一種提高大豆籽粒重量的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及提高大豆籽粒重量的方法。
【背景技術】
[0002] 作物對不良生長環境的抗性及對養分的有效利用是影響其產量的主要限制因素。 蔗糖是高等植物主要的糖類，具有很多重要的功能，它是碳水化合物的主要轉運形式、是一 種儲存化合物、還作為滲透保護物存在。蔗糖可以被蔗糖合成酶和蔗糖轉化酶代謝。蔗糖 轉化酶（INV)通過將蔗糖水解成葡萄糖和果糖來調節蔗糖進入不同的途徑。由于糖分不僅 是營養物質還參與重要基因的表達調控，因此INV參與細胞分裂，植物生長發育過程，并與 植物抵抗病原物和不良環境作用密切相關。以玉米種子中淀粉積累會受到不利影響為例來 說明，這種影響是由于在花梗和胚乳間同化物質運輸受到細胞壁INV表達量減少的干擾而 造成的；另有研宄證實香?的種皮相關INV具有控制卸載和儲存的兩種功能；水稻的種子 灌漿也是被一種細胞壁INV調控的，通過對轉INV基因的水稻進行檢測證實INV確實能夠 提高籽粒灌漿進而提高水稻的產量。
[0003] 植物蔗糖轉化酶定位在液泡、細胞質和細胞壁幾個部位上。這些不同的蔗糖轉化 酶同工酶都有著各自特殊的功能而受到單獨的調控。已經有一些蔗糖轉化酶的同工酶被克 隆出來，它們的表達研宄遵守不同的發育調控。
[0004] 目前蔗糖轉化酶抑制酶（INHs)基因已經陸續從煙草，玉米，擬南芥和番茄等植物 中分離出來，對其功能也做了多方面的研宄。大量的研宄表明，通過反義RNA或RNAi技術 可以沉默植物體內的INH來提高INV的活性，進而實現使作物增產及提高作物抵御不良生 物和非生物脅迫影響的作用。
[0005] 到目前為止一直沒有從大豆品種黑農46中克隆INH基因的報道，因此迫切需要研 宄通過從大豆中克隆出INH基因，便于通過轉基因技術培育高產抗逆的轉基因作物，為大 豆高產基因工程提供了具有自主知識產權的基因資源。

【發明內容】

[0006] 本發明的目的是從大豆品種黑農46中克隆出的兩種蔗糖轉化酶抑制酶基因，然 后用其解決目前大豆籽粒重量低致使產量不高的問題，而提供一種提高大豆籽粒重量的方 法。
[0007] -種提高大豆籽粒重量的方法，它按以下步驟實現：
[0008] -、大豆蔗糖轉化酶抑制酶基因的cDNA克隆：
[0009] 通過NCBI網上數據庫資源比對篩選大豆cDNA文庫及EST文庫，篩選出與已報導 的INH(蔗糖轉化酶抑制酶）基因在特有氨基酸序列保守序列上相近的潛在INH基因，并分 別命名為GmINHl和GmINH2 ;
[0010] 其中，步驟一中所述GmINHl的核苷酸序列如SEQ ID No :1所示，其編碼蛋白的氨 基酸序列如SEQ ID NO :2所不；
[0011] 步驟一中所述GmINH2的核苷酸序列如SEQ ID No :3所示，其編碼蛋白的氨基酸序 列如SEQ ID NO :4所示；
[0012] 二、RNAi沉默載體的構建：
[0013] 選取GmINH2編碼區362bp的正向序列及相對應的反向序列，中間插入大豆FAD2 基因的內含子，構成發夾結構的頸環區，然后用BamH I和Sac I雙酶切連于pCAMBIA3300 中，構建載體命名為pCAMBIA3300-GmINH2I ;
[0014] 以大豆FAD2基因的內含子為RNAi內含子頸環結構，分別擴增出約250bp的 GmINHl和GmINH2基因片段，順次連接組成RNAi結構的正向結構，同時擴增出其反向結構， 分別正反向連于FAD2I的兩側，構建在載體pUC18中，構建成RNAi的典型結構，然后用BamH I和Spe I雙酶切連于pCAMBIA3300中，構建載體命名為pCAMBIA3300-GmINHl&2I ;
[0015] 三、兩個基因的沉默載體對大豆的轉化：
[0016] 使用的啟動子為35S，終止子為Nos，篩選標記基因為bar基因，大?的再生體系以 子葉節為外植體誘導再生植株的再生系統，采用農桿菌介導技術將pCAMBIA3300-GmINH2I 和pCAMBIA3300-GmINHl&2I導入到大豆品種哈交5337中進行組成型表達，獲得PCR陽性株 系，即完成提高大豆籽粒重量。
[0017] 本發明從大豆品種黑農46中克隆出的兩種INH基因，通過轉化后具有對大豆蔗糖 轉化酶明顯的抑制功能，并使轉化植株種子的百粒重明顯增加。酶活分析GmINHl和GmINH2 基因抑制酶效果顯著，說明這兩個基因具備蔗糖轉化酶抑制酶功能，組織特異性表達分析 GmINHl和GmINH2基因在花中的表達量最高。構建的GmINHl和GmINH2基因 RNAi載體對大 豆哈交5337進行遺傳轉化，轉基因后代種子的百粒重相比對照顯著提高。
【附圖說明】
[0018] 圖1為實施例中GmINHl和GmINH2與其他物種的蔗糖轉化酶抑制酶比對顯示出4 個半胱氨酸殘基的保守性的圖；
[0019] 圖2為實施例中大豆GmINHl在不同組織表達的相對定量結果圖，其中YL表示幼 嫩葉片；ML表不成熟葉片；FL表不花；YS表不幼嫩種子；MS表不成熟種子；YP表不幼嫩豆 莢；
[0020] 圖3為實施例中大豆GmINH2在不同組織表達的相對定量結果圖，其中YL :幼嫩葉 片；ML :成熟葉片；FL :花；YS :幼嫩種子；MS :成熟種子；YP :幼嫩豆莢；
[0021] 圖4為實施例中轉GmCIF2I后代大豆PCR檢測結果的電泳圖，M :DL2000 ;泳道1 : 陽性質粒；泳道2 :水對照；泳道3 :哈交5337 ;泳道4 :INH2I-1，泳道5 :INH2I-2 ;
[0022] 圖5為實施例中轉GmCIFl&2I后代大豆PCR檢測結果的電泳圖，M :DL2000 ;泳道 1 :陽性質粒；泳道2 :水對照；泳道3 :哈交5337 ;泳道4 :INH2I-1，泳道5 :ΙΝΗ1&2Ι-2 ;
[0023] 圖6為實施例中轉GmINHl基因的大豆種子與受體大豆比較結果圖；
[0024] 圖7為實施例中轉GmINH2基因的大豆種子與受體大豆比較結果圖。
【具體實施方式】
[0025] 本發明技術方案不局限于以下所列舉【具體實施方式】，還包括各【具體實施方式】間的 任意組合。
【具體實施方式】 [0026] 一：本實施方式提高大豆籽粒重量的方法，它按以下步驟實現：
[0027] -、大豆蔗糖轉化酶抑制酶基因的cDNA克隆：
[0028] 通過NCBI網上數據庫資源比對篩選大豆cDNA文庫及EST文庫，篩選出與已報導 的INH基因在特有氨基酸序列保守序列上相近的潛在INH基因，并分別命名為GmINHl和 GmINH2 ；
[0029] 其中，步驟一中所述GmINHl的核苷酸序列如SEQ ID No :1所示，其編碼蛋白的氨 基酸序列如SEQ ID NO :2所不；
[0030] 步驟一中所述GmINH2的核苷酸序列如SEQ ID No :3所示，其編碼蛋白的氨基酸序 列如SEQ ID NO :4所示；
[0031] 二、RNAi沉默載體的構建：
[0032] 選取GmINH2編碼區362bp的正向序列及相對應的反向序列，中間插入大豆FAD2 基因的內含子，構成發夾結構的頸環區，然后用BamH I和Sac I雙酶切連于pCAMBIA3300 中，構建載體命名為pCAMBIA3300-GmINH2I ;
[0033] 以大豆FAD2基因的內含子為RNAi內含子頸環結構，分別擴增出約250bp的 GmINHl和GmINH2基因片段，順次連接組成RNAi結構的正向結構，同時擴增出其反向結構， 分別正反向連于FAD2I的兩側，構建在載體pUC18中，構建成RNAi的典型結構，然后用BamH I和Spe I雙酶切連于pCAMBIA3300中，構建載體命名為pCAMBIA3300-GmINHl&2I ;
[0034] 三、兩個基因的沉默載體對大豆的轉化：
[0035] 使用的啟動子為35S，終止子為Nos，篩選標記基因為bar基因，大?的再生體系以 子葉節為外植體誘導再生植株的再生系統，采用農桿菌介導技術將pCAMBIA3300-GmINH2I 和pCAMBIA3300-GmINHl&2I導入到大豆品種哈交5337中進行組成型表達，獲得PCR陽性株 系，即完成提高大豆籽粒重量。
【具體實施方式】 [0036] 二：本實施方式與一不同的是，步驟一中所述已報導 的INH基因，其GenBank登錄號分別為BT090960. 1和BT091584. 1。其它步驟及參數與具體 實施方式一相同。
【具體實施方式】 [0037] 三：本實施方式與一不同的是，步驟一中所述GmINHl 基因的全長711bp，具有549bp完整的開放讀碼框核苷酸序列，編碼182個氨基酸，其成熟酶 蛋白的分子量為19. 7kD。其它步驟及參數與一相同。
【具體實施方式】 [0038] 四：本實施方式與一不同的是，步驟一中所述GmINH2 基因的全長729bp，具有555bp完整的開放讀碼框核苷酸序列，編碼184個氨基酸，其成熟酶 蛋白的分子量為19. 8kD。其它步驟及參數與一相同。
[0039] 采用以下實施例驗證本發明的有益效果：
[0040] 實施例：
[0041] 提高大豆籽粒重量的方法，它按以下步驟實現：
[0042] 1、大豆蔗糖轉化酶抑制酶基因的cDNA克隆：
[0043] 通過NCBI網上數據庫資源比對篩選大豆cDNA文庫及EST文庫，篩選出與已報導 的INH基因在特有氨基酸序列保守序列上相近的潛在INH基因，并分別命名為GmINHl和 GmINH2 ；
[0044] 其中，步驟一中所述GmINHl的核苷酸序列如SEQ ID No :1所示，其編碼蛋白的氨 基酸序列如SEQ ID NO :2所不；
[0045] 步驟一中所述GmINH2的核苷酸序列如SEQ ID No :3所示，其編碼蛋白的氨基酸序 列如SEQ ID NO :4所示；
[0046] 本實施例中GmINHl和GmINH2,通過BLAST比對揭示這兩個基因與其他物種的INH 基因都具有保守的4個半胱氨酸殘基（圖1)，這是所有已知的INH都具有的一個標志。
[0047] GmINHl基因的全長711bp，具有549bp完整的開放讀碼框核苷酸序列，編碼182 個氨基酸；GmINH2基因的全長729bp，具有555bp完整的開放讀碼框核苷酸序列，編碼184 個氨基酸。針對氨基酸序列，應用ExPASy在線工具軟件預測基因的信號肽部分（// cn. expasy. org/tools/proteome)，將去除信號肽部分的全長編碼區構建在原核表達 Gateway系統（Invitrogen公司）中。構成含有該系統特異識別的引物，采用兩步P