一種提高脂肪源干細胞抗凋亡及旁分泌的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及細胞生物學領域，尤其一種提高脂肪源干細胞抗凋亡及旁分泌的方 法。
【背景技術】
[0002] 在我國急性心肌梗死的死亡率依然較高。目前對于心肌梗死的治療方法主要包括 溶栓、冠狀動脈旁路移植術，經皮腔內冠狀動脈血管成形術、激光心肌血運重建術及心臟移 植手術等。前四項方法只能恢復梗死區早期再灌注、改善心肌供血，但不能修復或逆轉已壞 死的心肌，殘留心肌只能在有絲分裂信號的刺激下發生肥厚，進而使心室發生重構，最終導 致心力衰竭。心臟移植雖可替代受損心臟，但由于缺乏供體，移植后免疫排斥反應及花費較 高等原因難以得到廣泛應用。因此如何增加梗死區有收縮功能的心肌細胞數量或減少心肌 細胞的凋亡或死亡成為治療心肌梗死的主要障礙。雖然臨床實驗表明，移植自體細胞可以 改善受損心肌的功能，但心肌細胞體外擴增能力有限，難于獲取足夠數量的細胞，且移植細 胞很難彌補和修復先天性或大面積缺損。
[0003] 干細胞是一類具有自我復制能力和多向分化潛能的細胞。研究發現脂肪組織中存 在一類間充質干細胞，因其克隆細胞株的增殖能力強，具有多向分化的潛能，在體外培養中 保持穩定的生長增殖活性，具有與骨髓間充質干細胞一樣的多向分化潛能，稱為脂肪干細 胞。與骨髓間充質干細胞相比，除皮下脂肪含量十分豐富，提取方便外，脂肪干細胞可以分 泌具有生物活性的血管內皮生長因子、肝細胞生長因子等多種促進血管新生的因子。
[0004] 體內各組織器官氧氣含量變化范圍較大，脂肪組織中氧氣濃度一般小于3%，因此 脂肪干細胞處于低氧環境中。實驗研究表明，低氧環境下培養的脂肪干細胞具有較強的擴 增，迀移及抗凋亡能力。Kim等發現活性氧（ROS)，還原型輔酶II氧化酶，磷酸化的血小板衍 生生長因子-P受到抑制后，脂肪干細胞的擴增與分化能力下降。然后進一步研究發現， 中、低量ROS可提高脂肪干細胞擴增，迀移以及再生能力。缺氧條件下，NADPH氧化酶活化 使脂肪干細胞產生R0S，定位于細胞核周圍的Nox4優先表達，將其沉默后，脂肪干細胞的擴 增與迀移能力降低。說明還原型輔酶II氧化酶4在脂肪干細胞擴增迀移過程中發揮重要的 作用。低氧環境下培養的干細胞，其抗凋亡能力得到改善。Stubbs等應用MTT實驗、乳酸 脫氫酶實驗及Caspase激活實驗發現低氧條件下（2%O2)培養ADSCs24小時后，和常氧條 件下培養相比，HP-hADSCs的VEGF分泌量增高，AKT的磷酸化程度也得到提高，進一步研究 表明，應用VEGF的中和抗體和磷酸肌醇3-激酶抑制劑LY294002可降低HP-hADSCs的生存 能力，說明低氧環境促使ADSCs分泌大量的VEGF，而該細胞因子與ADSCs的存活密切相關。 Valorani等的研究結果認為低氧環境（2%O2)不會改變ADSCs的細胞表型，并且能夠提高 ADSCs擴增與生存能力，促使其向脂肪細胞與骨細胞分化。不僅如此，ADSCs的擴增與集落 形成與低氧環境密切相關（1 %O2)，其機制為低氧環境使得ADSCs的2581個基因受到調控， 進而激活了涉及ADSCs增殖與凋亡的相關途徑。然而，對于在何種低氧環境下最適于ADSCs 旁分泌以及抗凋亡能力還需要進一步的研究。

【發明內容】

[0005] 本發明所要解決的技術問題在于提供一種提高脂肪源干細胞抗凋亡及旁分泌的 方法。
[0006] 為解決上述技術問題，本發明的技術方案是：
[0007] -種提高脂肪源干細胞抗凋亡及旁分泌的方法，3 %低氧環境能促進脂肪源干細 胞的抗凋亡及旁分泌能力。
[0008] 優選的，上述提高脂肪源干細胞抗凋亡及旁分泌的方法，具體方法如下：
[0009] (1)剪除脂肪組織中明顯的血管，用含有雙抗（2ml)的D-Hank' S(200ml)清洗脂 肪組織2-3次后剪碎，所述雙抗為lOOU/ml青霉素和lg/ml鏈霉素；
[0010] (2)將剪碎的脂肪組織通過150目尼龍篩網過濾，收集150目濾網上的脂肪組織， 用含有40U/50mlDNaseI和250yg/ml兩性霉素的D-Hank's液沖洗濾網上的脂肪組織， 去掉分離組織時因破壞細胞而釋放的DNA及其他胞內容物；
[0011] (3)將脂肪組織加入D-Hank's液體，并以1500rpm離心5min，將上清轉移至離心 管中，加入含有0. 5%膠原酶I的等體積D-Hank's液，在37°C恒溫振蕩器上振蕩約75min 后，以 1800rpm離心 5min;
[0012] (4)棄上清，加入含有10%胎牛血清的DMEM培養基，調整每個T75Cm2培養瓶中的 細胞數約為2x106,置入37°C，5%C0J?箱中培養，24小時后，將未貼壁的細胞移除；
[0013] (5)7-10天后瓶中細胞增殖并鋪滿瓶底，待融合率達到80%，以0? 25 %胰蛋白 酶-0. 01 %EDTA消化，所得細胞為原代細胞，繼續培養原代細胞，每3天換液1次，當細 胞融合率達80%時，用0. 25%胰蛋白酶消化、傳代得到脂肪源干細胞，所用脂肪源干細胞 (humanAdiposederivedstemcells,hADSCs)為 3-5 代；
[0014](6)培養脂肪干細胞24小時，使細胞融合達50 %，更換培養基，調整氧濃度，3 % 02、5%C02、92% N2，在上述氧濃度環境中培養24小時。
[0015] 本發明的有益效果是：
[0016] 本發明所述提高脂肪源干細胞抗凋亡及旁分泌的方法，通過大量研究發現3%氧 環境下最適于ADSCs旁分泌以及抗凋亡能力的提高，為臨床實踐中提高脂肪源干細胞生存 能力提供新的參考。
【附圖說明】
[0017] 圖1:從人脂肪組織中獲取的人脂肪干細胞。
[0018] 圖2:經流式細胞儀檢測脂肪干細胞的特異性標記。人脂肪干細胞免疫表型抗原 ⑶71、⑶73、⑶90、⑶105陽性表達率較高，⑶34、⑶45、⑶54、HLA-DR為陰性表達。
[0019] 圖3 :qRT_PCR及WesternBlot檢測脂肪源干細胞的抗凋亡及旁分泌情況。
[0020] 圖4 :ELISA檢測脂肪源干細胞的旁分泌情況。
[0021] 圖5 :流式細胞術分析脂肪源干細胞的抗凋亡情況。
[0022] 圖6 :SPCET觀察低氧環境培養的人脂肪源干細胞縮小心肌梗死面積。
[0023] 圖7 :免疫熒光分析低氧環境培養的人脂肪源干細胞的生存及成血管性。
[0024] 圖8:免疫熒光分析經低氧環境培養的人脂肪源干細胞減少心肌細胞凋亡的情 況。
【具體實施方式】
[0025] 在1%、3%、5%、10%、21%氧環境下，充分對比脂肪源干細胞的抗凋亡及旁分泌 能力。依據上述結果，選3%氧環境作為最適宜的培養條件。再將該條件下培養的脂肪源干 細胞用于治療心肌梗死，觀察療效。經體外、體內實驗證實，3%低氧環境能促進脂肪源干細 胞的抗凋亡及旁分泌能力。
[0026] 具體實施步驟包括：
[0027] LADSCs的獲取及免疫表型鑒定的實驗方法
[0028] 患者知情并同意后，經吸脂術獲取脂肪組織。剪除脂肪組織中明顯的血管，用含有 2ml雙抗（100U/ml青霉素，lg/ml鏈霉素）的200mlD-Hank's清洗脂肪組織2-3次后剪 碎。將剪碎的脂肪組織通過150目尼龍篩網過濾，收集150目濾網上的脂肪組織。用含有 DNaseI(40U/50ml)和250yg/ml兩性霉素的D-Hank's液沖洗濾網上的脂肪組織，去掉分 離組織時因破壞細胞而釋放的DNA及其他胞內容物。將脂肪組織加入D-Hank's液體，并以 1500rpm離心5min，將上清轉移至離心管中。加入含有0. 5%膠原酶I的等體積D-Hank's 液，在37°C恒溫振蕩器上振蕩約75min后，以1800rpm離心5min。棄上清，加入含有10% 胎牛血清的DMEM培養基，調整每個T75Cm2培養瓶中的細胞數約為2x106,置入37°C，5%CO2 孵箱中培養。約24小時后，將未貼壁的細胞移除。7-10天后瓶中細胞增殖并鋪滿瓶底，待 融合率達到80%，以0. 25%胰蛋白酶-0. 01 %EDTA消化，所得細胞為原代細胞。繼續培養 原代細胞，每3天換液1次，當細胞融合率達80%時，用0. 25%胰蛋白酶消化、傳代得到脂 肪源干細胞，所用脂肪源干細胞（humanAdiposederivedstemcells,hADSCs)為3-5代。
[0029] 培養脂肪干細胞24小時，使細胞融合達50%，更換培養基，按以下分組調整氧濃 度，A組：1% 02預處理組（1% 02,5% C02,94%N2)B組：3% 02預處理組（3% 02,5% C02， 92%隊)(：組：5%02預處理組（5%02,5%0) 2,90%隊)0組：10%02預處理組（10%02,5% C0 2,85%N2)E組，對照組：5% C02,95%空氣。在上述氧濃度環境中培養24小時。
[0030] 收集生長狀態良好的hADSCs經胰酶消化后，用含0. 5%BSA的PBS沖洗。將細胞 懸液加在8個I. 5ml的EP管中，每管待測細胞數多105。在EP管中分別加入一抗⑶34， ⑶45,⑶54,⑶71，⑶73,⑶90,⑶105和HLA-DR，以及IgG-PE的同型對照抗體各4y1，充分 混勻，4°C避光孵育30min。離心2000rpmXlmin，棄上清，用Iml的PBS洗滌一次，棄上清。 4 %多聚甲醛400