一種測定生菜保衛細胞蔗糖轉化酶活力的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物學領域，涉及一種蔗糖轉化酶的測定方法，具體來說是一種測定生菜保衛細胞蔗糖轉化酶活力的方法。
【背景技術】
[0002]在植物生理研究和教學過程中，需要進行特定器官或組織蛋白酶的測定。雖然蔗糖轉化酶的測定方法已有不少報道，但組成植物與外界進行氣體和水分交換的氣孔的細胞，即保衛細胞的蔗糖轉化酶活力仍然較難測定。
【發明內容】
[0003]針對現有技術中的上述技術問題，本發明提供了一種測定生菜保衛細胞蔗糖轉化酶活力的方法，所述的這種測定生菜保衛細胞蔗糖轉化酶活力的方法解決了現有技術中測定保衛細胞的蔗糖轉化酶活力困難的技術問題。
[0004]本發明提供了一種測定生菜保衛細胞蔗糖轉化酶活力的方法，包括如下步驟:
[0005]1) 一個制備生菜保衛細胞原生質體的步驟；所述的生菜保衛細胞的分離是通過酶解離法進行的；
[0006]2) 一個提取生菜保衛細胞原生質體蛋白質的步驟；將步驟1)獲得的得到的生菜保衛細胞原生質體通過丙酮沉淀法提取；
[0007]3) 一個測定生菜保衛細胞原生質體蛋白質的步驟，所述的測定是通過考馬斯亮藍G-250法測定的；
[0008]4) 一個測定蔗糖轉化酶活力的步驟；得到的保衛細胞通過酶聯的方法測定酶化學反應的產物即葡萄糖含量，根據所產生的葡萄糖量、反應時間、保衛細胞的蛋白質含量計算蔗糖轉化酶的活性，酶活力=葡萄糖(毫克)/[反應時間(小時)*保衛細胞總蛋白量(微克)]。
[0009]進一步的，步驟1)中采用的酶為纖維素酶。
[0010]進一步的，一個制備生菜保衛細胞原生質體的步驟如下:
[0011](1)取生菜葉片，然后放于蒸餾水中，在玻璃板上撕取表皮條，用毛筆刷除去葉肉細胞，將收集到的表皮條切碎后放入到基質溶液中沖洗；
[0012](2)過濾后放入到酶解液中，25?30°C水浴反應0.5?2h后，在顯微鏡下觀察氣孔開度，氣孔開度呈飽滿橢圓狀時終止反應，過濾后用基本介質沖洗，再用重懸液懸浮表皮條，收集表皮條。
[0013]進一步的，所述的基質溶液由抗壞血酸、CaCl2、MgCl2、KH2P04、Mes和山梨醇組成，在所述的基質溶液中，所述的抗壞血酸的濃度為0.5mmol/L、CaClj^濃度為0.5mmol/L、]^012的濃度為0.5_31凡、1(!12?04的濃度為10 ymol/L、Mes的濃度為5mmol/L，山梨醇的濃度為540mM，PH為5?6。
[0014]進一步的，所述的酶解液由cellulysin、PVP-40、BSA、ΚΗ2Ρ04、抗壞血酸組成，在所述的第一酶解液中，cellulysin的質量百分比濃度為0.?%、PVP-40的質量體積比濃度為
0.1%, BSA的質量體積比濃度為0.25%、抗壞血酸的濃度為0.5mmol/L，使用時，在第一酶解液中加入基質溶液，所述的第一酶解液和基質溶液的體積比為55:45。
[0015]進一步的，所述的懸浮液由山梨醇、CaCl2、MgCl2、Mes組成，在所述的懸浮液中，山梨醇的濃度為0.54mol/L, 0&(:12的濃度為lmmol/L，MgCl 2的濃度為2mmol/L，Mes的濃度為5mmol/L，PH 為 5.5。
[0016]進一步的，一個提取生菜保衛細胞原生質體蛋白質的步驟如下:
[0017](1)將步驟1)獲得的得到的生菜保衛細胞原生質體中加入提取緩沖液，所述的提取緩沖液由質量百分比濃度為1%的SDS、甘油、巰基乙醇、雙蒸水組成，所述的SDS、甘油、巰基乙醇、雙蒸水的體積比為1ml:2ml:1ml:16ml，搖勾并放在1?6°C條件下提取3?lOmin ；
[0018](2)放置后的樣品充分搖勻，離心，上清液移入中加入2.5?3倍體積的預冷的丙酮-10?-30°C條件下過夜，之后，離心，棄上清，沉淀置于通風廚內使丙酮完全揮發，加入上樣緩沖液溶解沉淀，沉淀充分溶解后，離心，取上清液即為所提取的葉蛋白溶液。
[0019]進一步的，一個測定蔗糖轉化酶活力的步驟如下；
[0020](1)將原生質體懸浮混合液加入0.1M鹿糖開始反應，原生質體懸浮混合液和鹿糖溶液的體積比為1:9，25?35°C反應0.6?1.5h，80?90°C反應2?5min ;對照組是采用水替換原生質體懸浮混合液，在水中加入蔗糖，水和蔗糖溶液的體積比為1: 9，在85°C反應2 ?5min ；
[0021](2)將原生質體懸浮液組和對照組分別研磨，然后加入等體積的氯仿和異戊醇的混合溶液，氯仿和異戊醇的體積比為24:1，離心后取上清；
[0022](3)再加入占上清液體積7?15%體積的1M Tris-HCl溶液進行反應；優選的為7.5%體積的1M Tris-HCl溶液；
[0023](4)再取上述溶液，加入2.5?3倍體積的緩沖液，所述的緩沖液由h印es-KOH、MgCl2、ATP、hexokinase、NADP、NADP-dependent G6P dehydrogenase，在所述的緩沖液中，hepes-KOH 的濃度為 100mM，MgCl2的濃度為 2.25mM、ATP 的濃度為 1.1Mm、hexokinase 的濃度為 0.2U、NADP 的濃度為 1.1mM、NADP-dependent G6P dehydrogenase 的濃度為 0.2U，反應一段時間后，測A34。。
[0024]蔗糖轉化酶不可逆地催化蔗糖分解成果糖和葡萄糖，因此通過酶聯方法測定單位時間內反應產物葡萄糖的生成量可測定蔗糖轉化酶；由于保衛細胞含量較少，準確稱取其鮮重比較困難，因此本發明采用測定其總蛋白質含量，以單位蛋白質的蔗糖轉化酶活力來表示；此外，通過保衛細胞的制備及分離，使測定保衛細胞內蔗糖轉化酶活力成為可能。
[0025]由于植物保衛細胞及其組成的氣孔擔負植物與外界交換氣體(二氧化碳和氧氣)和水分的責能，研究表明蔗糖轉化酶活力與植物對干旱響應密切相關，因此保衛細胞內蔗糖轉化酶活力測定特別是動態酶活測定對植物抗干旱研究及育種相當重要。
【具體實施方式】
[0026]下面對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細說明。
[0027]1.保衛細胞原生質體的制備
[0028]取生菜葉片，然后放于蒸餾水中，在玻璃板上撕取表皮條，用毛筆刷除去葉肉細胞，將收集到的表皮條切成0.5cm大小(盡量切小)放入到基質溶液中沖洗，過濾后放入到第一酶解液中，27.5°C水浴反應lh后，在顯微鏡下觀察氣孔開度，氣孔開度呈飽滿橢圓狀時終止反應，過濾后用基本介質沖洗，再用重懸液200 μ L懸浮表皮條，收集表皮條于離心管中。
[0029]基本介質:
[0030]0.5mmol/L 抗壞血酸，0.5mmol/LCaC12，0.5mmol/LMgC12，10 μ mol/LKH2P04，5mmol/L Mes，540mM 山梨醇
[0031]PH5.5 (KOH)
[0032]酶解液:
[0033]0.7% cellulysin, 0.1% (ff/V)PVP-40,0.25% (ff/V)BSA,0.5mmol/L 抗壞血酸溶于45%的基本介質中
[0034]懸浮液:
[0035]0.54mol/L 山梨醇，lmmol/LCaC12，2mmol/LMgC12，5mmol/LMes，PH5.5 (KOH)
[0036]2.保衛細胞原生質體蛋白質提取及含量測定
[0037]得到的保衛細胞原生質體，加入4mL的提取緩沖液[lml 1% SDS,2ml