辣椒輕斑駁病毒的侵染性克隆載體和農桿菌菌株及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及基因工程領域，具體的說，本發明設及一種RNA植物病毒-煙草花葉病 毒屬的辣椒輕斑駁病毒（Peppermildmottlevirus,PMMoV)侵染性克隆載體制備，攜帶辣 椒輕斑駁病毒侵染性克隆的農桿菌菌株的致病性分析及利用PMMoV侵染性克隆表達外源 蛋白。
【背景技術】
[0002] 辣椒輕斑駁病毒屬于憲菁花葉病毒科燈ymoviridae)煙草花葉病毒屬（genus Tobamovirus)成員，其病毒粒子形態為桿狀，病毒基因組約為6. 4化，包括5'及3'端非編 碼區和4個開放性的閱讀框，分別編碼126kDa和183kDa復制相關蛋白、28. 3kDa的移動蛋 白及17.IkDa的外殼蛋白。該病毒嚴重威脅著甜椒、辣椒、番茄等茄科作物的生產，植株被 侵染后葉部癥狀嚴重時會出現斑駁或黃綠相間的花葉癥狀，侵染果實后可導致果實崎形、 斑駁，有時出現凹凸斑點。由于該病毒在葉部的癥狀一般比較輕微，只有當果實顯癥時才被 發現，因此病害極易傳播，從而造成較嚴重的經濟損失。該病毒主要通過種子傳播和汁液摩 擦傳毒。目前在我國新疆、北京、山東、河北、寧夏等多個地區均檢測到PMMoV的發生，并呈 擴展蔓延趨勢，對辣椒生產造成重大經濟損失。
[0003] 植物病毒的侵染性CDNA克隆是研究植物病毒致病機理的重要工具。運用構建的 侵染性克隆，通過基因交換、突變、缺失、插入、重組等實驗來分析病毒基因的功能W及鑒定 病毒基因在侵染植株中產生的效應，運已成為病毒編碼蛋白功能研究的重要手段。此外植 物病毒侵染性CDNA克隆可W改造為表達載體，用來生產抗病毒蛋白、醫用獸用疫苗和抗 體。目前構建策略主要有攜帶T7、SP6或T3等原核啟動子控制的侵染性克隆和由花挪菜花 葉病毒（Cauliflowermosaicvirus,CaMV)35S啟動子控制的侵染性克隆兩種。本發明在 獲得辣椒輕斑駁病毒基因組全序列的基礎上，構建了該病毒的侵染性克隆。將包含35S啟 動子的辣椒輕斑駁病毒CDNA序列構建入雙元載體PCB301-CH中，通過農桿菌介導轉化后在 寄主體內轉錄、復制、侵染，W用于病毒的功能基因組研究。同時將PMMoV侵染性CDNA克隆 改造為表達載體，進行了外源GFP蛋白的表達。

【發明內容】

[0004] 本發明的第一個目的是提供辣椒輕斑駁病毒（P巧permildmottle virus,PMMoV)的侵染性克隆載體及其制備方法，本發明的第二個目的是提供攜帶辣椒輕斑 駁病毒侵染性克隆的農桿菌菌株及其應用，本發明的第=個目的是提供能夠表達外源蛋白 的辣椒輕斑駁病毒侵染性克隆的農桿菌菌株及其應用。
[0005] 為了實現上述的第一個目的，本發明采用了W下的技術方案：
[0006] 辣椒輕斑駁病毒的侵染性克隆載體，該侵染性克隆載體由辣椒輕斑駁病毒PMMoV 全序列融合到帶35S啟動子和核酶化的載體PCB301-CH制備得到，所述的辣椒輕斑駁病毒 PMMoV全序列如SeqIDNo: 16所示。
[0007] 上述的辣椒輕斑駁病毒侵染性克隆載體的制備方法，該方法包括W下的步驟：
[0008] 1)獲得辣椒輕斑駁病毒PMMoV全序列；
[0009]2)設計引物pCass-CH-PMMoV(+)，pCass-CH-PMMoV(-)，PMMoV3369(+)和引物 PMMoV3369 (-);分別W引物對pCass-CH-PMMoV(+) /PMMoV3369 (-)和引物對PMMoV3369 (+) / pCass-CH-PMMoV(-)分兩段擴增PMMOV全序列；所述的引物pCass-CH-PMMoV(+)， pCass-CH-PMMoV(-)，PMMoV3369(+)和引物PMMoV3369(-)的基因序列分別為SeqIDNo:5， SeqIDNo:6,SeqIDNo:2,SeqIDNo:3 ；
[0010] 3)將純化的擴增目的片段與經StuI和SmaI雙酶切的PCB301-CH載體進行重 組反應，然后將連接產物轉入大腸桿菌，挑選具有全長插入的克隆，測序篩選出具有正確 PMMoV基因組全序列的克隆；
[0011] 4)提取包含PMMoV全長質粒的克隆，獲得PMMoV的侵染性克隆載體pCB-PMMoV。
[0012] 作為優選，所述的步驟1)中辣椒輕斑駁病毒PMMoV全序列獲得包括W下的步驟：
[0013] 1. 1)植物總RNA的提取：采用Trizol法提取病葉的總RNA;
[0014] 1. 2)PMMoV全序列的擴增：根據GenBank上發表的PMMoV基因組全序列，GenBank 登錄號AB126003，設計引物PMMoVl(+)、PMMoV3369 (+)、引物PMMOV3369 (-)和PMMoVCOM(-)， 引物分別為SeqIDNo:l、SeqIDNo:2、SeqIDNo:3 和SeqIDNo:4。分別W引物對 PMMoVl(+)/PMMoV3369 (-)和引物對PMMoV3369(+)/PMMoVCOM(-)分兩段擴增PMMoV全序列； 擴增的PCR產物純化后經測序拼接獲得PMMoV的全序列。
[0015] 作為優選，所述的步驟1. 2)PCR擴增體系為：9yLDEPC水、25yL2XPCRBuffer 化'1(00閒化〇、10^121111(1饑？3、上下游引物10^16曰油各1.5^1^、2^1。0臟模板、 1化KODFXNeo聚合酶，總反應體系為50化；各片段的反應條件為：94°C2min;94°C15s， 60°C30s，68°C3. 5min，35 個循環；68°ClOmin。
[0016] 作為優選，所述的步驟3)中重組反應采用IOyL體系，其中5XCEMultiSBuffer 2yLStuI和SmaI雙酶切線性化克隆載體PCB301-CH120ng，片段p35SPMMoVl-3369 68ng，片段pPMMoV3369-RZ60ng，ExnaseTMMultiS1yL最后用d地20 調整體系至 10yL。
[0017] 作為優選，所述的步驟5)中pCB-PMMoV-GFP序列獲得包括W下的步驟：W獲得 的PMMoV侵染性克隆載體pCB-PMMoV模板，引物PMMoV-5348化〇1(+)，SeqIDNo: 7和 PMMoV-MP-TMVGFP(-)，SeqIDNo:8 為引物，擴增一條 330bp的條帶；WP35S-GFP為模板， PMMoV-MP-TMVGFP(+)，SeqIDNo:9 和TMGMV-PMMoVCP(-)，SeqIDNo: 10 進行TMGMV啟動 子及外源GFP基因的擴增，產物大小約1200bp;W獲得的PMMoV侵染性克隆載體pCB-PMMoV 為模板，TMGMV-PMMoVCP(+)，SeqIDNo: 11 和PCASS-CH-PMMoV(-)，SeqIDNo: 6 為引物，擴 增包含PMMoVCP區段及3'-UTR區域，約7(K)bp;然后通過overlapPCR，將運S個片段拼接 成1577bp大小的條帶；W獲得的PMMoV侵染性克隆載體pCB-PMMoV模板，引物P301-PM(+)， SeqIDNo:12 和P301-PM(-)，SeqIDNo:13 為引物，擴增包含PCB-301-CH載體及部分 PMMoV病毒序列的條帶；然后通過重組反應將運兩個片段拼接形成攜帶表達外源GFP基因 的PMMoV表達載體pCB-PMMoV-GFP。
[0018] 為了實現上述的第二個目的，本發明采用了W下的技術方案：
[0019] 攜帶辣椒輕斑駁病毒侵染性克隆的農桿菌菌株，該農桿菌菌株由上述的辣椒輕斑 駁病毒侵染性克隆載體導入到農桿菌菌株EHA105獲得。
[0020] 為了實現上述的第S個目的，本發明采用了W下的技術方案：
[0021] 攜帶外源GFP基因的辣椒輕斑駁病毒的侵染性克隆載體，該侵染性克隆載體為在 獲得的PMMoV侵染性克隆載體pCB-PMMoV改造而成，即在辣椒輕斑駁病毒編碼的運動蛋白 與外殼蛋白之間插入煙草輕綠花葉病毒（Tobaccomildgreenmosaicvirus,TMGMV)的外 殼蛋白基因啟動子及外源GFP基因，獲得可表達外源基因且具有侵染性的PMMoV侵染性克 隆載體pCB-PMMoV-GFP。所述的可表達外源GFP蛋白的辣椒輕斑駁病毒PMMoV全序列如Seq IDNo: 17 所示。
[0022] 攜帶外源GFP基因的辣椒輕斑駁病毒的侵染性克隆載體的制備方法，具體設計方 案為W獲得的PMMoV侵染性克隆載體pCB-PMMoV模板，引物PMMoV-5348化Ol(+)，SeqID No: 7 和PMMoV-MP-TMVGFP(-)，SeqIDNo: 8 為引物，擴增一條 330bp的條帶；WP35S-GFP 為模板，？匪〇￥-]\^-1]\^^^(+)，569 10齡：9和1]\?^^斗11〇￥〔口(-)，569 10齡：10進行 TMGMV啟動子及外源GFP基因的擴增，產物大小約1200bp.W獲得的PMMoV侵染性克隆載體 pCB-PMMoV為模板，TMGMV-PMMoVCP(+)，SeqIDNo: 11 和PCASS-CH-PMMoV(-)，SeqIDNo: 6 為引物，擴增包含PMMoVCP區段及3'-UTR區域，約7(K)bp。然后通過overlapPCR，將運S 個片段拼接成1577bp大小的條帶。W獲得的PMMoV侵染性克隆載體pCB-PMMoV模板，引物 口301斗]?(+)，569 10齡：12和口301斗]\1(-)，569 10齡：13為引物，擴增包含口〔8-301-邸載 體及部分PMMoV病毒序列的條帶；然后通過重組反應將運兩個片段拼接形成攜帶表達外源 GFP基因的PMMoV表達載體pCB-PMMoV-GFP。
[0023] 攜帶表達外源GFP基因的辣椒輕斑駁病毒侵染性克隆pCB-PMMoV-GFP的農桿菌菌 株，該農桿菌菌株由上述的攜帶外源GFP基因的辣椒輕斑駁病毒的侵染性克隆載體導入到 農桿菌菌株EHA105獲得。
[0024] 上述的攜帶辣