)(zhong)疊基(ji)因組覆蓋(gai)的(de)(de)(de)(de)擴(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)子，其(qi)(qi)在(zai)兩端(duan)都(dou)含有(you)通用互(hu)補序列用于隨(sui)后(hou)的(de)(de)(de)(de)PCR擴(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)。

本領(ling)域的(de)MALBAC預(yu)(yu)擴(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)不是(shi)完全線性的(de)。在MALBAC預(yu)(yu)擴(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)中(zhong)，半(ban)擴(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)子(zi)(zi)(zi)直(zhi)接(jie)拷貝自原始(shi)DNA模板，因(yin)此其是(shi)線性產(chan)生的(de)。然而(er)，半(ban)擴(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)子(zi)(zi)(zi)在接(jie)下來的(de)擴(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)循(xun)(xun)(xun)環(huan)中(zhong)被(bei)(bei)用作模板。例如(ru)，在第(di)一個(ge)(ge)(ge)(ge)循(xun)(xun)(xun)環(huan)中(zhong)產(chan)生的(de)半(ban)擴(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)子(zi)(zi)(zi)被(bei)(bei)用于接(jie)下來的(de)五個(ge)(ge)(ge)(ge)循(xun)(xun)(xun)環(huan)中(zhong)；在第(di)二(er)個(ge)(ge)(ge)(ge)循(xun)(xun)(xun)環(huan)中(zhong)產(chan)生的(de)半(ban)擴(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)子(zi)(zi)(zi)被(bei)(bei)用于接(jie)下來的(de)四(si)個(ge)(ge)(ge)(ge)循(xun)(xun)(xun)環(huan)中(zhong)，等(deng)等(deng)。在擴(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)旗(qi)艦，如(ru)果(guo)聚合酶在第(di)一個(ge)(ge)(ge)(ge)循(xun)(xun)(xun)環(huan)中(zhong)在半(ban)擴(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)子(zi)(zi)(zi)中(zhong)產(chan)生錯(cuo)誤，錯(cuo)誤便在接(jie)下來的(de)擴(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)循(xun)(xun)(xun)環(huan)中(zhong)拷貝五次。由(you)于這個(ge)(ge)(ge)(ge)擴(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)錯(cuo)誤占(zhan)據最終讀數中(zhong)的(de)30％，因(yin)此其可能被(bei)(bei)認為(wei)是(shi)突變。因(yin)此，需(xu)要測序例如(ru)至少三個(ge)(ge)(ge)(ge)親緣細胞得到精確的(de)單個(ge)(ge)(ge)(ge)核苷酸變體(SNV)結果(guo)。

為了(le)(le)克服這(zhe)種技術上產(chan)生(sheng)的(de)(de)變化(hua)性(xing)，本公(gong)開的(de)(de)實(shi)施(shi)方案提供了(le)(le)實(shi)現真正的(de)(de)線性(xing)預擴(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)增(zeng)的(de)(de)新(xin)過(guo)程。因(yin)為半擴(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)增(zeng)子(zi)是線性(xing)產(chan)生(sheng)的(de)(de)，所以(yi)(yi)使這(zhe)些(xie)半擴(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)增(zeng)子(zi)線性(xing)地無失(shi)真地拷貝為全擴(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)增(zeng)子(zi)是有用(yong)(yong)的(de)(de)。其實(shi)現后將(jiang)提供完全線性(xing)的(de)(de)擴(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)增(zeng)方案。為了(le)(le)實(shi)現該目的(de)(de)，本公(gong)開的(de)(de)實(shi)施(shi)方案包(bao)括圖(tu)2所示(shi)的(de)(de)內(nei)容；預擴(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)增(zeng)后，不采取(qu)(例如)下游(you)PCR擴(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)增(zeng)，可以(yi)(yi)使用(yong)(yong)合適的(de)(de)限制(zhi)酶切割成環的(de)(de)全擴(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)增(zeng)子(zi)中的(de)(de)引(yin)物(wu)序列區(qu)域。也可以(yi)(yi)用(yong)(yong)生(sheng)物(wu)素化(hua)的(de)(de)PCR引(yin)物(wu)將(jiang)全擴(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)增(zeng)子(zi)轉(zhuan)化(hua)為雙鏈(lian)DNA，然后通過(guo)鏈(lian)霉親和(he)素磁珠從反應中提取(qu)。同時，單鏈(lian)的(de)(de)半擴(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)增(zeng)子(zi)保持完整。在(zai)隨后的(de)(de)步(bu)驟(zou)中，可以(yi)(yi)滅活限制(zhi)酶，并立即由半擴(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)增(zeng)子(zi)重新(xin)產(chan)生(sheng)新(xin)的(de)(de)全擴(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)增(zeng)子(zi)以(yi)(yi)保證線性(xing)代表(圖(tu)2)。可以(yi)(yi)通過(guo)一輪或(huo)多輪退火和(he)延伸(shen)步(bu)驟(zou)再產(chan)生(sheng)全擴(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)增(zeng)子(zi)。或(huo)者，半擴(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)增(zeng)子(zi)可以(yi)(yi)有尾巴，并且(qie)尾部區(qu)域可以(yi)(yi)與新(xin)的(de)(de)引(yin)物(wu)雜交(jiao)以(yi)(yi)產(chan)生(sheng)全擴(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)(kuo)增(zeng)子(zi)。

因此，本發明的(de)(de)(de)(de)實(shi)施方(fang)(fang)案包(bao)括(kuo)從一(yi)(yi)個或(huo)(huo)多(duo)個細(xi)胞線(xian)性(xing)擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)核(he)(he)酸(suan)的(de)(de)(de)(de)方(fang)(fang)法(fa)(fa)。所(suo)(suo)述(shu)(shu)方(fang)(fang)法(fa)(fa)在(zai)一(yi)(yi)些(xie)方(fang)(fang)面由(you)(you)提供(gong)的(de)(de)(de)(de)核(he)(he)酸(suan)樣(yang)品開始，盡管在(zai)一(yi)(yi)些(xie)情況(kuang)下(xia)(xia)(xia)所(suo)(suo)述(shu)(shu)核(he)(he)酸(suan)必須(例如通(tong)過(guo)常規方(fang)(fang)法(fa)(fa))獲自所(suo)(suo)述(shu)(shu)細(xi)胞。在(zai)擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)DNA時，將(jiang)從細(xi)胞提取的(de)(de)(de)(de)全(quan)(quan)部核(he)(he)酸(suan)經(jing)由(you)(you)RNA酶(mei)(mei)處(chu)理(li)。當擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)(以來自mRNA的(de)(de)(de)(de)cDNA形(xing)式的(de)(de)(de)(de))轉錄組時，將(jiang)所(suo)(suo)述(shu)(shu)全(quan)(quan)部核(he)(he)酸(suan)在(zai)mRNA的(de)(de)(de)(de)逆轉錄之前經(jing)由(you)(you)DNA酶(mei)(mei)處(chu)理(li)。來自一(yi)(yi)個或(huo)(huo)多(duo)個細(xi)胞的(de)(de)(de)(de)核(he)(he)酸(suan)與第(di)一(yi)(yi)大(da)量(liang)(liang)(liang)引(yin)(yin)物(wu)接觸(chu)且(qie)所(suo)(suo)述(shu)(shu)細(xi)胞還與包(bao)含(han)(han)(han)鏈置換活性(xing)的(de)(de)(de)(de)聚(ju)合(he)(he)(he)酶(mei)(mei)接觸(chu)；這(zhe)一(yi)(yi)步(bu)驟例如在(zai)溫度(du)范圍0℃至(zhi)約30℃的(de)(de)(de)(de)條件下(xia)(xia)(xia)發生(sheng)(sheng)。在(zai)這(zhe)一(yi)(yi)步(bu)驟中，引(yin)(yin)物(wu)與核(he)(he)酸(suan)退(tui)火(huo)，且(qie)引(yin)(yin)物(wu)通(tong)過(guo)聚(ju)合(he)(he)(he)酶(mei)(mei)得到延伸(shen)(shen)。在(zai)特定(ding)實(shi)施方(fang)(fang)案中，第(di)一(yi)(yi)大(da)量(liang)(liang)(liang)引(yin)(yin)物(wu)富(fu)含(han)(han)(han)40％-60％的(de)(de)(de)(de)G或(huo)(huo)富(fu)含(han)(han)(han)40％-60％的(de)(de)(de)(de)C并且(qie)還包(bao)含(han)(han)(han)限制(zhi)性(xing)內(nei)切核(he)(he)酸(suan)酶(mei)(mei)位點(dian)。當引(yin)(yin)物(wu)接觸(chu)核(he)(he)酸(suan)時，生(sheng)(sheng)成(cheng)包(bao)含(han)(han)(han)引(yin)(yin)物(wu)退(tui)火(huo)的(de)(de)(de)(de)核(he)(he)酸(suan)模(mo)板的(de)(de)(de)(de)混合(he)(he)(he)物(wu)。然后使(shi)引(yin)(yin)物(wu)退(tui)火(huo)的(de)(de)(de)(de)核(he)(he)酸(suan)模(mo)板進(jin)(jin)行兩輪(lun)或(huo)(huo)多(duo)輪(lun)的(de)(de)(de)(de)延伸(shen)(shen)、解(jie)鏈和(he)退(tui)火(huo)步(bu)驟，且(qie)這(zhe)些(xie)步(bu)驟產(chan)生(sheng)(sheng)核(he)(he)酸(suan)模(mo)板、線(xian)性(xing)產(chan)生(sheng)(sheng)的(de)(de)(de)(de)半(ban)(ban)擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)子(zi)(zi)和(he)非線(xian)性(xing)產(chan)生(sheng)(sheng)的(de)(de)(de)(de)全(quan)(quan)擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)子(zi)(zi)的(de)(de)(de)(de)混合(he)(he)(he)物(wu)。將(jiang)所(suo)(suo)述(shu)(shu)混合(he)(he)(he)物(wu)暴露(lu)于使(shi)得全(quan)(quan)擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)子(zi)(zi)的(de)(de)(de)(de)兩個末(mo)端能夠(gou)彼(bi)此退(tui)火(huo)的(de)(de)(de)(de)條件下(xia)(xia)(xia)，從而產(chan)生(sheng)(sheng)成(cheng)環(huan)的(de)(de)(de)(de)全(quan)(quan)擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)子(zi)(zi)。將(jiang)所(suo)(suo)述(shu)(shu)成(cheng)環(huan)的(de)(de)(de)(de)全(quan)(quan)擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)子(zi)(zi)隨后接觸(chu)能夠(gou)消(xiao)化成(cheng)環(huan)的(de)(de)(de)(de)全(quan)(quan)擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)子(zi)(zi)的(de)(de)(de)(de)退(tui)火(huo)末(mo)端的(de)(de)(de)(de)限制(zhi)性(xing)內(nei)切核(he)(he)酸(suan)酶(mei)(mei)。這(zhe)樣(yang)做使(shi)得全(quan)(quan)擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)子(zi)(zi)不再(zai)能夠(gou)由(you)(you)至(zhi)少某些(xie)引(yin)(yin)物(wu)退(tui)火(huo)，包(bao)括(kuo)第(di)一(yi)(yi)大(da)量(liang)(liang)(liang)引(yin)(yin)物(wu)或(huo)(huo)第(di)二(er)(er)批大(da)量(liang)(liang)(liang)引(yin)(yin)物(wu)，其中第(di)二(er)(er)大(da)量(liang)(liang)(liang)引(yin)(yin)物(wu)富(fu)含(han)(han)(han)40％-60％的(de)(de)(de)(de)G或(huo)(huo)C。留(liu)在(zai)混合(he)(he)(he)物(wu)中的(de)(de)(de)(de)線(xian)性(xing)產(chan)生(sheng)(sheng)的(de)(de)(de)(de)半(ban)(ban)擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)子(zi)(zi)可由(you)(you)第(di)一(yi)(yi)大(da)量(liang)(liang)(liang)引(yin)(yin)物(wu)或(huo)(huo)第(di)二(er)(er)批大(da)量(liang)(liang)(liang)引(yin)(yin)物(wu)退(tui)火(huo)并延伸(shen)(shen)。所(suo)(suo)述(shu)(shu)退(tui)火(huo)和(he)延伸(shen)(shen)在(zai)核(he)(he)酸(suan)不會進(jin)(jin)一(yi)(yi)步(bu)解(jie)鏈的(de)(de)(de)(de)情況(kuang)下(xia)(xia)(xia)發生(sheng)(sheng)，由(you)(you)此產(chan)生(sheng)(sheng)線(xian)性(xing)產(chan)生(sheng)(sheng)的(de)(de)(de)(de)全(quan)(quan)擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)子(zi)(zi)。在(zai)一(yi)(yi)些(xie)情況(kuang)下(xia)(xia)(xia)，所(suo)(suo)述(shu)(shu)線(xian)性(xing)產(chan)生(sheng)(sheng)的(de)(de)(de)(de)全(quan)(quan)擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)子(zi)(zi)被進(jin)(jin)一(yi)(yi)步(bu)擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)例如通(tong)過(guo)線(xian)性(xing)或(huo)(huo)者非線(xian)性(xing)方(fang)(fang)法(fa)(fa)，包(bao)括(kuo)例如標準(zhun)PCR方(fang)(fang)法(fa)(fa)。

在本(ben)發明的(de)(de)實施(shi)方(fang)案中，可以實現用于單細胞(bao)全基因組(zu)(或轉錄(lu)組(zu))擴(kuo)增(zeng)的(de)(de)第一個精確線性擴(kuo)增(zeng)方(fang)法(fa)。對(dui)于單細胞(bao)SNV(例(li)如)檢測通過本(ben)創新所達到的(de)(de)靈敏度和(he)(he)精確度，本(ben)公(gong)開的(de)(de)方(fang)法(fa)和(he)(he)組(zu)合物可以在生物學和(he)(he)/或臨床研究(jiu)和(he)(he)用途中產生廣(guang)泛的(de)(de)影響。

在(zai)本公開的(de)實(shi)施(shi)方案中(zhong)，提供了能夠(gou)有效地移除預先(xian)存(cun)在(zai)的(de)引(yin)物(wu)(wu)以允許半擴(kuo)(kuo)增(zeng)子(zi)(zi)的(de)有效加尾的(de)方法。如果引(yin)物(wu)(wu)沒有得到有效消化(hua)，殘留引(yin)物(wu)(wu)的(de)加尾與半擴(kuo)(kuo)增(zeng)子(zi)(zi)的(de)加尾相競爭(zheng)導致(zhi)在(zai)隨后步驟中(zhong)的(de)擴(kuo)(kuo)增(zeng)失敗。因此，在(zai)特定實(shi)施(shi)方案中(zhong)，提供了預先(xian)存(cun)在(zai)的(de)引(yin)物(wu)(wu)的(de)有效消化(hua)，因此實(shi)現了全擴(kuo)(kuo)增(zeng)子(zi)(zi)的(de)成功產生和擴(kuo)(kuo)增(zeng)。

可以(yi)使用T4聚合(he)酶(mei)或在(zai)低(di)(di)于(30℃或更低(di)(di))的(de)低(di)(di)溫下具(ju)有外(wai)(wai)切核(he)酸酶(mei)活性的(de)其它(ta)(ta)聚合(he)酶(mei)和ExoI外(wai)(wai)切核(he)酸酶(mei)或僅消化單(dan)鏈DNA的(de)其它(ta)(ta)外(wai)(wai)切核(he)酸酶(mei)。酶(mei)可以(yi)被加熱滅活。加尾研究可以(yi)用高濃度的(de)C堿(jian)基進行。在(zai)特定實(shi)施方案中，dC加尾的(de)區(qu)域可與GAT5N3G引物雜交(jiao)而僅產生全擴增(zeng)子。

III.條形碼

盡(jin)管圖(tu)(tu)2的(de)方(fang)案示(shi)意(yi)線(xian)性(xing)的(de)，在(zai)(zai)(zai)一(yi)(yi)些實(shi)施(shi)方(fang)案中(zhong)，也可(ke)能有(you)(you)其中(zhong)并非所有(you)(you)半擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)子(zi)(zi)都有(you)(you)效拷(kao)貝成全擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)子(zi)(zi)的(de)情況(kuang)，例(li)如(ru)(ru)在(zai)(zai)(zai)最后幾(ji)個(ge)(ge)循環中(zhong)。作為該方(fang)面的(de)結果(guo)，至少在(zai)(zai)(zai)一(yi)(yi)些情況(kuang)下，可(ke)能有(you)(you)有(you)(you)限數目的(de)獨(du)立(li)(li)全擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)子(zi)(zi)。如(ru)(ru)果(guo)該數目小于(例(li)如(ru)(ru))四(si)個(ge)(ge)拷(kao)貝，則仍然(ran)難以區分真實(shi)突變和擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)錯誤(wu)。在(zai)(zai)(zai)具(ju)體方(fang)面，需(xu)要具(ju)有(you)(you)原始模板的(de)足夠數量獨(du)立(li)(li)拷(kao)貝以稀釋最終讀(du)數呈(cheng)現中(zhong)的(de)擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)錯誤(wu)。為了解決(jue)這個(ge)(ge)問題，還可(ke)以向引(yin)(yin)物中(zhong)引(yin)(yin)入隨(sui)(sui)機的(de)“條(tiao)形碼”(具(ju)有(you)(you)可(ke)變長度的(de)隨(sui)(sui)機DNA序列(例(li)如(ru)(ru)NNNNN，其中(zhong)N表示(shi)四(si)個(ge)(ge)核(he)苷酸(suan)的(de)混合物))，其將索(suo)引(yin)(yin)每個(ge)(ge)線(xian)性(xing)擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)的(de)半擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)子(zi)(zi)并將每個(ge)(ge)全擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)子(zi)(zi)登記到相應的(de)半擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)子(zi)(zi)上(圖(tu)(tu)3)。通過用條(tiao)形碼對(dui)每個(ge)(ge)讀(du)數進行(xing)索(suo)引(yin)(yin)，可(ke)以評估讀(du)數是否是線(xian)性(xing)分布的(de)。在(zai)(zai)(zai)有(you)(you)殘(can)留非線(xian)性(xing)的(de)情況(kuang)下，可(ke)以使用條(tiao)形碼鑒定擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)錯誤(wu)并改進SNV結果(guo)的(de)準確(que)度，如(ru)(ru)圖(tu)(tu)3所示(shi)。

IV.本公開(kai)方法的示例(li)性(xing)應用

本(ben)公開方法可在(zai)研究、臨(lin)床和/或(huo)其(qi)它應用中使用。在(zai)具體(ti)的(de)(de)(de)實施方案(an)中，本(ben)公開的(de)(de)(de)方法被(bei)用于例如對個體(ti)的(de)(de)(de)一種或(huo)多(duo)種療法的(de)(de)(de)診斷(duan)和/或(huo)預后(hou)和/或(huo)監測、微生物的(de)(de)(de)宏觀基因組分析和法醫(yi)DNA測試。

在本公(gong)開的(de)(de)(de)一個(ge)(ge)或多(duo)個(ge)(ge)方法(fa)的(de)(de)(de)應(ying)用的(de)(de)(de)一個(ge)(ge)實例(li)中(zhong)，所述(shu)(shu)方法(fa)被用于測(ce)定來自(zi)個(ge)(ge)體(ti)(ti)的(de)(de)(de)核酸(suan)(suan)的(de)(de)(de)含量(liang)或表達水平中(zhong)一種(zhong)或多(duo)種(zhong)變化(hua)；所述(shu)(shu)變化(hua)可(ke)以是相(xiang)對于已知(zhi)的(de)(de)(de)標(biao)準品(pin)，例(li)如(ru)，如(ru)具體(ti)(ti)核酸(suan)(suan)的(de)(de)(de)對應(ying)野生(sheng)(sheng)型(xing)(xing)序列。含量(liang)的(de)(de)(de)變化(hua)可(ke)以包(bao)含一個(ge)(ge)或多(duo)個(ge)(ge)相(xiang)比野生(sheng)(sheng)型(xing)(xing)的(de)(de)(de)核苷酸(suan)(suan)差異，如(ru)置(zhi)換、刪(shan)除(chu)、倒(dao)置(zhi)，等等。表達的(de)(de)(de)變化(hua)可(ke)包(bao)含具體(ti)(ti)相(xiang)比于某個(ge)(ge)具體(ti)(ti)的(de)(de)(de)已知(zhi)或確定的(de)(de)(de)標(biao)準的(de)(de)(de)正(zheng)(zheng)常(chang)表達水平的(de)(de)(de)上(shang)調(diao)或下調(diao)。所述(shu)(shu)標(biao)準品(pin)可(ke)包(bao)含已知(zhi)基因型(xing)(xing)和/或表型(xing)(xing)正(zheng)(zheng)常(chang)細胞(bao)中(zhong)的(de)(de)(de)正(zheng)(zheng)常(chang)核酸(suan)(suan)含量(liang)或表達水平。

在(zai)(zai)特定的(de)情況(kuang)下，要測定的(de)核酸(suan)獲(huo)自來(lai)(lai)自個(ge)(ge)(ge)體(ti)(ti)的(de)樣品(pin)，該個(ge)(ge)(ge)體(ti)(ti)患醫(yi)學(xue)病(bing)況(kuang)或(huo)懷(huai)疑患醫(yi)學(xue)病(bing)況(kuang)或(huo)有患醫(yi)學(xue)病(bing)況(kuang)的(de)風險或(huo)正(zheng)在(zai)(zai)接受(shou)針對醫(yi)學(xue)病(bing)況(kuang)的(de)治療。所(suo)述(shu)樣品(pin)可以為任意種類(lei)，只要能直接或(huo)間接從來(lai)(lai)自樣品(pin)的(de)一(yi)(yi)個(ge)(ge)(ge)或(huo)多個(ge)(ge)(ge)細胞中(zhong)獲(huo)得核酸(suan)即可。在(zai)(zai)具體(ti)(ti)的(de)實(shi)施方(fang)案中(zhong)，核酸(suan)獲(huo)自來(lai)(lai)自個(ge)(ge)(ge)體(ti)(ti)的(de)樣品(pin)中(zhong)的(de)一(yi)(yi)個(ge)(ge)(ge)或(huo)多個(ge)(ge)(ge)細胞。所(suo)述(shu)樣品(pin)可以是血液(ye)、組織、毛發、活檢標(biao)本(ben)、尿液(ye)、乳(ru)頭抽吸物(wu)(wu)、羊水(shui)、面(mian)頰(jia)刮屑、糞便(bian)物(wu)(wu)、或(huo)胚胎。

從所述個體獲得適(shi)當的(de)樣(yang)品，并可由獲得樣(yang)品的(de)個體直接或間(jian)接實行本公(gong)開的(de)方(fang)法，或者可由另(ling)一方(fang)或多方(fang)實行所述方(fang)法。

A.遺傳檢測

在具(ju)(ju)(ju)(ju)體(ti)應用中，期望(wang)的(de)(de)(de)是獲(huo)知來(lai)自(zi)個(ge)(ge)(ge)體(ti)的(de)(de)(de)樣品中的(de)(de)(de)一(yi)(yi)個(ge)(ge)(ge)或(huo)(huo)(huo)多個(ge)(ge)(ge)具(ju)(ju)(ju)(ju)體(ti)核酸(suan)的(de)(de)(de)序列。所(suo)(suo)述(shu)(shu)個(ge)(ge)(ge)體(ti)可以(yi)是任何年齡。所(suo)(suo)述(shu)(shu)個(ge)(ge)(ge)體(ti)可以(yi)是進行常規(gui)檢測，或(huo)(huo)(huo)處于某一(yi)(yi)具(ju)(ju)(ju)(ju)體(ti)期望(wang)或(huo)(huo)(huo)醫(yi)學(xue)原因(yin)而進行測試。所(suo)(suo)述(shu)(shu)個(ge)(ge)(ge)體(ti)可能懷疑患某具(ju)(ju)(ju)(ju)體(ti)醫(yi)學(xue)病(bing)況(kuang)，例如(ru)由(you)于具(ju)(ju)(ju)(ju)有(you)(you)(you)一(yi)(yi)種或(huo)(huo)(huo)多種與(yu)所(suo)(suo)述(shu)(shu)醫(yi)學(xue)病(bing)況(kuang)相關(guan)(guan)的(de)(de)(de)癥狀和/或(huo)(huo)(huo)具(ju)(ju)(ju)(ju)有(you)(you)(you)與(yu)所(suo)(suo)述(shu)(shu)醫(yi)學(xue)病(bing)況(kuang)相關(guan)(guan)的(de)(de)(de)個(ge)(ge)(ge)體(ti)或(huo)(huo)(huo)家(jia)族(zu)史。所(suo)(suo)述(shu)(shu)個(ge)(ge)(ge)體(ti)可能有(you)(you)(you)患某醫(yi)學(xue)病(bing)況(kuang)的(de)(de)(de)風險(xian)，如(ru)具(ju)(ju)(ju)(ju)有(you)(you)(you)所(suo)(suo)述(shu)(shu)醫(yi)學(xue)病(bing)況(kuang)的(de)(de)(de)家(jia)族(zu)病(bing)史或(huo)(huo)(huo)具(ju)(ju)(ju)(ju)有(you)(you)(you)所(suo)(suo)述(shu)(shu)醫(yi)學(xue)病(bing)況(kuang)的(de)(de)(de)一(yi)(yi)種或(huo)(huo)(huo)多種已知的(de)(de)(de)風險(xian)因(yin)素，如(ru)高膽固醇之(zhi)于心臟(zang)疾病(bing)，吸煙(yan)之(zhi)于多種醫(yi)學(xue)病(bing)況(kuang)，高血壓(ya)之(zhi)于心臟(zang)疾病(bing)或(huo)(huo)(huo)中風，具(ju)(ju)(ju)(ju)有(you)(you)(you)與(yu)所(suo)(suo)述(shu)(shu)醫(yi)學(xue)病(bing)況(kuang)相關(guan)(guan)的(de)(de)(de)遺(yi)傳(chuan)標志物，等等。

在特定的(de)(de)(de)情(qing)(qing)況下，所(suo)述(shu)(shu)個體(ti)是(shi)胎兒(er)(er)，并且該胎兒(er)(er)可(ke)被或(huo)(huo)(huo)不(bu)被懷疑具(ju)(ju)有(you)某(mou)一(yi)具(ju)(ju)體(ti)核酸(suan)序(xu)列或(huo)(huo)(huo)核酸(suan)表(biao)達(da)(da)相(xiang)比野(ye)生型有(you)變(bian)化，這種(zhong)序(xu)列內容或(huo)(huo)(huo)表(biao)達(da)(da)變(bian)化與醫學病(bing)況相(xiang)關。在一(yi)些(xie)情(qing)(qing)況下，盡(jin)管(guan)(guan)所(suo)述(shu)(shu)胎兒(er)(er)可(ke)能出(chu)于常規目的(de)(de)(de)需(xu)要(yao)進行測(ce)試，但該胎兒(er)(er)由于例如家族史(shi)或(huo)(huo)(huo)環境風(feng)險(即輻射(she))或(huo)(huo)(huo)高齡妊娠，而具(ju)(ju)有(you)某(mou)一(yi)具(ju)(ju)體(ti)醫學病(bing)況的(de)(de)(de)風(feng)險。在那些(xie)其中期(qi)望從胎兒(er)(er)得知具(ju)(ju)體(ti)序(xu)列內容或(huo)(huo)(huo)表(biao)達(da)(da)水平的(de)(de)(de)情(qing)(qing)況下，采集包含一(yi)個或(huo)(huo)(huo)多(duo)個胎兒(er)(er)細(xi)胞的(de)(de)(de)樣品。所(suo)述(shu)(shu)樣品可(ke)以(yi)來自胎兒(er)(er)的(de)(de)(de)活檢(jian)標本，盡(jin)管(guan)(guan)在具(ju)(ju)體(ti)情(qing)(qing)況下，樣品是(shi)羊水或(huo)(huo)(huo)母體(ti)血液或(huo)(huo)(huo)發育早期(qi)的(de)(de)(de)胚胎。

在本公開的(de)一方面，從懷孕母親獲得羊水(shui)并從中(zhong)分(fen)離(li)一個或(huo)(huo)多(duo)個胎(tai)(tai)兒(er)(er)(er)細(xi)胞(bao)(bao)。所述胎(tai)(tai)兒(er)(er)(er)細(xi)胞(bao)(bao)分(fen)離(li)可通過(guo)(guo)本領(ling)域常規方法進行，如通過(guo)(guo)使用胎(tai)(tai)兒(er)(er)(er)細(xi)胞(bao)(bao)表面的(de)標志物區(qu)分(fen)胎(tai)(tai)兒(er)(er)(er)細(xi)胞(bao)(bao)和母體(ti)(ti)(ti)細(xi)胞(bao)(bao)。三(san)種不同類(lei)型的(de)胎(tai)(tai)兒(er)(er)(er)細(xi)胞(bao)(bao)可存在于母體(ti)(ti)(ti)循環中(zhong)：滋(zi)養層(ceng)細(xi)胞(bao)(bao)、白細(xi)胞(bao)(bao)和胎(tai)(tai)兒(er)(er)(er)紅(hong)細(xi)胞(bao)(bao)(有核(he)紅(hong)細(xi)胞(bao)(bao))。最可能富集的(de)細(xi)胞(bao)(bao)是胎(tai)(tai)兒(er)(er)(er)紅(hong)細(xi)胞(bao)(bao)，在某些(xie)實施方案中(zhong)其可通過(guo)(guo)尺(chi)寸(cun)色譜柱鑒定(ding)，隨后進行CD71-抗體(ti)(ti)(ti)染色或(huo)(huo)ε球蛋(dan)白鏈免(mian)疫(yi)分(fen)型，然后基于熒光強度進行掃描或(huo)(huo)分(fen)選而(er)鑒定(ding)。

一旦分(fen)離(li)出(chu)胎(tai)兒細胞(bao)(bao)，即從中(zhong)提取核酸，例(li)如(ru)通過本領域常規(gui)方(fang)法。對來自胎(tai)兒細胞(bao)(bao)核酸使(shi)用(yong)本公開的(de)(de)(de)方(fang)法以產生線(xian)性生成的(de)(de)(de)擴(kuo)增子，其(qi)覆蓋至(zhi)少部(bu)(bu)(bu)分(fen)、大部(bu)(bu)(bu)分(fen)或全(quan)部(bu)(bu)(bu)的(de)(de)(de)所述(shu)胎(tai)兒細胞(bao)(bao)的(de)(de)(de)基因組。在線(xian)性擴(kuo)增后，可(ke)(ke)進(jin)(jin)一步(bu)擴(kuo)增擴(kuo)增子的(de)(de)(de)一個或多個序(xu)列，也可(ke)(ke)對其(qi)測序(xu)，至(zhi)少部(bu)(bu)(bu)分(fen)測序(xu)，或可(ke)(ke)實施(shi)微(wei)陣列技術(shu)。在特定(ding)的(de)(de)(de)實施(shi)方(fang)案中(zhong)，例(li)如(ru)測定(ding)了SNV或CNV，且測定(ding)結果被用(yong)于(yu)確定(ding)相應(ying)的(de)(de)(de)胎(tai)兒是否患具體(ti)醫學病(bing)況(kuang)或是否懷疑患具體(ti)醫學病(bing)況(kuang)。在特定(ding)情況(kuang)下，例(li)如(ru)可(ke)(ke)對胎(tai)兒進(jin)(jin)行所述(shu)醫學病(bing)況(kuang)的(de)(de)(de)治療或可(ke)(ke)對其(qi)使(shi)用(yong)防止或延遲所述(shu)醫學病(bing)況(kuang)發病(bing)的(de)(de)(de)方(fang)法，且這可(ke)(ke)在子宮內和/或分(fen)娩(mian)后進(jin)(jin)行。

雖然(ran)可對胎(tai)兒樣品測(ce)定(ding)SNV或(huo)CNV的(de)存在情況(其中(zhong)任一(yi)可為疾病相(xiang)關的(de)或(huo)導致疾病的(de))，在具(ju)體(ti)實(shi)施(shi)方(fang)案中(zhong)對胎(tai)兒樣品測(ce)定(ding)與任意具(ju)體(ti)醫學(xue)(xue)病況相(xiang)關的(de)遺(yi)傳突變。可測(ce)定(ding)的(de)與產前醫學(xue)(xue)病況相(xiang)關的(de)基(ji)因實(shi)例(li)包括以下(xia)中(zhong)的(de)一(yi)個或(huo)多個：ACAD8、ACADSB、ACSF3、C7orf10、IFITM5、MTR、CYP11B1、CYP17A1、GNMT、HPD、TAT、AHCY、AGA、PLOD2、ATP5A1、C12orf65、MARS2、MRPL40、MTFMT、SERPINF1、FARS2、ALPL、TYROBP、GFM1、ACAT1、TFB1M、MRRF、MRPS2、MRPS22、MRPL44、MRPS18A、NARS2、HARS2、SARS2、AARS2、KARS、PLOD3、FBN1、FKBP10、RPGRIP1、RPGR、DFNB31、GPR98、PCDH15、USH1C、CERKL、CDHR1、LCA5、PROM1、TTC8、MFRP、ABHD12CEP290、C8orf37、LEMD3、AIPL1、GUCY2D、CTSK、RP2、IMPG2、PDE6B、RBP3、PRCD、RLBP1、RGR、SAG、FLVCR1、ZNF513、MAK、NDUFB6、TMLHE、ALDOA、PGM1、ENO3、LARS2、ATP7A、ATP7B、TNFRSF11B、LMBRD1、MTRR、FAM123B、FAM20C、ANKH、TGFB1、SOST、TNFRSF11A、CA2、OSTM1、CLCN7、PPIB、TCIRG1、SLC39A13.COL1A2、TNFSF11、SLC34A1、NDUFAF5、FOXRED1、NDUFA2、NDUFA8、NDUFA10、NDUFA11、NDUFA13、NDUFAF3、SP7、NDUFS1、NDUFV3、NUBPL、TTC19、UQCRB、UQCRQ、COX4I1、COX4I2、COX7A1、TACO1、COL3A1、SLC9A3R1、CA4、FSCN2、BCKDHA、GUCA1B、KLHL7、IMPDH1、PRPF6、PRPF31、PRPF8、PRPF3、ROM1、SNRNP200、RP9、APRT、RD3、LRAT、TULP1、CRB1、SPATA7、USH1G、ACACB、BCKDHB、ACACA、TOPORS、PRKCG、NRL、NR2E3、RP1、RHO、BEST1、SEMA4A、RPE65、PRPH2、CNGB1、CNGA1、CRX、RDH12、C2orf71、DHDDS、EYS、IDH3B、MERTK、PDE6A、FAM161A、PDE6G、TYMP(ECGF1)、POLG(POLG1、POLGA)、TK2、DGUOK(dGK)、SURF1、SCO2(SCO1L)、SCO1、COX10、BCS1L、ACADM、HADHA、ALDOB、G6PC(GSD1a)、PAH(PH)、OTC、GAMT、SLC6A8、SLC25A13、CPT2、PDHA1、SLC25A4(ANT1)、C10orf2(TWINKLE)、SDHA、SLC25A15、LRPPRC、GALT、PMM2、ATPAF2(ATP12)、GALE、LPIN1、ATP5E、B4GALT7、ATP8B1(ATPIC、PFIC)、ABCB11(ABC16、PFIC-2、PGY4)、ABCB4(GBD1、MDR2、PFIC-3)、MPV17(SYM1)、TIMM8A(DDP、MTS)、CPS1、NAGS、ACADVL、SLC22A5(OCTN2)、CPT1A(CPT1-L、L-CPT1)、CPT1B、SUCLA2、POLG2(HP55、MTPOLB)、ACADL、SUCLG1、MCEE、GAA、PDSS1(COQ1、TPT)、PDSS2(bA59I9.3)、COQ2(CL640、FLJ26072)、RRM2B(p53R2)、ARG1、SLC25A20(CACT)、MMACHC(cblC)、FAH、MPI、GATM、OPA1、TFAM、TOMM20(MAS20P、TOM20)、NDUFAF4(HRPAP20、C6orf66)、NDUFA1(CI-MWFE、MWFE)、SLC25A3(PHC)、BTD、OPA3(FLJ22187、MGA3)、GYS2、NDUFAF2(B17.2L、MMTN)、HLCS(HCS)、COX15、FASTKD2、NDUFS4、NDUFS6、NDUFS3、MMAA(cblA)、MUT、NDUFV1、MOCS1、NDUFS7(PSST)、TAZ(BTHS、G4.5、XAP-2)、MOCS2、COX6B1(COXG)、HADHB、MCCC1(MCCA)、MCCC2(MCCB)、TSFM(EF-TS、EF-Tsmt)、PUS1、ISCU、AGL、SDHAF1、IVD、GCDH、ADSL、DARS2、RARS2、TMEM70、ETHE1、PC、JAG1、MRPS16、PCCA、PCCB、COQ9、LDHA、PYGL、GALK1、PYGM、PGAM2、TUFM、TRMU、PFKM、GBE1、SLC37A4、GYS1、ETFDH、NDUFS8、CABC1(ADCK3)、ETFA、ETFB、DBT、SLC25A19、MMADHC、PDP1、PDHB、ACAD9、AUH、DLAT、PDHX、ACADS、NDUFS2、FBP1、NDUFAF1(CIA30、CGI65)、YARS2、SUCLG2、TCN2、CBS、PHKB、PHKG2、PHKA1、PHKA2、LIPA、ASL、HPRT1、OCRL、PNP、TSHR、ADA、ARSB、ALDH5A1、PNP、AMT、DECR1、HSD17B10、IYD、IL2RG、MGME1、HMGCL、IQCB1、OTX2、KCNJ13、CABP4、NMNAT1、ALG2、DOLK、ABCD4、ALDH4A1、ALG1、GPR143、UBE3A、ARX、GJB2(CX26、NSRD1)、APC、HTT、IKBKG(NEMO)、DMPK、PTPN11、MECP2、MECP2、RECQL4、ATXN1、ATXN10、RMRP、CDKL5、PLP1、GLA、DMD、RUNX2、PLP1、CHD7、ASS1、AIRE、EIF2B、LDLR、HPRT1、RPS19、LMX1B、COL10A1、CRTAP、LEPRE1、PORCN、ASL、CFTR、ARSA、IDUA、IDS、MYO7A、GLANS、GALC、KRAS、SOS1、RAF1、AR、PTEN、BLM、SLC9A6、HRAS、GJC2(GJA12)、NPC1、NPC2、FMR1、FMR1、PLOD1、COL2A1、COL5A1、COL5A2、ABCA4、FOXG1、TINF2、USH2A、CDH23、CLRN1、CREBBP、ABCA4、POU3F4、NRAS、CHRNA7、FOXF1、MEF2C、DHCR7、RAI1、VHL、TYR(OCAIA)、OCA2(BEY、BEY1、BEY2、EYCL)、TYRP1(b-PROTEIN、CATB、GP75、SLC45A2(AIM-1)、PCDH19、SHOC2、BRAF、MAP2K1、MAP2K2、HEXA、STXBP1、ALDH7A1、SLC2A1、WDR62、MAGEL2、SDHB和FH。

B.癌癥測試

在本公(gong)開的(de)(de)(de)一些(xie)實施方案中(zhong)，對(dui)來(lai)自(zi)患癌(ai)(ai)癥(zheng)或懷疑患癌(ai)(ai)癥(zheng)或癌(ai)(ai)癥(zheng)治療結(jie)果(guo)正被(bei)監(jian)測(ce)的(de)(de)(de)個(ge)體的(de)(de)(de)樣(yang)品(pin)(pin)(pin)實施本發明的(de)(de)(de)方法(fa)。除了(le)本公(gong)開的(de)(de)(de)方法(fa)之外，還可(ke)以在樣(yang)品(pin)(pin)(pin)或類(lei)似(si)樣(yang)品(pin)(pin)(pin)中(zhong)運(yun)行(xing)其(qi)他(ta)診斷或預后測(ce)試。所(suo)述樣(yang)品(pin)(pin)(pin)可(ke)以通(tong)過常規(gui)方法(fa)獲(huo)得，并且可(ke)以包括(kuo)活(huo)檢標本，其(qi)包含(han)似(si)乎是(shi)、懷疑是(shi)或已(yi)知(zhi)是(shi)癌(ai)(ai)變的(de)(de)(de)細胞或組織。用于癌(ai)(ai)癥(zheng)檢測(ce)的(de)(de)(de)示(shi)例性的(de)(de)(de)樣(yang)品(pin)(pin)(pin)包括(kuo)血液(ye)、尿液(ye)、活(huo)檢標本、糞便物、乳頭抽吸物、臉頰刮屑等(deng)(deng)。在一些(xie)情況下，從具(ju)有患癌(ai)(ai)癥(zheng)風險的(de)(de)(de)個(ge)體獲(huo)得樣(yang)品(pin)(pin)(pin)；該個(ge)體可(ke)以有家族(zu)和/或個(ge)體史(shi)，可(ke)能已(yi)經接觸(chu)已(yi)知(zhi)或懷疑會導致癌(ai)(ai)癥(zheng)的(de)(de)(de)環境條件，可(ke)以已(yi)知(zhi)具(ju)有與至少(shao)一種癌(ai)(ai)癥(zheng)類(lei)型相關的(de)(de)(de)遺傳(chuan)標志物，等(deng)(deng)等(deng)(deng)。具(ju)體類(lei)型的(de)(de)(de)活(huo)檢標本包括(kuo)皮膚(fu)、肺、乳房、結(jie)腸、子宮頸、肝、腎、前列腺的(de)(de)(de)標本，等(deng)(deng)等(deng)(deng)。

在具(ju)體實(shi)施(shi)方(fang)(fang)案中(zhong)，對來自個(ge)體的待(dai)測樣品實(shi)施(shi)本公開的方(fang)(fang)法以測定(ding)其中(zhong)序列內容相比于已知樣品的變化(hua)，或(huo)(huo)測定(ding)某(mou)一(yi)序列表達(da)水平相比于正(zheng)常(chang)水平的變化(hua)(如一(yi)個(ge)或(huo)(huo)多(duo)個(ge)基(ji)因的上調或(huo)(huo)下調)。在一(yi)些情況下，由本公開的方(fang)(fang)法產生(sheng)的擴增子的數量所代表的一(yi)個(ge)或(huo)(huo)多(duo)個(ge)特定(ding)基(ji)因的表達(da)水平指(zhi)示存在癌癥或(huo)(huo)者患癌風險情況或(huo)(huo)對癌癥治(zhi)療的成功(gong)與否。

可測定(ding)的與具體癌癥相關基因的實例(li)包括APC、MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、MUTYH(MYH)、RECQL4、TP53(LFS1、P53)、PTEN、RUNX1、TPMT、VHL、EPCAM(TACSTD1)、ERBB2(HER2/neu)、ALK、RET、EGFR、MET、IGH、ROS1、BRAF、NPM1、JAK2、MPL、AKT1(AKT)、PIK3CA、FLT3、IgVH、CEBPA、MAX、KIT、KRAS、NF1、SDHAF2、SDHB、SDHC、SDHD、TMEM127、BMPR1A、SMAD4、STK11、BRCA1、BRCA2、CDH1、PALB2、CDKN1C、FH、FLCN、GPC3、PALB2、WTL、CDC73、MEN1、PRKAR1A、ATM、NBN、NF2、PHOX2B、PTCH1、SUFU和/或UGT1A1。

V.樣品處理和(he)來(lai)自本發明(ming)細(xi)胞的核酸

可(ke)以(yi)通過任何適(shi)當(dang)的(de)手段來從用本(ben)公開方(fang)法進(jin)行測試的(de)個體(ti)獲得一種(zhong)或多(duo)種(zhong)樣品。在某些實施方(fang)式中，可(ke)在提取(qu)(qu)核酸(suan)(suan)前對樣品進(jin)行處(chu)理(li)。在提取(qu)(qu)核酸(suan)(suan)時樣品可(ke)以(yi)是(shi)新鮮的(de)，或在提取(qu)(qu)核酸(suan)(suan)時樣品可(ke)能經(jing)過固定或其(qi)他處(chu)理(li)技(ji)術的(de)處(chu)理(li)。

樣品可(ke)以是任何種類(lei)的(de)(de)。在(zai)其中(zhong)(zhong)一個或多個目(mu)的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)與其他細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)混在(zai)一起的(de)(de)實施(shi)方(fang)案(an)(an)中(zhong)(zhong)，可(ke)基(ji)于(yu)所期(qi)望(wang)的(de)(de)一個或多個細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)獨特特征，如細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)表面表達的(de)(de)蛋白質，分離(li)(li)一個或多個目(mu)的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)。在(zai)其中(zhong)(zhong)基(ji)于(yu)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)標志物(wu)(wu)而分離(li)(li)胎兒(er)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)實施(shi)方(fang)案(an)(an)中(zhong)(zhong)，細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)標志物(wu)(wu)可(ke)以為CD71或ε球蛋白鏈，等等，在(zai)其中(zhong)(zhong)基(ji)于(yu)癌(ai)癥標志物(wu)(wu)而分離(li)(li)癌(ai)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)實施(shi)方(fang)案(an)(an)中(zhong)(zhong)，細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)標志物(wu)(wu)可(ke)以為ER/PR、Her-2/neu、EGFR、KRAS、BRAF、PDFGR、UGT1A1等(Bigbee W,Herberman RB.Tumor markers and immunodiagnosis.In:Bast RC Jr.,Kufe DW,Pollock RE,等人(ren),editors.Cancer Medicine.6th ed.Hamilton,Ontario,Canada:BC Decker Inc.,2003.)。

可將(jiang)細(xi)胞在(zai)有表面(mian)活性(xing)(xing)劑(ji)(即Trion-X100，tweet-20，NP-40等)和蛋白(bai)酶(即蛋白(bai)激酶K)的裂解緩沖液(ye)中孵育(yu)而裂解所分離的細(xi)胞。還可通過堿(jian)性(xing)(xing)溶液(ye)(即去垢劑(ji)十二烷基硫酸鈉(C12H25SO4Na)和強堿(jian)如氫氧化鈉)裂解細(xi)胞，這將(jiang)導致雙鏈DNA的變(bian)性(xing)(xing)。堿(jian)性(xing)(xing)溶液(ye)通過乙酸鉀或乙酸鈉中和。

VI.本發(fa)明的試(shi)劑盒

本文(wen)描述的(de)任意組合(he)(he)物(wu)或類似物(wu)可以(yi)包含在試(shi)(shi)劑(ji)盒(he)中。在一個(ge)非限制性實例中，一種(zhong)或多種(zhong)用于(yu)擴增核酸的(de)方法的(de)反(fan)應(ying)劑(ji)可包含于(yu)試(shi)(shi)劑(ji)盒(he)中。這些反(fan)應(ying)劑(ji)可包括(kuo)酶、緩沖液、核苷酸、鹽(yan)、引物(wu)等(deng)等(deng)。試(shi)(shi)劑(ji)盒(he)組分(fen)在合(he)(he)適的(de)容器形式中提(ti)供。

這(zhe)些(xie)試(shi)(shi)(shi)劑盒(he)(he)的(de)一(yi)些(xie)組(zu)分(fen)可(ke)以(yi)在水(shui)媒(mei)介物中(zhong)(zhong)(zhong)或以(yi)凍干(gan)形式(shi)(shi)進行包(bao)(bao)(bao)裝。試(shi)(shi)(shi)劑盒(he)(he)的(de)容(rong)器形式(shi)(shi)通常包(bao)(bao)(bao)括至少一(yi)個小(xiao)瓶(ping)、試(shi)(shi)(shi)管(guan)、燒(shao)瓶(ping)、瓶(ping)、注(zhu)射器或其(qi)(qi)他容(rong)器形式(shi)(shi)，其(qi)(qi)中(zhong)(zhong)(zhong)置有組(zu)分(fen)，并優選被(bei)合適地分(fen)裝。試(shi)(shi)(shi)劑盒(he)(he)中(zhong)(zhong)(zhong)有超過一(yi)種(zhong)組(zu)分(fen)時，該試(shi)(shi)(shi)劑盒(he)(he)通常含有第(di)二、第(di)三或其(qi)(qi)他附加(jia)的(de)容(rong)器，其(qi)(qi)中(zhong)(zhong)(zhong)附加(jia)組(zu)分(fen)可(ke)分(fen)開置于這(zhe)些(xie)容(rong)器中(zhong)(zhong)(zhong)。然(ran)而，組(zu)分(fen)的(de)多種(zhong)組(zu)合可(ke)包(bao)(bao)(bao)含于小(xiao)瓶(ping)中(zhong)(zhong)(zhong)。本發明的(de)試(shi)(shi)(shi)劑盒(he)(he)還典(dian)型(xing)地包(bao)(bao)(bao)括用于將這(zhe)些(xie)組(zu)分(fen)包(bao)(bao)(bao)含在密閉(bi)容(rong)器中(zhong)(zhong)(zhong)用于商業(ye)銷(xiao)售的(de)方式(shi)(shi)。所述容(rong)器可(ke)包(bao)(bao)(bao)括注(zhu)塑或吹塑成(cheng)型(xing)的(de)塑料容(rong)器，其(qi)(qi)中(zhong)(zhong)(zhong)留(liu)存有所期望的(de)小(xiao)瓶(ping)。

當所述試(shi)劑盒的(de)(de)組分(fen)是以(yi)一(yi)種(zhong)和/或(huo)多(duo)種(zhong)液(ye)(ye)體溶(rong)(rong)液(ye)(ye)提供時，所述液(ye)(ye)體溶(rong)(rong)液(ye)(ye)是水(shui)(shui)溶(rong)(rong)液(ye)(ye)，其中滅菌水(shui)(shui)溶(rong)(rong)液(ye)(ye)尤其有(you)(you)用。在(zai)一(yi)些情況下(xia)，所述容器形式自身可以(yi)是注射器、吸頭(tou)和/或(huo)其它類似裝置，或(huo)可以(yi)是具有(you)(you)用于(yu)進(jin)行所期(qi)望(wang)的(de)(de)反應的(de)(de)多(duo)個區室的(de)(de)基底。

所述試劑(ji)盒(he)的(de)一(yi)些組分可(ke)以以干粉提(ti)供。當反應劑(ji)和/或組分以干粉提(ti)供時(shi)，可(ke)以通過加入合適的(de)溶(rong)劑(ji)來重(zhong)構所述粉末(mo)。可(ke)以預見的(de)是，所述溶(rong)劑(ji)也可(ke)在其他(ta)容(rong)器(qi)形(xing)(xing)式(shi)中提(ti)供。這些試劑(ji)盒(he)還可(ke)包(bao)含第二種容(rong)器(qi)形(xing)(xing)式(shi)，用(yong)于包(bao)含滅菌的(de)可(ke)接受緩沖液(ye)和/或其他(ta)稀釋劑(ji)。

在(zai)特定實施方(fang)案中，反(fan)(fan)應劑和(he)材料包(bao)括(kuo)用于(yu)擴增期望序(xu)列的(de)(de)引物、核苷酸、合適的(de)(de)緩沖(chong)液或緩沖(chong)反(fan)(fan)應劑、鹽等等，且在(zai)一些情況下(xia)，所述(shu)反(fan)(fan)應劑包(bao)括(kuo)用于(yu)分離具體的(de)(de)期望細胞的(de)(de)裝置或反(fan)(fan)應劑。

在(zai)具(ju)體實施方(fang)案(an)中，試劑盒(he)中有一種(zhong)(zhong)或多種(zhong)(zhong)裝(zhuang)置適用于從個體提(ti)取(qu)一種(zhong)(zhong)或多種(zhong)(zhong)樣品。該(gai)裝(zhuang)置可以是(shi)針(zhen)筒(tong)、細針(zhen)頭、手術(shu)刀等等。

實施例

包(bao)括以下實施例以說明本發(fa)明的(de)(de)優(you)選(xuan)實施方案(an)。本領域技(ji)術人員應當(dang)清(qing)楚的(de)(de)是，在那些根據(ju)本發(fa)明者發(fa)現(xian)的(de)(de)代表性技(ji)術的(de)(de)實施例中(zhong)公開的(de)(de)那些技(ji)術在本發(fa)明的(de)(de)實踐中(zhong)能很(hen)好(hao)的(de)(de)起作用，并且因(yin)此可(ke)被認為組成優(you)選(xuan)的(de)(de)實踐形(xing)式。然而，本領域技(ji)術人員根據(ju)本公開應當(dang)清(qing)楚的(de)(de)是，在公開的(de)(de)特定實施方案(an)中(zhong)可(ke)進行多種變化且仍然獲(huo)得相(xiang)似或(huo)類似的(de)(de)結果(guo)而不偏離本發(fa)明的(de)(de)精(jing)神和(he)范圍(wei)。

實施例1

從組織樣品中(zhong)分離完整的(de)單細胞(bao)

使用(yong)(yong)商業化冷凍切片(pian)(pian)機制備(bei)組織學組織切片(pian)(pian)。制備(bei)100-200μm厚的(de)(de)多聚甲醛固(gu)定的(de)(de)固(gu)體組織的(de)(de)切片(pian)(pian)。用(yong)(yong)激光(guang)微切顯微鏡(Leica，MMI等)從組織切片(pian)(pian)中(zhong)切割出(chu)目的(de)(de)的(de)(de)細胞。使用(yong)(yong)標準細胞解(jie)(jie)離(li)(li)操作流程將個體細胞從微切組織切片(pian)(pian)中(zhong)解(jie)(jie)離(li)(li)出(chu)來。將完(wan)整的(de)(de)單細胞收集到各自(zi)的(de)(de)管子中(zhong)。在3至(zhi)5μl的(de)(de)裂解(jie)(jie)緩沖(chong)液(30mM Tris-Cl PH 7.8，2mM EDTA，20mM KCl，0.2％Triton X-100，12μg/ml Qiagen蛋白酶)中(zhong)裂解(jie)(jie)所述(shu)個體細胞并將其(qi)加入(ru)PCR管的(de)(de)邊上，離(li)(li)心下(xia)來。然后(hou)熱裂解(jie)(jie)所捕獲(huo)的(de)(de)細胞，在PCR儀上使用(yong)(yong)如(ru)下(xia)溫度程序：50℃2小(xiao)時(shi)，75℃20分(fen)鐘，80℃5分(fen)鐘。

線性產(chan)生半擴增子的(de)多重循環(圖4)

在第一輪擴(kuo)增(zeng)中，一對準簡并引(yin)物(wu)用于在整個基(ji)因組(zu)DNA起始重疊(die)的(de)擴(kuo)增(zeng)子(zi)。所述引(yin)物(wu)被(bei)記為NG、NT引(yin)物(wu)，如下：

NG引物5'-GTGAGTGATGGTTGAGGATGAGTGGTNNNNNGGG-3'(SEQ ID NO：1)

NT引物5'-GTGAGTGATGGTTGAGGATGAGTGGTNNNNNTTT-3'(SEQ ID NO：2)

將以下緩沖液加到PCR管中并用于第一次擴增：6.0μl ThermoPol緩沖液(NEB)，1.0μl的dNTP(10mM)，26μl的H₂O(經UV處理)和(he)0.3μl的NG和(he)NT引物(100μΜ)。

將(jiang)PCR緩沖液(ye)加(jia)入(ru)到(dao)含有裂解(jie)的單細胞的PCR管后(hou)，將(jiang)樣品在(zai)(zai)94℃下加(jia)熱1-2分(fen)鐘，以(yi)使(shi)DNA變(bian)性成(cheng)單鏈DNA。立即(ji)將(jiang)樣品加(jia)入(ru)冰(bing)中(zhong)使(shi)其淬滅(mie)并(bing)(bing)至約0℃的溫(wen)度，在(zai)(zai)此期間發生引(yin)物退火。然后(hou)將(jiang)0.6μl的聚合酶Bst大(da)片段的混(hun)合物加(jia)入(ru)到(dao)PCR管中(zhong)。在(zai)(zai)PCR儀(yi)上(shang)(shang)運(yun)行(xing)下列溫(wen)度循環。在(zai)(zai)第(di)二次和隨后(hou)的循環中(zhong)，將(jiang)PCR管接著轉移到(dao)冰(bing)上(shang)(shang)以(yi)淬滅(mie)反應(ying)，并(bing)(bing)起始新的引(yin)物引(yin)發。將(jiang)新鮮聚合酶混(hun)合物加(jia)入(ru)到(dao)PCR管中(zhong)并(bing)(bing)在(zai)(zai)PCR儀(yi)上(shang)(shang)運(yun)行(xing)以(yi)下循環以(yi)產生擴增子(zi)。

步驟1：10℃-45秒

步驟2：20℃-45秒

步(bu)驟(zou)3：30℃-45秒

步驟4：40℃-30秒

步驟5：55℃-30秒

重復步(bu)驟1-5，4次(ci)

步驟(zou)6：65℃-60秒

步驟7：95℃-20秒

步驟8：冰上(shang)淬滅并重(zhong)新添加聚(ju)合酶

重復步驟1-8，N次

4℃–∞

重復次數N可根據條件進行(xing)調(diao)整。在某些實施方案中，N為3。

全擴增子的雙鏈轉換

來自上(shang)述(shu)程(cheng)序(xu)的(de)(de)產物(wu)(wu)是(shi)全擴增(zeng)子和半擴增(zeng)子的(de)(de)混合物(wu)(wu)。將0.3μl的(de)(de)100μΜ PCR引(yin)物(wu)(wu)加入反應中并(bing)進行以(yi)下熱循環過程(cheng)(例(li)如：58℃20秒-70℃-10秒，重復30次(ci))，以(yi)將全擴增(zeng)子轉化成雙鏈(lian)的(de)(de)DNA，而(er)單鏈(lian)半擴增(zeng)子保持不(bu)變。在上(shang)述(shu)雙鏈(lian)轉換后。

PCR引物：GTGAGTGATGGTTGAGGATGAGTGGT(SEQ ID NO：4)

全擴(kuo)增子的限制性消化

來自上述(shu)熱(re)循(xun)環的(de)(de)產(chan)物包括線(xian)性擴(kuo)增的(de)(de)半擴(kuo)增子(zi)(zi)(zi)和非線(xian)性擴(kuo)增的(de)(de)全(quan)擴(kuo)增子(zi)(zi)(zi)。將(jiang)溫度加(jia)熱(re)至94℃，持(chi)續30秒以(yi)解鏈(lian)雙鏈(lian)DNA產(chan)物，然后(hou)保持(chi)在50℃。在50℃，全(quan)擴(kuo)增子(zi)(zi)(zi)將(jiang)由于5’末端(duan)序列與3’末端(duan)序列的(de)(de)互補(bu)形(xing)成成環的(de)(de)，而半擴(kuo)增子(zi)(zi)(zi)以(yi)單鏈(lian)DNA存在。引物序列整合有GGATG序列基序，可被限制性內切(qie)核酸酶BtsCI識(shi)別并切(qie)割DNA。其(qi)結果是(shi)，全(quan)擴(kuo)增子(zi)(zi)(zi)一(yi)半以(yi)上的(de)(de)引物序列被刪(shan)除，因此，經消(xiao)(xiao)化的(de)(de)DNA產(chan)物在下游PCR反(fan)應(ying)中不再被擴(kuo)增。消(xiao)(xiao)化后(hou)將(jiang)溫度升高(gao)至72℃至80℃的(de)(de)范圍以(yi)滅活限制酶。

線性產生(sheng)全擴增子(圖5)

在上述消化后，將(jiang)樣(yang)品在94℃加(jia)(jia)熱20秒以使DNA變性為單鏈DNA。立即(ji)將(jiang)樣(yang)品加(jia)(jia)入冰中(zhong)淬滅并(bing)達到約0℃的(de)(de)溫度，此(ci)期間發(fa)生引物退火。此(ci)后重(zhong)新加(jia)(jia)入聚合酶并(bing)實行下(xia)面的(de)(de)熱循環，從擴(kuo)(kuo)增(zeng)的(de)(de)半擴(kuo)(kuo)增(zeng)子線性再現(xian)全擴(kuo)(kuo)增(zeng)子。也(ye)可(ke)將(jiang)所述半擴(kuo)(kuo)增(zeng)子分(fen)到多個(ge)管(guan)中(zhong)并(bing)繼續進行以下(xia)的(de)(de)多個(ge)退火步驟，以形成(cheng)擴(kuo)(kuo)增(zeng)子。擴(kuo)(kuo)增(zeng)子的(de)(de)線性產率示于圖9。

步(bu)驟1：10℃-45秒

步驟2：20℃-45秒(miao)

步驟3：30℃-45秒

步驟(zou)4：40℃-30秒

步驟5：55℃-30秒

重(zhong)復步驟1-5，4次(ci)

步驟6：65℃-60秒

備選地，也可將半(ban)擴增子分到多個管中(zhong)，并繼續(xu)進行以下(xia)實施例的包括消化、加尾和(he)延(yan)伸步驟(zou)，以形成擴增子：

用T4聚(ju)合(he)酶和ExoI核酸酶的組合(he)消化預擴增產物，如下(xia)：加(jia)(jia)入(ru)0.4μl ExoI，在(zai)25℃消化30分鐘(zhong)，然(ran)后(hou)添加(jia)(jia)0.4μl T4聚(ju)合(he)酶，在(zai)25℃消化150分鐘(zhong)。在(zai)80℃對酶進(jin)行(xing)進(jin)行(xing)20分鐘(zhong)的熱滅活，隨后(hou)進(jin)入(ru)加(jia)(jia)尾程序。

10X TdT反應緩沖液(ye)由0.35μl的TdT緩沖液(ye)、0.4μl 100mM的dCTP、0.1μl TdT末(mo)端(duan)轉移(yi)酶及2.75μl H2O構成。將TdT混合物加(jia)入樣品，混勻并使用以下溫度(du)進(jin)行加(jia)尾反應：37℃15分鐘，72℃15分鐘。

加尾后，添加下述延伸緩沖(chong)液(1.5μl 10X Thermopol，1.25μl的dNTP(各(ge)10μM)，1.25ul 10μM GAT21 5n3G和12μl H2O)。充分混(hun)(hun)合反應后，把樣(yang)品置于模塊上95℃加熱1min，將溫度(du)降(jiang)至50℃，保持至少20s；添加0.4μl的deepvent DNA聚合酶(mei)或其他聚合酶(mei)，混(hun)(hun)勻并進行以下循環(huan)：

步驟1：50℃45秒

步驟2：72℃45秒(miao)

重復(fu)步驟1至2，10次

實施例2

使用(yong)標準方(fang)法進(jin)行擴(kuo)增子的單管或(huo)多管擴(kuo)增

制備以下反應緩沖(chong)液，并加入維持于冰上的PCR管(guan)中。

3.0μl ThermoPol緩沖液(NEB)

1.0μl dNTP(10mM)

26μl H₂O(經UV處理)

0.1μl引物(wu)(100μM)(5’-GTGAGTGATGGTTGAGGATGAGTG-3’；SEQ ID NO:5)

可將擴增緩沖液分到多個管(guan)中。線(xian)性擴增產物將被(bei)分到各(ge)管(guan)中(圖10)。用(yong)如下(xia)標準PCR程序實行擴增，以生(sheng)成1-2μg的DNA材料。

94℃-20秒

58℃-20秒

65℃-1分鐘

72℃-1分鐘

重復上述循環20次

72℃-5分鐘

4℃–∞

在第二輪(lun)擴增(zeng)后，可(ke)以用(yong)Qiagen柱純化DNA，并儲(chu)存以用(yong)于下一程序以移除DNA擴增(zeng)子的(de)引物末端。

擴增子產物可以用于(yu)全基(ji)因組或定向(例如，外顯子組和(he)(he)基(ji)因面板(ban)的(de)任何列(lie)表)測序(xu)(xu)/重(zhong)測序(xu)(xu)和(he)(he)基(ji)因分型(xing)方法(fa)，包括Sanger測序(xu)(xu)，下一代(dai)測序(xu)(xu)和(he)(he)微(wei)陣列(lie)等。下一代(dai)測序(xu)(xu)的(de)結果示于(yu)圖10和(he)(he)圖11。

實施例3

微滴/微孔中(zhong)全基因組單(dan)一(yi)片段擴增

從實施(shi)例1中(zhong)所得線(xian)性擴增(zeng)的擴增(zeng)子覆蓋了單細胞DNA的全基因組，并可用作以下程序的起(qi)始材料(見圖6)。

可如(ru)下(xia)使用本領域技術人員已知(zhi)的其他(ta)擴增方法(fa)。

將產物分成千萬個(ge)皮(pi)升(sheng)(sheng)級微(wei)滴(di)/微(wei)孔(kong)或(huo)(huo)飛升(sheng)(sheng)級微(wei)滴(di)/微(wei)孔(kong)。可使用商(shang)業可用的(de)(de)基于微(wei)流(liu)體的(de)(de)液滴(di)乳化(hua)劑或(huo)(huo)者有皮(pi)升(sheng)(sheng)或(huo)(huo)飛升(sheng)(sheng)孔(kong)的(de)(de)微(wei)流(liu)體設備。通過在各反應微(wei)滴(di)/微(wei)孔(kong)中達到擴增(zeng)飽和(he)(或(huo)(huo)通過可用的(de)(de)引物或(huo)(huo)dNTP限制擴增(zeng))將單(dan)個(ge)DNA片段擴增(zeng)到類(lei)似的(de)(de)水平。

可如下(xia)使用本(ben)領域技術人員已(yi)知的其他形(xing)成大規(gui)模個體反應的方(fang)法。

可以在(zai)1千萬個(ge)微滴/微孔(kong)中(zhong)的每個(ge)中(zhong)實行PCR反應以擴增(zeng)單個(ge)擴增(zeng)子。

94℃-20秒

58℃-20秒

65℃-1分鐘

72℃-1分鐘

重復上述循環20次

72℃-5分鐘

4℃–∞

從每個微滴/微孔中(zhong)收集DNA產物并使用(yong)商業純化柱或乙醇沉淀(dian)進行純化。

實施例4

移(yi)除擴增子中引(yin)物序列

可以用以下(xia)尿(niao)嘧啶引物(wu)對從(cong)實施例II收集的完全(quan)擴增的DNA再(zai)擴增6個循(xun)環(見(jian)例如圖7)：

5'-GTGAGTGATGGTTGAGGATGAGTGGU-3'(SEQ ID NO：3)

擴增(zeng)后，使用DNA純化(hua)柱純化(hua)DNA產物(wu)。尿嘧(mi)(mi)啶-DNA糖基(ji)(ji)化(hua)酶(mei)(UDG)和DNA糖基(ji)(ji)化(hua)酶(mei)裂解酶(mei)內切(qie)(qie)核酸(suan)(suan)酶(mei)VIII的混(hun)合物(wu)用于移除(chu)(chu)引(yin)物(wu)序列(lie)中(zhong)的U堿(jian)(jian)基(ji)(ji)。UDG催化(hua)尿嘧(mi)(mi)啶基(ji)(ji)團的切(qie)(qie)除(chu)(chu)，而內切(qie)(qie)核酸(suan)(suan)酶(mei)VIII移除(chu)(chu)非嘧(mi)(mi)啶堿(jian)(jian)基(ji)(ji)。

用DNA純化(hua)柱純化(hua)所述有缺口的(de)DNA。用Zn++離子作(zuo)為催化(hua)離子的(de)S1核酸酶在切口位點切開單鏈DNA。由此，在DNA的(de)兩個末(mo)端的(de)原始(shi)引(yin)物序列(lie)都被移(yi)除。

T4聚合(he)酶也(ye)可用(yong)于移(yi)除(chu)引物序列。酶會(hui)找到缺(que)口并在缺(que)口位點從3’至(zhi)5’進行消化。移(yi)除(chu)頂(ding)鏈(lian)(lian)后，酶將移(yi)除(chu)3’突出(chu)，即底鏈(lian)(lian)。

用DNA純(chun)化(hua)柱純(chun)化(hua)DNA產(chan)物。該(gai)DNA將可以直接用于文庫構建進行(xing)下一(yi)代測序實驗。

實施例5

大量微滴(di)/微孔中分開(kai)進行(xing)單細胞DNA片段的PCR擴增(zeng)

可以覆蓋單(dan)細(xi)胞DNA的全基因(yin)組的PCR擴增子作為起(qi)始材料。

可(ke)如下使用本領域技術人員已知的其他擴增方法。

將(jiang)產物分成千萬(wan)個皮升級微(wei)滴/微(wei)孔(kong)或(huo)(huo)飛升級微(wei)滴/微(wei)孔(kong)。可(ke)使用商業(ye)可(ke)用的(de)(de)(de)基于(yu)微(wei)流體的(de)(de)(de)液(ye)滴乳化劑或(huo)(huo)者有皮升或(huo)(huo)飛升的(de)(de)(de)孔(kong)的(de)(de)(de)微(wei)流體設備。通(tong)過(guo)在(zai)各(ge)反應微(wei)滴/微(wei)孔(kong)中達到(dao)擴(kuo)增(zeng)(zeng)飽和(he)(或(huo)(huo)通(tong)過(guo)可(ke)用的(de)(de)(de)引物或(huo)(huo)dNTP限制擴(kuo)增(zeng)(zeng))將(jiang)單(dan)個DNA片(pian)段(duan)擴(kuo)增(zeng)(zeng)到(dao)類似的(de)(de)(de)水平。

可(ke)以在1千萬個微(wei)滴/微(wei)孔中(zhong)的每(mei)個中(zhong)實行PCR反(fan)應以擴(kuo)增(zeng)單個擴(kuo)增(zeng)子。

94℃-20秒

58℃-20秒

65℃-1分鐘

72℃-1分鐘

重復上述循環20次

72℃-5分鐘

4℃–∞

從每(mei)個微滴(di)/微孔中收集(ji)DNA產(chan)物并使用商業純化(hua)柱或乙醇(chun)沉淀進行(xing)純化(hua)。

實施例6

大量微滴/微孔中分(fen)開進行單(dan)細胞DNA片段(duan)的SDA

鏈(lian)置換(huan)擴增(SDA)用于形(xing)成單個(ge)片段。然(ran)而，與正常SDA反應相(xiang)比，擴增時間最小化為10至30分(fen)鐘。這將避免超分(fen)支(zhi)(hyperbranch)的(de)形(xing)成和超支(zhi)化單鏈(lian)DNA引起的(de)擴增偏差(cha)。

加入新置換酶(Phi29)，并將反應分成1千萬個(ge)皮(pi)升級微滴(di)(di)/微孔或(huo)者飛(fei)升級微滴(di)(di)/微孔。可(ke)使(shi)用商業可(ke)用的基于(yu)微流(liu)體的液滴(di)(di)乳化劑或(huo)有(you)皮(pi)升或(huo)飛(fei)升的孔的微流(liu)體設(she)備。

可在(zai)30度下繼續進行鏈置換擴增(zeng)(SDA)以在(zai)各個微(wei)滴/微(wei)孔中擴增(zeng)單(dan)個DNA片(pian)段(duan)。大多數個體微(wei)滴/微(wei)孔中沒(mei)有DNA片(pian)段(duan)，或DNA片(pian)段(duan)數量有限。延長(chang)SDA的實(shi)行時間(12小時)以達到飽和。

通過(guo)在分開的孔中擴(kuo)(kuo)增單個(ge)片段(duan)(duan)，該反(fan)應避免(mian)了片段(duan)(duan)的干(gan)擾和(he)競爭。通過(guo)在每個(ge)反(fan)應微滴/微孔中達到擴(kuo)(kuo)增的飽和(he)(或通過(guo)可用的引(yin)物或dNTP限制(zhi)擴(kuo)(kuo)增)將單個(ge)DNA片段(duan)(duan)擴(kuo)(kuo)增到類似(si)的水平(ping)。

從每個微滴/微孔(kong)中收集DNA產(chan)物(wu)并使用商(shang)業(ye)純化(hua)柱或乙醇沉淀進行純化(hua)。

可如(ru)下(xia)使用本領(ling)域技術人員已知(zhi)的其他擴增方法。可以如(ru)本文所述使用本領(ling)域技術人員已知(zhi)的其他形成大規(gui)模單個(ge)反應(ying)的方法。

實施例7

大量微(wei)滴/微(wei)孔中分開進行單細胞RNA片段的PCR擴增(zeng)

可用(yong)通過單細胞RNA轉(zhuan)錄物的逆轉(zhuan)錄產生的cDNA作為起(qi)始材料。

可(ke)如下使用本領(ling)域技(ji)術人(ren)員已知的(de)其他擴(kuo)增方法。

將(jiang)產物分成千萬個(ge)皮升(sheng)級微(wei)滴(di)(di)(di)/微(wei)孔(kong)或(huo)(huo)飛升(sheng)級微(wei)滴(di)(di)(di)/微(wei)孔(kong)。可(ke)使用(yong)商業可(ke)用(yong)的基于微(wei)流(liu)體的液滴(di)(di)(di)乳化劑(ji)或(huo)(huo)有皮升(sheng)或(huo)(huo)飛升(sheng)的孔(kong)的微(wei)流(liu)體設備。通過(guo)在各反(fan)應微(wei)滴(di)(di)(di)/微(wei)孔(kong)中達(da)到(dao)擴增飽和(或(huo)(huo)通過(guo)可(ke)用(yong)的引(yin)物或(huo)(huo)dNTP限制擴增)將(jiang)單個(ge)DNA片段擴增到(dao)類似的水(shui)平(ping)。

可以在1千萬個(ge)(ge)微(wei)滴/微(wei)孔(kong)的(de)每個(ge)(ge)當中實行單個(ge)(ge)擴(kuo)增子(zi)的(de)PCR反應(ying)。

94℃-20秒

58℃-20秒

65℃-1分鐘

72℃-1分鐘

重復上述循環20次

72℃-5分鐘

4℃–∞

從每個微滴/微孔中收集(ji)DNA產物(wu)并使用商(shang)業純化柱或乙醇沉(chen)淀進行純化。

實施例8

用于(yu)人類癌癥(zheng)樣(yang)品(pin)的方法(fa)

可使用(yong)本實施方案(an)的(de)(de)方法(fa)和組合物用(yong)于表(biao)征腫(zhong)瘤發生的(de)(de)復雜的(de)(de)演(yan)變(bian)(bian)過程(cheng)。與實體癌(ai)的(de)(de)大規模測序(xu)的(de)(de)努力相比，可將測序(xu)研究的(de)(de)前沿推向能夠在(zai)例如臨(lin)床環(huan)境(jing)中(zhong)得到恢復的(de)(de)腫(zhong)瘤最(zui)早期。這僅在(zai)有(you)單(dan)細胞全基(ji)因組擴(kuo)增測定(ding)時(shi)變(bian)(bian)得合理(li)，該測定(ding)允許得到上文(wen)描(miao)述(shu)的(de)(de)準確的(de)(de)SNV結果和使用(yong)臨(lin)床樣品進行有(you)效的(de)(de)單(dan)細胞分離測定(ding)法(fa)。

從臨床組織樣(yang)品(pin)分(fen)離(li)單(dan)細胞

為了對(dui)臨床樣品(pin)應用所(suo)述(shu)新穎(ying)的(de)單(dan)細(xi)胞(bao)(bao)分析，可(ke)(ke)(ke)以(yi)(yi)利用有效方(fang)法(fa)對(dui)目的(de)的(de)細(xi)胞(bao)(bao)進(jin)行分離(li)(li)。例如可(ke)(ke)(ke)通過(guo)酶解(jie)(jie)獲得組織(zhi)樣本的(de)單(dan)細(xi)胞(bao)(bao)懸浮液(ye)。然(ran)而，這樣會失去解(jie)(jie)離(li)(li)細(xi)胞(bao)(bao)附近的(de)信息。另一(yi)種可(ke)(ke)(ke)獲得形態學信息的(de)方(fang)法(fa)是顯微(wei)激光解(jie)(jie)剖(pou)。然(ran)而，就激光顯微(wei)解(jie)(jie)剖(pou)的(de)可(ke)(ke)(ke)用性，其不能保(bao)證得到一(yi)個完整的(de)單(dan)細(xi)胞(bao)(bao)。為了從目的(de)組織(zhi)結(jie)構中獲得完整的(de)細(xi)胞(bao)(bao)，可(ke)(ke)(ke)以(yi)(yi)在(zai)研(yan)究中結(jie)合所(suo)述(shu)兩種測定(ding)。可(ke)(ke)(ke)制備100微(wei)米(mi)厚(hou)的(de)組織(zhi)切(qie)片并從解(jie)(jie)剖(pou)的(de)組織(zhi)中切(qie)割單(dan)個組織(zhi)單(dan)元(即單(dan)個腺體、管道(dao)等)。本節的(de)。通過(guo)這樣做，可(ke)(ke)(ke)以(yi)(yi)保(bao)證有完整的(de)單(dan)細(xi)胞(bao)(bao)在(zai)解(jie)(jie)剖(pou)組織(zhi)中。下(xia)一(yi)步可(ke)(ke)(ke)應用酶解(jie)(jie)離(li)(li)。可(ke)(ke)(ke)以(yi)(yi)通過(guo)明場顯微(wei)鏡(jing)成像記錄(lu)整個消化過(guo)程。

早期腫瘤發展(zhan)中的(de)基因組異質性

考(kao)慮(lv)到組(zu)織中有成千上(shang)萬個(ge)(ge)細(xi)(xi)胞(bao)，因此器官中的(de)(de)(de)某個(ge)(ge)細(xi)(xi)胞(bao)隨(sui)機(ji)地進行驅(qu)(qu)動突變很可能(neng)并(bing)不(bu)(bu)奇怪。考(kao)慮(lv)到基(ji)因組(zu)是三十(shi)億個(ge)(ge)堿(jian)基(ji)的(de)(de)(de)集合，在第(di)一(yi)個(ge)(ge)驅(qu)(qu)動突變后(hou)，此細(xi)(xi)胞(bao)極(ji)少會獲(huo)得第(di)二個(ge)(ge)驅(qu)(qu)動突變。事(shi)實上(shang)，在獲(huo)得第(di)一(yi)個(ge)(ge)驅(qu)(qu)動突變后(hou)(PanIN中的(de)(de)(de)Kras)，細(xi)(xi)胞(bao)可逃避正常(chang)的(de)(de)(de)分化并(bing)開(kai)始(shi)增(zeng)殖(zhi)(zhi)和(he)重編(bian)程(cheng)。在擴大后(hou)，這(zhe)群異常(chang)的(de)(de)(de)前體細(xi)(xi)胞(bao)可遇(yu)到內(nei)部和(he)外部的(de)(de)(de)危機(ji)，即(ji)端(duan)粒危機(ji)、免疫攻擊和(he)缺氧。其(qi)結果(guo)是，人(ren)們可以預(yu)料到增(zeng)加的(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)死亡和(he)減緩的(de)(de)(de)增(zeng)殖(zhi)(zhi)。該階段的(de)(de)(de)存(cun)在可以表(biao)現為發(fa)育(yu)(yu)不(bu)(bu)良，這(zhe)可能(neng)是癌(ai)癥發(fa)展(zhan)的(de)(de)(de)關鍵階段。發(fa)育(yu)(yu)不(bu)(bu)良可存(cun)活(huo)多年，積累(lei)高度的(de)(de)(de)基(ji)因組(zu)異質性。

隨(sui)著對腫(zhong)瘤(liu)(liu)(liu)的(de)(de)(de)全基因(yin)組測序(xu)，在(zai)不同類型的(de)(de)(de)成人癌癥(zheng)(Stratton，2011)中(zhong)(zhong)腫(zhong)瘤(liu)(liu)(liu)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)通(tong)常積(ji)累1000-10000個(ge)(ge)體(ti)(ti)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)突(tu)變(bian)(bian)。該數字設定了前體(ti)(ti)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)發(fa)展成癌癥(zheng)所(suo)必須的(de)(de)(de)突(tu)變(bian)(bian)數量(liang)范(fan)圍(wei)。因(yin)此，預(yu)期(qi)(qi)成千上萬的(de)(de)(de)突(tu)變(bian)(bian)在(zai)發(fa)育不良細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)潛伏(fu)期(qi)(qi)積(ji)累。爭議在(zai)于僅當(dang)大量(liang)前體(ti)(ti)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)已經獲得(de)廣(guang)泛(fan)突(tu)變(bian)(bian)時，其中(zhong)(zhong)某個(ge)(ge)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)可以經過(guo)下一輪重要的(de)(de)(de)驅動突(tu)變(bian)(bian)。一旦(dan)發(fa)生，可預(yu)期(qi)(qi)該細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)會得(de)到相比其他巨大細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)增殖(zhi)(zhi)優勢(shi)并(bing)形成大得(de)多(duo)的(de)(de)(de)克(ke)隆性擴張(zhang)；該增殖(zhi)(zhi)期(qi)(qi)對應腫(zhong)瘤(liu)(liu)(liu)形成的(de)(de)(de)時期(qi)(qi)(圖8)。面對各種類型的(de)(de)(de)危機，發(fa)育不良和腫(zhong)瘤(liu)(liu)(liu)形成可能有多(duo)重時期(qi)(qi)且其要在(zai)一個(ge)(ge)腫(zhong)瘤(liu)(liu)(liu)中(zhong)(zhong)共存(cun)。然而，由于細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)群體(ti)(ti)越(yue)來(lai)越(yue)大，克(ke)隆性演化加速(su)并(bing)最(zui)終導致惡(e)性轉化。

根(gen)據上(shang)述早(zao)期癌癥發(fa)展的(de)景象，我們希望在(zai)(zai)發(fa)育(yu)不良時(shi)期見到高度基因組異質性(xing)。在(zai)(zai)腫瘤性(xing)細胞之間(jian)異質性(xing)可能較少(shao)。通過對(dui)比發(fa)育(yu)不良和腫瘤形成之間(jian)的(de)突(tu)變，我們能找到導致(zhi)此轉化(hua)的(de)潛在(zai)(zai)突(tu)變。

在胰(yi)腺(xian)癌的(de)情況下，Kras、p16、p53和(he)SMAD4基(ji)本上是最(zui)顯著的(de)驅動(dong)突(tu)(tu)變。人們普(pu)遍(bian)認為，Kras基(ji)因(yin)突(tu)(tu)變是第(di)一驅動(dong)突(tu)(tu)變，因(yin)為它發生于(yu)90％以上的(de)胰(yi)腺(xian)癌中。即使在低(di)級(ji)別PanIN-1A的(de)病(bing)變中亦包(bao)括Kras基(ji)因(yin)突(tu)(tu)變。當腫瘤性本質還沒有明確建立時，被記(ji)為PanIN/L-1A。該級(ji)別對應可以臨床樣本中采集的(de)最(zui)早期(qi)的(de)PanIN病(bing)變。由于(yu)細胞稀少，所(suo)以可使用單細胞全基(ji)因(yin)組測序揭(jie)示低(di)級(ji)別PanIN/L-1A中的(de)基(ji)因(yin)組抑制性。從PanIN-1A至PanIN-2期(qi)，可獲得(de)其他關鍵突(tu)(tu)變如p16、p53或SMAD4，此時預期(qi)的(de)是腫瘤的(de)發展。

基因組(zu)異質性的(de)早期階段(duan)還將(jiang)包括由(you)于(yu)端粒危機或(huo)其他壓(ya)力(li)造(zao)成的(de)非整(zheng)倍(bei)(bei)體(ti)。這種染色體(ti)異常(chang)已(yi)在結直腸癌(ai)和乳腺癌(ai)腺瘤中(zhong)被廣泛觀察到(dao)。通過復制(zhi)或(huo)刪除(chu)大的(de)染色體(ti)片(pian)段(duan)，非整(zheng)倍(bei)(bei)體(ti)可能會導(dao)致(zhi)細胞(bao)死亡，或(huo)者備選地對細胞(bao)施壓(ya)朝(chao)向(xiang)重編程方向(xiang)進行。顯然非整(zheng)倍(bei)(bei)體(ti)會影響(xiang)進化動(dong)力(li)學(xue)，如果這些刪除(chu)發生在有(you)關鍵腫瘤抑(yi)制(zhi)子基因的(de)區域(yu)，其還可起(qi)到(dao)驅動(dong)作用導(dao)致(zhi)惡性轉化。非整(zheng)倍(bei)(bei)體(ti)是否起(qi)到(dao)導(dao)致(zhi)腫瘤形(xing)成的(de)驅動(dong)作用或(huo)只是起(qi)到(dao)支持(chi)作用以增加發育不良細胞(bao)的(de)存(cun)活，這一點(dian)將(jiang)在本研究(jiu)中(zhong)得到(dao)解決。

參考文獻

Cheng J,Vanneste E,Konings P,Voet T,Vermeesch JR,Moreau Y.Single-cell copy number variation detection.Genome biology.2011；12(8):R80.doi:10.1186/gb-2011-12-8-r80.PubMed PMID:21854607；PubMed Central PMCID:PMC3245619.

Dean FB,Hosono S,Fang L,Wu X,Faruqi AF,Bray-Ward P,et al.Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification.Proceedings of the National Academy of Sciences.2002；99(8):5261-6.doi:10.1073/pnas.082089499.

Dean FB,Nelson JR,Giesler TL,Lasken RS.Rapid Amplification of Plasmid and Phage DNA Using Phi29DNA Polymerase and Multiply-Primed Rolling Circle Amplification.Genome Res.2001；11(6):1095-9.doi:10.1101/gr.180501.

Fan HC,Wang J,Potanina A,Quake SR.Whole-genome molecular haplotyping of single cells.Nature biotechnology.2011；29(1):51-7.doi:10.1038/nbt.1739.PubMed PMID:21170043.

Hou Y,Song L,Zhu P,Zhang B,Tao Y,Xu X,et al.Single-cell exome sequencing and monoclonal evolution of a JAK2-negative myeloproliferative neoplasm.Cell.2012；148(5):873-85.doi:10.1016/j.cell.2012.02.028.PubMed PMID:22385957.

Lao K,Xu N,Straus N.Whole genome amplification using single-primer PCR.Biotechnol Journal.2008；3(3):378.

Navin N,Kendall J,Troge J,Andrews P,Rodgers L,Mclndoo J,et al.Tumour evolution inferred by single cell sequencing.Nature.2011；472(7341):90-4.doi:10.1038/nature09807.PubMed PMID:21399628.

Stratton MR.Exploring the genomes of cancer cells:progress and promise.Science.2011；331(6024):1553-8.doi:10.1126/science.1204040.PubMed PMID:21436442.

Telenius H,Carter NP,Bebb CE,Nordenskjold M,Ponder BA,Tunnacliffe A.Degenerate oligonucleotide-primed PCR:general amplification of target DNA by a single degenerate primer.Genomics.1992；13(3):718-25.PubMed PMID:1639399.

Zhang K,Martiny AC,Reppas NB,Barry KW,Malek J,Chisholm SW,et al.Sequencing genomes from single cells by polymerase cloning.Nature biotechnology.2006；24(6):680-6.doi:10.1038/nbt 1214.PubMed PMID:16732271.

Zhang L,Cui X,Schmitt K,Hubert R,Navidi W,Arnheim N.Whole genome amplification from a single celkimplications for genetic analysis.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.1992；89(13):5847-51.PubMed PMID:1631067；PubMed Central PMCID:PMC49394.

雖然已經詳細描述了本發(fa)明及其優勢，但是(shi)應當理解(jie)，在(zai)(zai)不(bu)脫離由所附權(quan)利(li)要(yao)求限定的(de)(de)(de)本發(fa)明的(de)(de)(de)精神和(he)范圍的(de)(de)(de)情況(kuang)下，可以(yi)對(dui)此進行各種變(bian)化、替換和(he)改變(bian)。此外(wai)，本申請的(de)(de)(de)范圍不(bu)旨在(zai)(zai)受限于說(shuo)明書中描述的(de)(de)(de)過程(cheng)、機器、制作(zuo)、物(wu)質組(zu)成、方(fang)(fang)(fang)(fang)式、方(fang)(fang)(fang)(fang)法(fa)和(he)步驟的(de)(de)(de)具體實(shi)施方(fang)(fang)(fang)(fang)案。本領域普通技術人員(yuan)從本發(fa)明的(de)(de)(de)公開內(nei)(nei)容(rong)中將(jiang)容(rong)易地理解(jie)，根據本發(fa)明可使用目前存(cun)在(zai)(zai)或(huo)以(yi)后(hou)會(hui)開發(fa)的(de)(de)(de)過程(cheng)、機器、制作(zuo)、物(wu)質組(zu)成、方(fang)(fang)(fang)(fang)式、方(fang)(fang)(fang)(fang)法(fa)或(huo)步驟實(shi)行基(ji)本上與本文描述的(de)(de)(de)對(dui)應實(shi)施方(fang)(fang)(fang)(fang)案相同的(de)(de)(de)功能(neng)或(huo)實(shi)現基(ji)本上相同的(de)(de)(de)結果。因此，所附權(quan)利(li)要(yao)求旨在(zai)(zai)將(jiang)這些過程(cheng)、機器、制作(zuo)、物(wu)質組(zu)成、方(fang)(fang)(fang)(fang)式、方(fang)(fang)(fang)(fang)法(fa)或(huo)步驟包括在(zai)(zai)其范圍內(nei)(nei)。

序列表

<110> Zong, Chenghang

<120> 單(dan)細(xi)胞全基(ji)因組線(xian)性擴增法(fa)

<130> BAYM.P0124WO

<140> UNKNOWN

<141> 2015-05-05

<150> 61/989,002

<151> 2014-05-06

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的(de)引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (27)..(31)

<223> n是a, c, g,或t

<400> 1

gtgagtgatg gttgaggatg agtggtnnnn nggg 34

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的(de)引(yin)物

<220>

<221> misc_feature

<222> (27)..(31)

<223> n是(shi)a, c, g,或t

<400> 2

gtgagtgatg gttgaggatg agtggtnnnn nttt 34

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(lie)

<220>

<223> 合成的引(yin)物(wu)

<400> 3

gtgagtgatg gttgaggatg agtggu 26

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人(ren)工(gong)序(xu)列

<220>

<223> 合成(cheng)的(de)引物(wu)

<400> 4

gtgagtgatg gttgaggatg agtggt 26

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的(de)引物

<400> 5

gtgagtgatg gttgaggatg agtg 24