一種以重組運動發酵單胞菌利用秸稈產乙醇的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物發酵技術領域，特別設及一種W重組運動發酵單胞菌利用賴桿 產乙醇的方法。
【背景技術】
[0002] 賴桿的能源化是新形勢下賴桿的一種利用方式。世界其他一些國家已較早的嘗試 了賴桿能源化的探索。丹麥是世界上首先用賴桿發電的國家之一。在美國，部分賴桿通過 較為傳統的方法利用；一部分賴桿作為原料，通過發酵的方式產生燃料乙醇來代替傳統液 體能源。同時，日本、加拿大可開始了賴桿能源化的研究，并在利用賴桿提取酒精方面取得 了進展。
[0003] 賴桿的主要成分是纖維素，要想利用賴桿必須將纖維素降解。纖維素酶不是單純 的某一種酶，而是一系列酶的總稱，能將纖維素降解為短鏈纖維素分子、纖維二塘和葡萄 糖。纖維素酶主要包括Ξ種成分，能分別降解特定的糖巧鍵。（l)ci酶（簡稱CBH)。它是 一種外切酶，作用于無取代基的還原端，依次水解β-1，4糖巧鍵（2)Cx酶（簡稱EG)。它是 一種內切酶，作用于纖維素分子內部的非結晶區，隨機水解β-1,4糖巧鍵，產生大量非還 原末端的小分子纖維素；（3)β-葡萄糖巧酶（簡稱βG)。它水解纖維二糖和短鏈的纖維 寡糖，生成葡萄糖，對纖維二糖和纖維Ξ糖的水解速度較快，隨著葡萄糖聚合度的增加水解 速度下降。
[0004] 很多微生物均可產生纖維素酶，如真菌，細菌，放線菌。但細菌產纖維素酶的產量 較低，目前主要用于產纖維素酶的微生物為真菌，如木霉屬，曲霉屬，青霉屬。本章節利用里 氏木霉和黑曲霉混合發酵制備纖維素酶。
[0005] 里氏木霉纖維素酶產量高，并且產生的纖維素酶是胞外酶，易與菌體分離純化從 而得到所需的酶。里氏木霉產生的纖維素酶主要包括內切葡聚糖酶（C1酶）、纖維二糖酶 (Cx酶）及β-葡萄糖巧酶。
[0006] 里氏木霉菌株雖然產生的內切型和外切型葡聚糖酶活力較高，但是β-葡萄糖巧 酶的活力比較低，分解纖維二糖的能力不夠強。而黑曲霉產生的β-葡萄糖巧酶具有較高 的酶活力，通過加入產自黑曲霉的β-葡萄糖巧酶，或者通過使用里氏木霉和黑曲霉共同 培養，可W有效地緩解纖維素酶降解纖維素過程中因纖維二糖的積累而產生的產物反饋抑 制現象。
[0007] 運動發酵單胞菌Ζ.mobilis是一種革蘭氏陰性菌，是發酵單胞菌屬的一個種，因 具有很強的運動性而得名。大多呈直桿狀，尾端呈圓形或卵圓形，常成對存在，但很少集結 成短鏈狀。兼性厭氧條件生長，在無氧條件下生長最佳，有氧條件下也可生存，高度耐酸，能 在抑3. 5~7. 5之間生長。運動發酵單胞菌利用化tner-Doudomff途徑代謝生產乙醇，運 種途徑耗能較少，產量較高。Z.mobilis作為乙醇生產菌株具有一定優良的特性：如較高 的乙醇產率，較強的乙醇耐受性，W及高度發酵底物專一性。與酵母相比，運動發酵單胞菌 乙醇產量比酵母要高5%~10%，可達理論值的97%，乙醇轉化率是酵母的5倍。但是，Z. mobills也有自身的局限性，底物利用范圍較窄，只能利用葡萄糖、果糖和薦糖。近來已有人 利用基因工程的方法對其不利因素進行了改造，使其能夠利用多種底物。

【發明內容】

[0008] 本發明的目的是提供一種W重組運動發酵單胞菌利用賴桿產乙醇的方法。該方法 W賴桿為基質，利用黑曲霉和木霉混合發酵，制作粗酶液，產生纖維素酶，用粗酶液對賴桿 進行處理，將賴桿中的纖維素分解產生還原糖。最后用重組運動發酵單胞菌發酵酶解后的 還原糖，產生乙醇。
[0009] 本發明的目的通過如下技術方案實現： 一種W重組運動發酵單胞菌利用賴桿產乙醇的方法，步驟如下： 一、 氨爆預處理賴桿：將賴桿粉碎至200目細微粉末狀，將粉碎后的賴桿與水按照重 量比為賴桿：水=5:2的比例混勻，在密封條件下加熱攬拌，使其在溫度為130-15(TC之間， 壓力在0. 4Mpa條件下反應6-8min，反應結束后，瞬間放氣，待其冷卻后，即得到預處理的賴 桿； 二、 纖維素粗酶液的制備：（1)分別對里氏木霉菌和黑曲霉菌進行培養、活化、發酵后 得到里氏木霉發酵液和黑曲霉菌發酵液；（2)將里氏木霉發酵液和黑曲霉菌發酵液按照體 積比為1:1的條件進行混合，將兩者的混合液在4°C下，于8000巧m的轉速下離屯、lOmin，取 其上清液并將其轉移到另一離屯、管中在相同條件下進行第二次離屯、，取上清液，即得纖維 素酶粗酶液； Ξ、酶解賴桿：將上步所得纖維素酶粗酶液加入到預處理的賴桿中，在50°C的條件下， 酶解4天后接種重組運動發酵單胞菌，在32°C的搖床中厭氧、靜置發酵，發酵時間6化即得； 所述纖維素酶粗酶液：賴桿=12ml:1邑。
[0010] 所述里氏木霉菌和黑曲霉菌培養、活化和發酵的操作方法一樣，方法如下：將里氏 木霉菌或黑曲霉菌接種在PDA固體培養基中，在28Γ恒溫條件下密封培養3-5天后，用滅菌 處理過的生理鹽水將其生成的抱子從培養基上洗涂下來，并用移液槍將成團狀存在的抱子 打碎，使之完全分散，并稀釋至至1〇7個/ml的濃度，得到里氏木霉抱子懸浮液或黑曲霉抱 子懸浮液；然后將里氏木霉抱子懸浮液或黑曲霉抱子懸浮液W10%的接種量接種于種子培 養基中，在搖床中培養4化后得到活化的里氏木霉菌液或活化的黑曲霉菌液；所述培養條 件為：溫度28°C，轉速15化pm; (2)將上述活化的里氏木霉菌液或活化的黑曲霉菌液按10% 的接種量接種到發酵培養基中發酵7天得到里氏木霉發酵液或黑曲霉菌發酵液，所述發酵 條件為：溫度28°C，轉速15化pm。
[0011] 所述重組運動發酵單胞菌的培養方法如下：用普通ZM種子培養基活化運動發酵 菌：將運動發酵菌按10%的接種量接入種子培養基，置于32°C的恒溫搖床中，靜置活化lOh， 取生長lOh后的種子液1. 4ml按10%的接種量（v/v)接種ZM種子培養基，置于32°C的恒溫 搖床中，二次靜置活化，生長2地，測量0D600吸光度，當0D600吸光度達到10時，即得到活 化運動發酵菌，取活化運動發酵菌菌種，依次采用離屯、、水洗的方式去除含有的葡萄糖W及 乙醇，同時用不含葡萄糖的普通ZM種子培養基將離屯、、水洗后的活化運動發酵菌菌種懸起 并混勻即得到重組運動發酵單胞菌。
[0012] 所述種子培養基包括下述質量濃度的原料：氨爆預處理的賴桿10g/l，教皮5g/ L酵母提取物5g/l，膜蛋白腺3g/l，吐溫-80為40滴/L，Mandles微量元素鹽溶液1ml/L，Mandles營養鹽濃溶液lOOml/L，抑為4. 8的濃度為Imol/L的巧樣酸緩沖液50ml/L。
[0013] 所述發酵培養基包括下述質量濃度的原料：氨爆預處理的絕干賴桿30g/l，教皮 25g/l，酵母提取物10g/l，蛋白腺3g/l，吐溫-80為40滴/L，Mandles微量元素鹽溶液 lml/L，Mandles營養鹽濃溶液lOOml/L，抑為4. 8的濃度為Imol/L的巧樣酸緩沖液50ml/ L。
[0014] 本發明的作用機理為：運動發酵單胞菌作為乙醇生產菌株具有一定優良的特性：如較 高的乙醇產率，較強的乙醇耐受性，但是，運動發酵單胞菌也有自身的局限性，底物利用范 圍較窄，不能直接作用于纖維素。本發明中利用黑曲霉和木酶水解混合發酵賴桿產生纖維 素酶粗酶液，并對賴桿進行酶解產生還原糖。并對纖維素酶粗酶液的發酵過程進行優化。通 過將傳統的黑曲霉和木霉混合發酵產纖維素酶改進為分別發酵再對粗酶液進行混合，有效 地改善了因纖維二糖的積累而產生的產物反饋抑制現象，提高纖維素酶的活性和產