酵母菌轉化異丁香酚生產香蘭素的方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及生物轉化技術領域，尤其設及一種酵母菌轉化異下香酪生產香蘭素的 方法。
【背景技術】
[0002] 香蘭素是工業中應用最廣泛的香料之一，大量用于食品工業，可作為香氣修飾和 定香的主要原料用于食品、牙膏、香皂、煙草中；在醫藥化工中作為重要的原料或中間體，可 用于制造治療高血壓、屯、臟病、皮膚病及消除口臭、利尿的常用藥物；在化學工業中可作為 化學助劑，用于塑料制品的抗硬化劑W及Ni、化、Cd等金屬的電鍛光亮劑；在農業生產上， 香蘭素可作為作物增產劑和催熟劑，并用之制備除草劑和昆蟲引誘劑等，需求量很大。香蘭 素目前主要由化學方法制備，但用化學合成法制得的香蘭素不是天然香料。天然香蘭素可 W從香子蘭的花芙中提取，但用植物組織提取的方法生產的天然香蘭素量少而價高，不能 滿足日益增長的需求。
[0003] 隨著世界各國對食品安全越來越重視，對天然香蘭素的需求越來越大。天然香料 是指由動植物材料經物理（包括蒸饋、溶劑萃取）方法、酶法或微生物方法得到的，可通過 傳統的食品加工方法（包括干燥、賠烤、發酵）加工后用于人類消費的物質。根據歐洲和 美國立法，利用動植物資源通過物理方法、酶法或微生物法得到的物質才能稱為天然物質 (MuheimAn化ea.US6, 235, 507. 2001)。用生物法生產的香蘭素，屬天然產品，可W生物降 解，符合消費者追求天然產品的消費屯、理。因此，利用生物轉化技術生產生物香蘭素，是一 種有效的、很有前途的替代方法。
[0004] 在過去的十年里報道了許多用微生物法或酶法生產香蘭素的方法，一般都是通過 微生物或酶將合適的前體轉化為香蘭素。目前，尚未有酵母菌轉化異下香酪生產香蘭素的 任何公開及報道。

【發明內容】
陽〇化]本發明要解決的技術問題在于，針對現有相關的上述缺陷，提供一種實現采用酵 母菌工業化生產香蘭素的酵母菌轉化異下香酪生產香蘭素的方法。
[0006] 本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：提供一種酵母菌轉化異下香酪生產 香蘭素的方法，包括W下步驟：
[0007] Sl、構建用于生產異下香酪單加氧酶的酵母菌；
[0008]S2、將構建的所述酵母菌接種至Yro液體培養基中，于30-35°C振蕩培養18-36小 時；
[0009]S3、離屯、收集菌體，生理鹽水洗涂，轉入MGY液體培養基中；于30-35°C振蕩培養 36-60小時；
[0010]S4、離屯、收集菌體，生理鹽水洗涂，轉入MM液體培養基中使0D600〉6,于30-35°C振 蕩培養3-5天；每天補加甲醇，并用氨水調節抑，得到發酵液；選擇性地將所述發酵液離屯、 W收集上清液； W11] S5、按異下香酪：發酵液或上清液：緩沖液=0. 1-0. 6g:9-18血：9-18血加入反應 容器中，在20-30°C下振搖轉化12-4化，得到香蘭素；所述緩沖液為P冊-10. 4的甘氨酸的 化OH水溶液（簡稱甘氨酸AfeOH緩沖液）。
[0012] 優選地，所述步驟Sl包括W下步驟：
[0013] S1-1、提取±壤的全基因組DNA;
[0014] S1-2、根據異下香酪單加氧酶的基因序列，設計簡并PCR引物；
[0015] S1-3、W所述全基因組DNA為模板，用所述簡并PCR引物進行PCR擴增，得到PCR 擴增產物；
[0016] S1-4、將所述PCR擴增產物測序，W獲得異下香酪單加氧酶基因序列；
[0017] S1-5、根據所述異下香酪單加氧酶基因序列，設計包含酶切位點的特異性引物，所 述特異性引物包括上游引物SEQIDNO. 1和下游引物SEQIDNO. 2 ;
[0018] S1-6、W所述全基因組DNA為模板，用所述特異性引物進行PCR擴增，得到大小為 1438bp的目標基因SEQIDNO. 3,其5'和3'端分別連接6bp和Sbp的酶切位點；
[0019] S1-7、將所述目標基因沈QIDNO. 3插入畢赤酵母表達載體PPIC9K的EcoRI和 NotI酶切位點之間，得到重組質粒PPIC9K-IEM;
[0020] S1-8、將所述重組質粒PPIC9K-IEM轉化畢赤酵母GS115,得到所述酵母菌。
[0021] 步驟Sl-I中，優選采取被不同香料包括異下香酪、薄荷油、山蒼子油等香料微污 染的±壤，W化stDNA?SpinKit化rSoiU±壤基因組DNA提取試劑盒）提取±壤的全 基因組DNA。
[0022] 構建的所述酵母菌命名為GS115IEM-PP。 陽02引優選地，所述步驟S1-3、S1-6中，PCR擴增方法如下：
[0024] 5沖as巧fu緩沖液10yL模板DNA0. 5yL引物沈QIDNO. 1為1yL沈9ID NO. 2 為 1yL、dNTPS1. 25yL、TranstartFas巧fuDNA聚合酶 1yL、d地20 35. 3yL， 共 50yL。PCR程序：① 95°C2min;② 95°C20s;③ 55°C20s;④ 72°C40s;⑥ 72°C5min; ⑧4°CIOmin;⑦切cle*30從②到④，得到PCR擴增產物，經測序獲得基因的核巧酸序列。 陽0巧]優選地，所述步驟S1-5中：
[0026] 沈QIDNO. 1 的序列如下：5，-gaattcatgctacatatggcaacgtttgaccgcaat-3，
[0027] 沈QIDNO. 2 的序列如下：5, -gcggccgccttatctctcgaggttcttagactgccaac-3,。
[0028] 優選地，所述步驟S5中，所述甘氨酸的化OH水溶液中甘氨酸的濃度為50-200mM。
[0029] 優選地，所述步驟S3中，所述菌體采用生理鹽水洗涂2次。
[0030] 所述步驟S4中，所述菌體采用生理鹽水洗涂2次。
[0031] 優選地，所述步驟S2中，W180-22化/min振蕩培養；優選2(K)r/min。
[0032] 所述步驟S3 中，W180-220;r/min振蕩培養；優選 200;r/min。
[0033] 所述步驟S4中，W180-220r/min振蕩培養；優選200r/min。
[0034] 所述步驟S4中，補加甲醇5-20邑/1，采用純氨水調節pH至5-7。甲醇優選lOg/L。
[0035] 優選地，所述步驟S2中，所述YTO液體培養基包括組分及其質量百分比如下：1% 酵母提取物、2%蛋白腺、2%葡萄糖，其余為水。
[0036] 所述步驟S3中，所述MGY液體培養基包括組分及其質量百分比如下：1.34% YNB(無氨基酵母氮源）、I%甘油、4X1(T5 ^生物素，其余為水。
[0037] 所述步驟S4中，所述匪液體培養基包括組分及其質量百分比如下：1.34%YNB、 4X1(T5^生物素、0.5%甲醇，其余為水。
[0038] 優選地，所述步驟S5中，在所述反應容器中，還添加DMSO(二甲基亞諷）、離子液體 及香蘭素吸附劑中的至少一種。
[0039] 每0. 1-0. 6g異下香酪中：所述DMSO的加入量《1血，所述離子液體的加入量 《200y以所述香蘭素吸附劑的加入量《0. 5邑。
[0040] 優選地，所述香蘭素吸附劑為吸附樹脂及殼聚糖膜中的至少一種。
[0041] 本發明的酵母菌轉化異下香酪生產香蘭素的方法，實現采用酵母菌工業化生產香 蘭素（生物法制香精香料），適用于食品領域等領域，滿足需求，安全。
【具體實施方式】
[0042]W下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為是 從常規生化試劑商店購買得到的。W下實施例中的定量試驗，均設置=次重復實驗，結果取 平均值。
[0043] 本發明的酵母菌轉化異下香酪生產香蘭素的方法，具體如下：
[0044] 一、工程菌的構建（構建用于生產異下香酪單加氧酶的酵母菌）
[0045] 1、采取含有異下香酪單加氧酶基因的±壤作為±樣。采樣時，可采取被不同香料 微污染的±壤，所述的香料包括異下香酪、薄荷油、山蒼子油等香料；由于所述香料可誘導 異下香酪單加氧酶，因此±壤被其微污染后的微生物帶有異下香酪單加氧酶基因。
[0046] 本發明中采取深圳大學化學與化工學院附近受各種香料微污染的±樣，W FastDNA?SpinKit化rSoiU±壤基因組DNA提取試劑盒）提取±壤的全基因組DNA。 由于±樣中微生物受異下香酪等香料微污染后富集，提取的±壤的全基因組DNA含有異下 香酪單加氧酶基因。
[0047] 2、根據Genbank數據庫中異下香酪單加氧酶的相關基因序列，設計簡并引物。 W48] 3、W全基因組DNA為模板，用設計的簡并引物進行PCR擴增，得到PCR擴增產物， 經測序獲得異下香酪單加氧酶基因序列。
[0049] PCR擴增采用常規的方法：5沖as巧化緩沖液10yL模板DNA0. 5yL引物沈QID NO. 1 為 1y1^、沈9IDNO. 2 為 1yLdNTPS1. 25yLTranstartFas巧fuDNA聚合酶 1yL、 (1地2〇35.3^以共50^1^。口0?程序：@95。(：、2111111;@95。(：、2〇3;@55。(：、2〇3;@72。(：、4〇3; ⑥ 72°C、5min;⑧ 4°C、IOmin;⑦切cle*30 從②到④。
[0050] 4、根據異下香酪單加氧酶基因序列，設計包含酶切位點的特異性引物，包括上游 引物沈QIDNO. 1和下游引物沈QIDNO. 2。
[0051] 沈Q ID NO. 1的序列如下
[0052] 沈Q ID NO. 2的序列如下
[0053] 5、W全基因組DNA為模板，用特異性引物進行PCR擴增（PCR方法同3)，得到大小 為1438bp的目標基因（SEQIDNO. 3)，其5'和3'端分別連接6bp和Sbp的酶切位點。
[0057] 6、將5中的目標基因（SEQIDNO. 3)插入畢赤酵母表達載體pPIC9K的EcoRI和 NotI酶切位點之間，得到重組質粒PPIC9K-IEM。
[0058] 7、將重組質粒轉化畢赤酵母GS115,得到一株重組菌（工程菌），該重組菌的生理 生化性質與畢赤酵母一樣，命名為GS115IEM-PP。
[0059]二、培養基的制備W60] 原材料制備：
[0061] l〇*YNB(13. 4%酵母氮源基礎培養基，含硫酸錠不含氨基酸）：將134g含硫酸錠的 YNB溶解于1000 ml的水中，加熱溶液使YNB完全溶解于水中，過濾滅菌，在4°C冰箱儲存。
[0062] 500地(0.