抗cd52抗體的制作方法
【專利說明】抗CD52抗體
[0001] 序列表
[0002] 本申請包含作為ASCII形式的文本文件以電子方式已經提交的序列表，且其在此 處以其全文通過提述并入。2014年3月11日生成的所述文件名稱為001662-0041-W01_ SL. txt且大小為142, 582字節。 發明領域
[0003] 本發明一般地涉及抗體，且更具體地涉及對于人⑶52具有結合特異性的抗體。
[0004] 相關申請的交叉引用
[0005] 本申請要求2013年3月15日提交的美國臨時申請61/794, 576的優先權。該臨 時申請的公開內容在本文以其全文通過提述并入。
[0006] 發明背景
[0007] ⑶52是在多種正常和惡性類淋巴細胞（例如，T細胞和B細胞）上大量發現 的（500, 000分子/細胞）糖基化的、糖基磷脂酰肌醇（GPI)錨定的細胞表面蛋白。參 見，例如，Hale 等，J Biol Regul Homeost Agents 15:386-391(2001) ;Huh 等，Blood 92:Abstract 4199(1998) ;Elsner 等，Blood 88:4684-4693(1996) ;Gilleece 等，Blood 82:807-812(1993) ;Rodig 等，Clin Cancer Res 12:7174-7179(2006) ;Ginaldi 等，Leuk Res 22:185-191 (1998)。CD52在例如單核細胞、巨噬細胞和樹突細胞等髓樣細胞上以較低 水平表達，其中在成熟自然殺傷（NK)細胞、嗜中性粒細胞和造血干細胞上發現幾乎不表達 (同上）。總之，CD52存在于至少95%的所有人外周血淋巴細胞和單核細胞/巨噬細胞中 (Hale G，等，"The CAMPATH-lantigen(CD52)，"Tissue Antigens, 35:178-327(1990)) 〇 ⑶52還由副睪和輸精管中的上皮細胞產生，且在通過生殖道期間由精子獲得（Hale 等，2001，見上文；Domagala 等，Med Sci Monit 7:325-331 (2001))。CD52 的確切生物 功能仍不清楚，但若干證據暗示其可能涉及T細胞迀移及共刺激（Rowan等，Int Immunol 7:69-77 (1995) ;Masuyama等，J Exp Med 189:979-989 (1999) ;Watanabe 等，Clin Tmmunol 120:247-259(2006))〇
[0008] 已開發數種抗CD52單克隆抗體。Campath-I(還稱為阿侖單抗 (alemtuzumab)、Campath?、MabCampath? )是人源化抗人CD52單克隆抗體，其展現 強效的體外細胞毒性效應（抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC)和補體依賴性細胞毒 性（CDC))。阿侖單抗識別由成熟CD52蛋白羧基端四個氨基酸和帶負電荷的GPI錨定部分 構成的表位。其他抗人CD52單克隆抗體也已產生。然而，在保存中和特定pH和溫度條件 下，若干這些抗體的結合親和力降低。因此，對于具有降低的經歷該變化的傾向的抗CD52 抗體存在需求。
[0009] 發明概述
[0010] 本發明的特征為經過工程化從而隨著時間經過并且在高pH和溫度條件下仍保持 結合親和力的抗人CD52抗體。本文中的"抗體"和"免疫球蛋白"可互換使用。還提供包 含編碼抗CD52抗體輕鏈或重鏈的序列的分離核酸、重組載體和宿主細胞，和制備抗CD52抗 體的方法。
[0011] Ab26是具有SEQ ID NO: 3減去信號序列的重鏈氨基酸序列和SEQ ID NO: 4減去信 號序列的輕鏈氨基酸序列的人源化抗人CD52單克隆抗體。Ab26在保存期間CD52的結合親 和力和效力會隨時間降低。我們意外發現在輕鏈CDRl位置11具有某些單一氨基酸取代的 Ab26變體（例如，單克隆抗體Ab21、Abl6和Ab20)，相比Ab26,其不僅保留或超越Ab26的 人⑶52結合親和力，還展示顯著改善的穩定性。所述變體抗體如Ab21、Abl6和Ab20相比 Ab26已展示體外及體內可比較或改善的生物學效力。這些變體可用于治療及診斷應用。
[0012] 在一些實施方案中，本發明的抗人⑶52抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區和 輕鏈可變區，其中所述重鏈可變區包含：SEQIDN0:7的重鏈⑶R1、SEQIDN0 :8的重鏈 CDR2;和SEQ ID N0:9的重鏈CDR3,且其中所述輕鏈可變區包含：SEQ ID N0:86的輕鏈 CDR1;SEQ ID N0:34的輕鏈CDR2;和SEQ ID N0:35的輕鏈CDR3。在進一步的實施方案中， SEQ ID N0:86 的殘基 11 可為 1(、1?、〇、!1、3、￥、4、03、？、1、1^、]\^、1'或￥。在一個實施方案 中，SEQ ID N0:86的殘基11是K。在另一實施方案中，SEQ ID N0:86的殘基11是R。在另 一實施方案中，SEQ ID NO:86的殘基11是Q。
[0013] 在一些實施方案中，抗⑶52抗體或片段的重鏈可變區包含SEQ ID N0:59。在另外 的實施方案中，抗CD52抗體或片段的輕鏈可變區包含選自SEQ ID N0:68、69、70、71、72、73、 74、75、76、77、78、79、80、81、82和83的序列。舉例來說，本發明抗體或片段的重鏈和輕鏈分 別可包含：a) SEQ ID NO: 59 和 68 ;b) SEQ ID NO: 59 和 69 ;c) SEQ ID NO: 59 和 70 ;d) SEQ ID NO:59 和 71 ;e)SEQ ID NO:59 和 72 ;f)SEQ ID NO:59 和 73 ;g)SEQ ID NO:59 和 74 ;h)SEQ ID NO:59 和 75 ;i)SEQ ID NO:59 和 76 ;j)SEQ ID NO:59 和 77 ;k)SEQ ID NO:59 和 78 ;1) SEQ ID NO: 59 和 79 ;m) SEQ ID NO: 59 和 80 ;n) SEQ ID NO: 59 和 81 ;〇) SEQ ID NO: 59 和 82; 或 p)SEQ ID NO:59 和 83。
[0014] 在一些實施方案中，抗體或片段包含無信號序列的SEQ ID NO:3重鏈氨基酸序列。 在另外的實施方案中，抗體或片段包含選自SEQ ID N0:43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、 53、54、55、56、57和58的輕鏈氨基酸序列。舉例來說，抗體或片段可包含（a)無信號序列 的SEQ ID NO:3的重鏈氨基酸序列和SEQ ID NO:49的輕鏈氨基酸序列；(b)無信號序列的 SEQ ID N0:3的重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0:53的輕鏈氨基酸序列；或（c)無信號序列的 SEQ ID N0:3的重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0:54的輕鏈氨基酸序列。
[0015] 在一些實施方案中，本發明抗體為免疫球蛋白G(IgG)。在另外的實施方案中，抗體 包含人Fc區（例如，人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4Fc區）。本發明還涵蓋本發明任何抗體的 抗原結合片段，其中所述片段選自scFv片段、Fv片段、Fab片段、F (ab'）2片段、微型抗體、 雙抗體（diabody)、三抗體（triabody)和四抗體（tetrabody)。
[0016] 在一些實施方案中，本發明抗體是單克隆抗體。在進一步的實施方案中，抗體和抗 原結合片段是人源化的。本發明抗體或片段的重鏈C端的賴氨酸可任選地裂解。
[0017] 本發明還涉及包含編碼抗體的重鏈或其抗原結合片段或輕鏈或其抗原結合片段 或兩者的核苷酸序列的分離核酸分子。在一些實施方案中，分離的核酸分子包含SEQ ID N0:95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、119、120、121、 122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133 或 134 的核苷酸序列。本發明還涵 蓋包含該核酸分子的重組載體（例如，表達載體）。在一些實施方案中，本發明涵蓋包含該 載體的分離的宿主細胞。
[0018] 本發明還涵蓋產生本文描述的抗CD52抗體或片段或該抗體或片段的重鏈或輕鏈 的分離細胞系。在一些實施方案中，本發明涉及制備抗人CD52抗體或其抗原結合片段的方 法，其包括（1)在適于該抗體或片段表達的條件下保持本文所述的宿主細胞或細胞系；和 (2)回收所述抗體或片段。
[0019] 本發明涵蓋包含本文所述的抗體或抗原結合片段和藥物上可接受的媒劑 (vehicle)或載劑（carrier)的組合物。
[0020] 本發明涉及用于治療對其有需要的患者的方法，其包括對所述患者施用有效量的 本文所述的抗體或抗原結合片段。在一些實施方案中，本發明涵蓋用于治療對其有需要的 患者中的自身免疫疾病（例如，多發性硬化癥）的方法，其包括對該患者施用本文所述的 抗體或抗原結合片段。在一些實施方案中，本發明涵蓋用于治療對其有需要患者中的癌癥 (例如，慢性淋巴性白血病）的方法，其包括對該患者施用本文所述的抗體或抗原結合片 段。本發明還涉及抑制對其有需要患者中的血管生成的方法，其包括對該患者施用本文所 述的抗體或抗原結合片段。
[0021] 在一些實施方案中，本發明涉及使用本文所述的抗體或抗原結合片段治療對其有 需要患者中的自身免疫疾病（例如，多發性硬化癥），或制備其治療藥物的用途。本發明還 涉及使用本文所述的抗體或抗原結合片段治療對其有需要患者中的癌癥（例如，慢性淋巴 性白血病），或制備其治療藥物的用途。本發明進一步涉及使用本文所述的抗體或抗原結合 片段治療對有需要患者中的過度血管生成，或制備用于抑制血管生成的藥物的用途。
[0022] 附圖簡述
[0023] 本專利或申請文件含有至少一個彩色繪圖。在請求和支付必要費用時，有關部門 將提供具彩色繪圖的本專利或專利申請公開的副本。
[0024] 圖1描繪抗CD52抗體的快速親和力篩選結果。上圖為制備抗體的流程圖。中圖 和下方表格顯示BIAC0RE?結合分析和Octet表達水平測定的結果。
[0025] 圖2描述表征純化的抗⑶52抗體的實驗結果。上圖是顯示抗⑶52抗體重鏈和 輕鏈分離的SDS-PAGE凝膠的照片。分子量標記示于標記的泳道（M)。下方的圖和表顯示 BIAC0RE?結合分析的結果。
[0026] 圖3描述顯示于CHO細胞中產生的Ab24和AblO抗體制劑的SDS-PAGE凝膠照片。 所述凝膠還顯示對照的抗⑶52 (CTL)抗體和Abl抗體。箭頭指出IOOkD物種及LC剪切。
[0027] 圖4描述SDS-PAGE凝膠照片，其顯示Ab24和Ab 10抗體中存在的IOOkD類型 (species)，其中在右側顯示了"僅重鏈"的二聚體。還顯示N端測序結果。
[0028] 圖5描述表征另外的抗CD52抗體的實驗結果。表和圖顯示BIAC0RE?結合分析及 Octet表達水平測定的結果。"KGN"指具有SEQ ID NO: 3重鏈序列和SEQ ID NO: 2輕鏈序 列的抗CD52抗體。
[0029] 圖6描述表征純化抗⑶52抗體的⑶52結合的實驗結果。左圖為顯示野生型（CTL) 和其他抗體的重鏈和輕鏈的SDS-PAGE凝膠照片。分子量標記示于標示的泳道（M)。右側曲 線圖顯示BIAC0RE?結合分析的結果。
[0030] 圖7為描述對照抗⑶52抗體和抗體Ab21、Ab 16和Ab20的⑶C分析結果圖。
[0031] 圖8描述在人⑶52轉基因小鼠中，對照抗⑶52(CTL)抗體和抗體Ab21、Abl6和 Ab20的CD52+細胞消耗活性分析結果。左圖顯示血液樣品的結果。右側曲線圖顯示脾臟樣 品的結果。
[0032] 圖9顯示野生型人⑶52蛋白的氨基酸序列（基因庫（Genbank)登錄編號 AAH00644. I)(SEQ ID N0:1))。
[0033] 圖 10 顯示抗體 Ab26、Abl、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、AblO、Abll、Abl2、Abl3、 Abl4、Abl5、Abl6、Abl7、Abl8、Abl9、Ab20、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24、Ab25和KGN(SEQIDN0:3) 的全長重鏈氨基酸序列，和抗體Ab26(SEQ ID NO :4)的全長輕鏈氨基酸序列。粗斜體為信 號序列，下劃線為CDR。
[0034] 圖 11 顯示抗體 Ab26、Abl、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、AblO、Abll、Abl2、Abl3、 Abl4、Abl5、Abl6、Abl7、Abl8、Abl9、Ab20、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24、Ab25和KGN(SEQIDN0:5) 的全長重鏈核酸序列，以及抗體 Ab26、Ab I、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab 10、Ab 11、Ab 12、 Abl3、Abl4、Abl5、Abl6、Abl7、Abl8、Abl9、Ab20、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24、Ab25 和 KGN 的全 長輕鏈核酸序列。下劃線為信號序列，粗體為開放閱讀框。
[0035] 圖 12 顯示抗體 Ab26、Abl、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、AblO、Abll、Abl2、Abl3、 Abl4、Abl5、Abl6、Abl7、Abl8、Abl9、Ab20、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24 和 Ab25 的 H-CDRl(SEQ ID NO:7)、H-CDR2(SEQ ID NO:8)、H-CDR3(SEQ ID NO:9)、L-CDR2(SEQ ID NO: 34)和 L-CDR3(SEQ ID NO :35)的氨基酸序列。
[0036] 圖 13 顯示抗體 Abl、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、AblO、Abll、Abl2、Abl3、Abl4、 Abl5、Abl6、Abl7、Abl8、Abl9、Ab20、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24、Ab25 和 Ab26 的 L-CDRl 的氨 基酸序列。
[0037] 圖 14 顯示抗體 Abl、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、AblO、Abll、Abl2、Abl3、Abl4、 Abl5、Abl6、Abl7、Abl8、Abl9、Ab20、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24 和 Ab25 的全長輕鏈氨基酸序 列。下劃線為⑶R。
[0038] 圖 15 顯示抗體 Ab26、Abl、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、AblO、Abll、Abl2、Abl3、 Abl4、Abl5、Abl6、Abl7、Abl8、Abl9、Ab20、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24 和 Ab25 的重鏈和輕鏈可 變結構域的氨基酸序列。下劃線為CDR。
[0039] 圖 16 顯示抗體 Ab26、Abl、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、AblO、Abll、Abl2、Abl3、 Abl4、Abl5、Abl6、Abl7、Abl8、Abl9、Ab20、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24、Ab25 和 KGN 的重鏈可變 結構域和輕鏈可變結構域的核酸序列。
[0040] 圖17描述表征從HEK293細胞純化的Abl抗體的實驗結果。圖和表顯示BIAC0RE? 分析測定Abl和兩種Ab26制劑（CTLl和CTL2)對⑶52肽的親和力結果。上右圖是顯示兩 種Ab26制劑（CTLl和CTL2)和Abl抗體的重鏈（HC)和輕鏈（LC)的還原性SDS-PAGE凝膠 照片。
[0041] 圖18描述表征從CHO細胞純化的Abl抗體的實驗結果。圖顯示BIAC0RE?分析測 定Abl抗體（下圖）和Ab26抗體（CTL)(上圖）對CD52肽的親和力結果。
[0042] 圖19為描述Abl抗體和Ab26抗體（對照）的⑶C分析結果的圖。結果以相對熒 光單位（RFU)作為抗體最終濃度（單位為毫克/毫升）函數表示。
[0043] 圖20描述抗⑶52抗體的穩定性篩選結果。上左圖顯示在45 °C和pH 7. 2就 Ab26 (CTL)和變體抗體而言，Kd (nM)作為時間（周）的函數。上右圖顯示45°C和pH 7. 2就 Ab26 (CTL)及變體抗體而言，相對于TO的親和力作為時間（周）的函數。
[0044] 圖21描述測試在三組分緩沖液中的溫育對抗CD52抗體穩定性的影響的實驗結 果。上左圖顯示兩種Ab26制劑（CTLl和CTL2)和變體抗體在37°C和pH 7. 5于第0周、第 2周和第4周的Kd (nM)。上右圖顯示Ab26 (CTL)和變體抗體在45 °C和pH 7. 4于第0周、第 2周和第4周的KD(nM)。
[0045] 圖 22 描述 Ab26 (CTL)、Ab21、Abl6 和 Ab20 在 45°C溫育后尺寸排阻層析（SEC) -HPLC 分析的結果。
[0046] 發明詳述
[0047] 本發明基于我們發現特定抗CD52抗體在特定pH和溫度條件下或在保存期間隨時 間喪失穩定性并展示降低的結合親和力。我們已生成在親源抗體的輕鏈CDRl (L-CDRl)單 一位置（位置11)包含氨基酸取代的變體抗體。我們已發現一些這樣的變體抗體相比親源 抗體不僅展示相似或改善的抗原結合特性和生物活性（包括體內效價），還展示增強的穩 定性。
[0048] 本發明包含抗人CD52抗體、所述抗體的抗原結合片段（即部分）、所述抗體的輕 鏈、所述抗體的重鏈和這些輕鏈或重鏈的片段。本發明涉及成熟抗體及其鏈（例如，糖基化 抗體），以及未成熟或前體抗體蛋白。本發明還涉及編碼這些未成熟或成熟蛋白兩者的核酸 分子（例如，載體），包含此類核酸的宿主細胞，生產未成熟和成熟蛋白的方法，及使用該抗 體的方法。
[0049] 本發明的抗體和抗原結合部分可用于治療對其有需要的受試者（例如，人患者） 的各種由具有CD52的細胞介導或引起的疾病和癥狀，例如一些免疫介導的疾病（ηω)征 兆。作用機制可能為抗⑶52抗體通過引起細胞死亡而消耗這些細胞（例如，淋巴細胞或癌 性⑶52+細胞）。舉例來說，所述抗體可經由淋巴細胞消耗（一種經由減小循環性淋巴細胞 群（例如，T細胞和/或B細胞）導致淋巴細胞減少獲得的免疫抑制類型）以治療自身免 疫疾病（例如，多發性硬化癥（MS)、類風濕性關節炎、全身性紅斑狼瘡、血管炎、肌炎和韋格 納氏疾病（Wegener's disease))。本發明抗體還可用于治療癌癥，例如，白血病（例如，慢 性淋巴性白血病）和淋巴瘤（例如，非霍奇金氏淋巴瘤）；或用于組織移植（例如，實質器 官移植（例如，腎移植）和干細胞移植）。本發明抗體還可用于富集造血干細胞，例如，在離 體應用中（參見，例如，Lim 等，J. Hematology&Oncologyl: 19 (2008)) 〇
[0050] 本發_抗體的抗原結合件質
[0051] 本發明抗體對于人CD52或其