一種人工合成的抗蟲基因及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種人工合成的抗蟲基因及其應用，特別設及一種根據玉米偏好密碼 子設計并合成的抗蟲基因及其應用。
【背景技術】
[0002] 目前在植物轉基因育種中所應用的外源基因如化、EPSPS等，大多來自原核生物， 由于原核生物基因自身的特點，如DAT含量較高，超過60%，造成基因表達的mRNA在植物 體內極易被降解；2)存在類似真核基因的內含子切點、轉錄終止子序列，造成轉錄不完整、 mRNA異常剪切等；3)密碼子與植物密碼子存在較大差異，造成蛋白翻譯效率降低；4)其結 構與植物等真核生物差異顯著，如不含有真核生物基因的5' -UTR序列和3'末端的polyA 加尾序列，導致基因在植物體內往往表達水平較低。例如，來自于蘇云金芽抱桿菌的野生型 殺蟲蛋白基因在植物中的表達量非常低，其表達的毒蛋白只占總蛋白的0.001%或者幾乎 檢測不到。
[0003] 玉米懼是世界性的主要玉米害蟲，每年因玉米懼危害造成玉米產量損失在5%左 右。我國是玉米懼的多發和重發區，20世紀70年代W來，幾乎每兩年就大發生一次，年損失 玉米380-640萬噸，相當于一個中等玉米省的產量。
[0004] 由于玉米的內源抗蟲性是受多基因控制的，且屯、葉期祀標害蟲和穗期祀標害蟲基 因各自獨立遺傳，用常規育種方法培育抗懼雜交種不僅周期長，而且很難獲得兼抗兩個世 代玉米懼的親本。同時，玉米抗懼基因很有可能與高產性狀呈負相關，20年來各國抗懼育種 均未取得明顯進展。

【發明內容】
陽〇化]本發明的一個目的是提供一種DNA分子，該DNA分子是抗蟲基因。
[0006] 本發明所提供的DNA分子，名稱為mcrylAh，其核巧酸序列為序列表中序列3或序 列3的第1-2007位。
[0007] 所述DNA分子的核巧酸序列還可為與序列表中序列3或序列3的第1-2007位至 少具有98%的同一性，且編碼序列9所不蛋白質（命名為化ylAh蛋白）。
[0008] 其中，序列3由2010個核巧酸組成，其末尾處為兩個終止密碼子，編碼序列9所示 的化ylAh蛋白。序列9由668個氨基酸組成。
[0009] 含有所述DNA分子（mcrylAh)的重組載體、重組宿主菌、重組細胞系或轉基因植物 也屬于本發明的保護范圍。
[0010] 根據需要，所述重組載體既可為克隆載體，也可為表達載體；在本發明的一個實施 例中，所述重組載體具體為PS3300-UMG2-UC2A。在本發明的一個實施例中，所述重組宿主菌 為攜帶有所述DNA分子的農桿菌，如LBA4404。所述重組細胞系可W為真核細胞，也可W為 原核細胞，如植物細胞系。所述轉基因植物（如玉米）包括種子、愈傷組織、完整植株和細 胞。
[0011] 由所述DM分子（mcrylAh)轉錄所得的RNA也屬于本發明的保護范圍。
[0012] 所述DNA分子（mcrylAh)在培育抗蟲轉基因玉米中的應用也屬于本發明的保護范 圍。所述轉基因玉米包括種子、愈傷組織、完整植株和細胞。
[0013] 所述DNA分子（mcrylAh)在提高玉米化ylAh蛋白表達量中的應用也屬于本發明 的保護范圍。所述化ylAh蛋白為序列表中序列9所不的蛋白質。
[0014] 在本發明的一個實施例中，所述玉米具體為玉米化II。
[0015] 在本發明中，所述抗蟲具體為抗玉米懼。
[0016] 本發明針對原核生物抗蟲基因化ylAh(序列1)在植物中表達較低的問題，在保持 原氨基酸序列不變的前提下，采用玉米偏好性密碼子對其進行優化，去除影響RNA穩定性 的結構（如polyA、重復序列、AT和GC串聯重復、RNA二級結構、核糖體結合位點等），增加 GC含量等，使其在玉米中高效穩定表達。
[0017] 實驗證實，本發明所提供的人工合成的抗蟲基因（序列3)的轉基因玉米，其 化ylAh蛋白蛋白的表達量明顯提高，每克（鮮重）葉片中化ylAh蛋白的表達量可達 3. 18μg，而原始基因表達量僅為1.01μg。同時，本發明所提供的人工合成的抗蟲基因（序 列3)的轉基因玉米對祀標害蟲的抗性也明顯提高，轉入mcrylAh基因的Te代植株，在玉米 5-6葉期接蟲后，無明顯的蟲害，表現正常；而轉crylAh基因（優化前，序列2)及非轉基因 植株，在接蟲后，蟲害非常嚴重。
【附圖說明】
[0018]圖 1 為載體PS3300-UMCT-UMG2、PS3300-UMG2-UCA和PS3300-UMG2-UC2A的質粒 圖譜。其中，A為PS3300-UMCT-UMG2的質粒圖譜巧為PS3300-UMG2-UCA的質粒圖譜；C為 PS3300-UMG2-UC2A的質粒圖譜。
[0019] 圖2為轉基因玉米CrylAh基因、mCrylAh基因和mG2-aroA基因的PCR檢測圖譜。 其中，A為轉基因玉米化ylAh基因的PCR檢測圖譜；1 :〇r(質粒陽性對照）；2:Marker;3 : CK(未加DNA) ;4:CK(非轉基因玉米）；5-24:轉化ylAh基因玉米事件。B為轉基因玉米 mCrylAh基因的PCR檢測圖譜；1 :αΤ(質粒陽性對照）；2:Marker;3:CK(未加DNA) ;4 : CK(非轉基因玉米）；5-24:轉mCrylAh基因玉米事件。C為轉基因玉米mG2-aroA基因的 PCR檢測圖譜；1 :〇r(質粒陽性對照）；2:Marker;3:CK(未加DNA) ;4:CK(非轉基因玉 米）；5-14 :轉CrylAh基因玉米事件；15-24:轉mCrylAh基因玉米事件。
[0020] 圖3為轉基因玉米苗期草甘麟的耐受性檢測結果。
[002U 圖4為轉基因玉米田間抗蟲性檢測結果。其中，A為海南抗蟲的轉mCrylAh基因 玉米株系；B為海南不抗蟲的非轉基因對照株系。
【具體實施方式】
[0022] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0023] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0024] 實施例1、密碼子優化型抗蟲基因的獲得
[00巧]本實施例根據化ylAh全長基因（核巧酸序列如序列表中序列1所示，參見中國專 利申請：200410009918. 9)編碼蛋白的前667個氨基酸序列（前667個氨基酸序列如序列 表中序列8所示，對應的核巧酸序列如序列表中序列2所示），在保證氨基酸序列不變的前 提下，首先采用玉米偏好密碼子對化ylAh基因進行人工優化改造。盡量避免使用玉米稀有 密碼子，并調整了密碼子的使用頻率（表1)。在此基礎上，去除DNA序列中存在的典型的 造成植物基因轉錄本不穩定的富含AT序列，并去除了發夾結構，得到的新的核巧酸序列為 序列表中序列3。序列3與化ylAh基因（序列1)的l-20(nbp(即序列2)的同源性只有 70%，而G+C含量由原來的37. 4%增加到56. 3%。同時為了便于克隆，在起始密碼子后添 加GGCS個核巧酸。序列3所示基因即為密碼子優化型抗蟲基因，將其命名為mcrylAh。密 碼子在化ylAh基因和me巧lAh基因中的使用頻率見表1。為方便克隆，發明人在序列3的 5'端引入Spel酶切位點，在3'端引入Aatll酶切位點，最終序列如序列表中序列4所示。 序列4的第7-2016位即為序列3。序列1的第1-2001位（即序列2)編碼序列表中序列8 所示蛋白，序列3W及序列4的第7-2016位均編碼序列9所示蛋白（與序列8所示蛋白相 比多出序列9自N端起的第2個氨基酸殘基），將該蛋白命名為化ylAh蛋白。 陽0%] 表1玉米優選密碼子標準
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[0030] 實施例2、mcrylAh轉基因玉米的獲得
[0031] 一、重組表達載體PS3300-UMG2-UCA和PS3300-UMG2-UC2A的構建 W巧為了提高mcrylAh基因（序列扣在受體生物中的表達水平，發明人在構建mcrylAh基因的重組表達載體時，在me巧lAh基因的5'端添加了Ω序列和Kozak序列，Ω/ Kozak序列（簡稱0MK)如序列表中序列5所示。Ω序列是衍生于植物病毒衣殼蛋白基因 編碼區的翻譯增強序列，由67bp組成，富集TTAAC序列，5'端有一個UAUUUUUACAACAA序列 W及4個UUAC序列，運些序列在蛋白質合成的翻譯過程中構成核糖體和rRNA結合位點。 Kozak序列是促進外源基因在植物細胞內翻譯過程的編碼核糖體結合蛋白的序列。啟動子 選用組成性啟動子化i啟動子，其序列如序列表中序列6所示。再則，在編碼序列3'端設計 了2個連續的終止密碼子，W及加入人工合成的化lyA巧-N0S穩定終止序列。PolyA巧-N0S 序列如序列表中序列7所示。其中，PolyA具有維持mRNA穩定等作用，T-N0S終止序列確保 了翻譯的準確終止。
[0033] 攜帶有crylAh和mcrylAh基因的重組表達載體PS3300-UMG2-UCA和 PS3300-UMG2-UC2A的構建具體程序如下：
[0034] a.Spel和Aatll酶切PS3300-UMCT-UMG2質粒（質粒圖譜如圖1中A所示），回 收大片段。 陽03引其中，PS3300