一種制備螺旋霉素堿產生菌生二素灰色鏈霉菌孢子的方法
【技術領域】 本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種制備螺旋霉素堿產生菌生二素灰色鏈霉菌孢 子的方法。
【背景技術】
[0002] 孢子制備是發酵工業生產中不可缺少的一個環節，孢子質量的好壞將直接影響到發酵 生產的成功與否。國內螺旋霉素堿發酵生產所用的生二素灰色鏈霉菌是經過誘變得到的， 一般得不到孢子，靠斜面傳代，菌絲保藏。螺旋霉素SPM的合成基因部分為質粒基因，質粒 基因容易丟失。因此，螺旋霉素SPM生產菌種不太穩定，性能容易衰退。菌種生產能力的保 持是菌種選育和抗生素生產中最重要的問題。眾所周知，在不斷地重復培養過程中會導致 菌種生產能力下降，而菌絲冷凍保藏，保藏期較短，不得不在生產中頻繁更換菌種批號，增 加傳代次數，造成生產的不穩定，同時也加大了菌種制備的工作量。

【發明內容】

[0003] 本發明的目的在于提供一種制備螺旋霉素堿產生菌生二素灰色鏈霉菌孢子的方法，以 有效提高生產批次的產量、減少菌種傳代次數、防止菌種退化、提高菌種保藏期限。
[0004] 為實現上述目的，本發明采用以下技術方案： 一種制備螺旋霉素堿產生菌生二素灰色鏈霉菌孢子的方法，包括以下步驟： a. 平板培養基的制備：采用玉米淀粉4%、淀粉酶0. 03%、黃豆餅粉1%、氯化鈉0. 4%、七 水硫酸鎂〇. 05%、碳酸鈣0. 5%、瓊脂1%、余量為蒸餾水的質量百分比例配制平板培養基，將 平板培養基經過滅菌倒入培養皿中； b. 菌懸液的制備：取預先選定的優質冷凍管作為出發菌株，接種到種子搖瓶中，在搖床 上培養40~48小時，在無菌條件下，吸取種子液放到裝有玻璃珠的三角瓶中，手振蕩5~10分 鐘，然后過濾于另一三角瓶即成菌懸液； c. 單菌落孢子的培養：將菌懸液按10倍的濃度梯度稀釋至10 2、10 3、10 4,將三個濃度 的菌懸液分別加入到步驟a得到的不同培養皿的平板培養基上，在溫度為27±0. 5°C、濕度 為40%~50%條件下培養18~20天； d. 斜面培養基的制備：采用玉米淀粉4%、淀粉酶0. 03%、黃豆餅粉1%、氯化鈉0. 4%、七 水硫酸鎂〇. 05%、碳酸鈣0. 5%、瓊脂1%、余量為蒸餾水的比例配制斜面培養基，將斜面培養 基分裝到試管中，經滅菌后擺斜面； e. 單菌落孢子斜面的制備：選擇步驟c制得的規則、豐滿的單菌落孢子，用滅過菌的接 種鏟輕輕刮下孢子，均勻涂在步驟d得到的空白斜面上，每個單菌落只傳一支斜面，傳好后 塞緊棉塞用無菌濾紙包扎，在溫度為27±0. 5°C、濕度為40%~50%條件下培養18~20天； f. 搖瓶初篩和搖瓶復篩：取培養成熟的步驟e中的孢子斜面試管，進行單菌落孢子的 搖瓶初篩和搖瓶復篩，選出生產能力強的單菌落孢子斜面； g. 孢子斜面保藏。
[0005]平板培養基和斜面培養基配制過程中用85°C水浴15分鐘，滅菌時在0.IMPa、 121°C的條件下滅菌30分鐘，滅菌結束后保壓降溫。
[0006] 本發明的優點在于發明了全新的培養基配方，使螺旋霉素堿產生菌在這種培養基 上能夠產生孢子，為實現孢子保藏菌種提供了基本來源。與原有的舊培養基相比，有以下優 占. 2.新舊配方比較： a. 本發明新的制備方法可以產生孢子，而舊培養基只能產生菌絲； b. 本發明獲得的成熟孢子斜面置1~7°C冰箱中保存可達一個月之久待用；而現有成 熟的菌絲斜面置1~7°C冰箱中保存兩周即退化，為防止待用菌絲斜面退化，必須盡快傳代 維持菌絲活力； c. 本發明獲得的孢子斜面可制作牛奶管進行菌種保藏，一般至少可保存6年；而現有 的菌絲斜面不宜制作牛奶管，一般采用冷凍管保藏，保存時間為2~3年； d. 在時間上，無論是斜面待用保存還是菌種保藏，本發明得到的孢子斜面均比現有的 菌絲斜面有優勢，利用孢子保藏菌種，可減少菌種在復壯選育過程中和制備過程中的傳代 次數，防止菌種退化，延長了菌種保藏時間，達到了提高工作效率和增產降耗的目的。
【具體實施方式】
[0007] 實施例1 一種制備螺旋霉素堿產生菌生二素灰色鏈霉菌孢子的方法，包括以下步驟： a. 平板培養基的制備： (1) 按照玉米淀粉4%、淀粉酶0. 03%、黃豆冰粉1%、氯化鈉0. 4%、七水硫酸鎂0. 05%、碳 酸鈣0. 5%、瓊脂1%、余量為蒸餾水的比例配制平板培養基； (2) 將上面的平板培養基用85°C水浴15分鐘，然后一邊搖勻一邊分裝于規格為500ml 三角瓶內，每瓶裝200ml;在0.lMPa、121°C的條件下滅菌30分鐘，滅菌結束后保壓降溫； (3) 將滅菌后的平板分離培養基趁熱搖勻，待冷卻至60°C左右一邊搖勻一邊分別倒入 直徑為90mm的滅菌培養皿中，每只培養皿大約25ml平板培養基；倒好的培養皿放平加蓋， 待平板培養基冷卻凝固后置37°C恒溫箱培養48h，經無菌檢查合格后備用； b. 菌懸液的制備： 取一支預先選定的優質冷凍管（內裝有生二素灰色鏈霉菌菌絲體）作為出發菌株，接種 到種子搖瓶中，在搖床上培養44小時，在無菌條件下，吸取10ml種子液放到裝有玻璃珠的 三角瓶中，手振蕩8分鐘，然后過濾于另一三角瓶即成菌懸液； c. 單菌落孢子的培養： (1)用滅菌移液管吸取步驟b的菌懸液，按10倍的濃度梯度稀釋至10 2、10 3、10 4,分 別吸取以上三個濃度的菌懸液加到步驟a不同培養皿的平板培養基上，每個平板培養基加 入0. 1~0. 3ml，然后滅菌接種耙涂布均勻，接種好的培養皿加蓋，正面向上集中用無菌濾紙 包扎； (2)將無菌濾紙包扎好的培養皿正面向上水平放置在恒溫培養室或生化培養箱內，在 溫度為27±0. 5°C、相對濕度為40%~50%條件下培養，1天后將培養皿翻轉培養，培養周期 18~20 天； d. 斜面培養基的制備： (1) 按照玉米淀粉4%、淀粉酶0. 03%、黃豆冰粉1%、氯化鈉0. 4%、七水硫酸鎂0. 05%、碳 酸鈣0. 5%、瓊脂1%、余量為蒸餾水的比例配制斜面培養基； (2) 將上面的斜面培養基85°(：水浴15分鐘，然后一邊搖勻一邊分裝于規格為30*200臟 試管中，每管裝量20ml，塞緊棉塞，用一層牛皮紙包扎； (3) 在0.lMPa、121°C的條件下滅菌30分鐘，滅菌結束后保壓降溫； (4) 將滅菌后的斜面培養基趁熱搖勻，待冷卻至60°C左右擺成斜面，冷卻凝固后置 37°C恒溫箱培養48h，經無菌檢查合格后備用； e. 單菌落孢子斜面的制備： 取步驟c培養好平板單菌落，選擇豐滿、規則的單菌落，用滅過菌的接種鏟輕輕刮下孢 子，均勻涂在步驟d的空白斜面上，每個單菌落只傳1支斜面，傳好后塞緊棉塞用無菌濾紙 包扎，在溫度為27±0. 5°C、濕度為40%~50%條件下培養18~20天。
[0008] f.搖瓶初篩和搖瓶復篩： 取步驟e培養成熟的孢子斜面試管，在無菌條件下，用滅過菌的接種鏟將每支成熟斜 面分別挖塊約lcm2大小至搖瓶內進行單菌落孢子的搖瓶初篩和搖瓶復篩，選出生產能力強 的單菌落孢子斜面。
[0009] g?孢子斜面保藏。
[0010] 上述制得的孢子斜面制作牛奶管進行菌種保藏，將保藏不同時間的牛奶管考察， 結果見下表：
對照實施例： 現有的菌絲斜面制備方法： 與實施例1的不同之處在于：平板培養基和斜面培養基的質量百分比配方為：玉米淀 粉4%、蛋白胨0. 5%、黃豆餅粉2%、氯化鈉0. 2%、玉米漿0. 5%、碳酸鈣0. 5%、瓊脂1. 8~2. 0%、 余量為水。步驟f?選出生產能力強的單菌落菌絲斜面后，用甘油作保護劑將培養成熟的種 子液制作冷凍管于-18~_25°C的冰柜中冷凍保藏。
[0011] 對照實施例選取三支成熟的菌絲斜面（1#斜面、2#斜面、3#斜面）時間進行考察， 每支三個平行，結果如下表：
由以上兩表可看出，菌絲斜面隨保存時間的延長退化非常迅速，若要維持菌絲活力，就 要及時傳代或進行制種保藏，而冷凍管保藏時間僅有2~3年時間。本發明得到的是孢子斜 面，制作成牛奶管后退化不明顯，至少可保存6年，孢子斜面可以減少傳代次數，延長菌種 保藏時間，達到了提高工作效率和增產降耗的目的。
【主權項】
1. 一種制備螺旋霉素堿產生菌生二素灰色鏈霉菌孢子的方法，其特征在于，包括以下 步驟： a. 平板培養基的制備：采用玉米淀粉4±0. 54%、淀粉酶0. 03 ±0. 005%、黃豆餅 粉1 ± 0. 05%、氯化鈉0. 4 ± 0. 05%、七水硫酸鎂0. 05 ± 0. 005%、碳酸鈣0. 5 ± 0. 05%、瓊脂 1±〇. 5%、余量為蒸餾水的比例配制平板培養基，將平板培養基經過滅菌倒入培養皿中； b. 菌懸液的制備：取預先選定的裝有菌絲體的優質冷凍管作為出發菌株，接種到種 子搖瓶中，在搖床上培養40~48小時，在無菌條件下，吸取種子液放到裝有玻璃珠的三角瓶 中，手振蕩5~10分鐘，然后過濾于另一三角瓶即成菌懸液； c. 單菌落孢子的培養：將菌懸液按10倍的濃度梯度稀釋至10 2、10 3、10 4,將三個濃度 的菌懸液分別加入到步驟a得到的不同培養皿的平板培養基上，在溫度為27±0. 5°C、濕度 為40%~50%條件下培養18~20天； d. 斜面培養基的制備：采用玉米淀粉4%、淀粉酶0. 03%、黃豆餅粉1%、氯化鈉0. 4%、七 水硫酸鎂〇. 05%、碳酸鈣0. 5%、瓊脂1%、余量為蒸餾水的比例配制斜面培養基，將斜面培養 基分裝到試管中，經滅菌后擺斜面； e. 單菌落孢子斜面的制備：選擇步驟c制得的規則、豐滿的單菌落孢子，用滅過菌的接 種鏟輕輕刮下孢子，均勻涂在步驟d得到的空白斜面上，每個單菌落只傳一支斜面，傳好后 塞緊棉塞用無菌濾紙包扎，在溫度為27±0. 5°C、濕度為40%~50%條件下培養18~20天； f. 搖瓶初篩和搖瓶復篩：取培養成熟的步驟e中的孢子斜面試管，進行單菌落孢子的 搖瓶初篩和搖瓶復篩，選出生產能力強的單菌落孢子斜面； g. 孢子斜面保藏。2. 如權利要求1所述的制備螺旋霉素堿產生菌生二素灰色鏈霉菌孢子的方法，其特征 在于：平板培養基和斜面培養基配制過程中用85°C水浴15分鐘，滅菌時在0. lMPa、121°C的 條件下滅菌30分鐘，滅菌結束后保壓降溫。
【專利摘要】本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種制備螺旋霉素堿產生菌生二素灰色鏈霉菌孢子的方法。該方法中平板培養基的制備為：采用玉米淀粉4%、淀粉酶0.03%、黃豆餅粉1%、氯化鈉0.4%、七水硫酸鎂0.05%、碳酸鈣0.5%、瓊脂1%、余量為蒸餾水的比例配制平板培養基，將平板培養基經過滅菌倒入培養皿中。本發明新的制備方法可以產生孢子，獲得的孢子斜面可制作牛奶管進行菌種保藏，一般至少可保存6年。
【IPC分類】C12N3/00, C12R1/545
【公開號】CN105062948
【申請號】CN201510459519
【發明人】劉守強, 馮匯, 朱曉莉, 趙抗洪, 劉儉國, 翟明禮, 孟新梅, 劉麗杰, 王雪潔, 薛娟, 陳雙, 王蕊, 周晨曦, 李慧
【申請人】天方藥業有限公司
【公開日】2015年11月18日
【申請日】2015年7月31日