一種以釀酒酵母孢子為載體的新型固定化酶的制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種以釀酒酵母孢子為載體的新型固定化酶的制備方法及固定化酶，其通過使用一種釀酒酵母缺陷型菌株△dit1，此菌株產生的孢子壁不含最外的二酪氨酸層，暴露在最外面的一層是殼聚糖，將酶直接固定在此缺陷型的孢子上，得到固定化酶。本發明直接通過培養釀酒酵母△dit1菌株獲得大量的釀酒酵母的子囊孢子，再加以破壁純化得到目的產品，就可以做相應的應用，而無需獲得像一般固定化酶所需的載體，方法簡便，易于操作，節省費用。
【專利說明】一種以釀酒酵母孢子為載體的新型固定化酶的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及微生物【技術領域】和固定化酶技術，具體地說，本發明涉及一種以釀酒酵母孢子為載體的新型固定化酶的制備方法。
【背景技術】
[0002]酵母菌泛指能發酵糖類的一大類單細胞真菌，最典型的酵母菌是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。釀酒酵母在良好的營養和生長條件下,生長迅速，以出芽繁殖的方式進行生殖。但以醋酸鹽為唯一或主要碳源，并輔以缺乏氮源等特定條件下(如只有乙酸鉀存在)，釀酒酵母就會以孢子生殖的方式進行繁殖，在胞內形成孢子。此時的細胞即稱為子囊，子囊經自然或人為破壁后，可釋放出其中的子囊孢子。
[0003]殼聚糖是由幾丁質經過脫乙酰反應得到的，其化學名稱為聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-β-D-葡萄糖。曾有文獻報道過殼聚糖可以被用來固定化酶，這是由于殼聚糖的氨基可以被戊二醛容易激活，從而與酶結合。而釀酒酵母在以醋酸鹽為唯一或主要碳源的狀態下在可以產生子囊孢子·，其孢子壁由四層組成，從內到外依次為:甘露糖，葡聚糖，殼聚糖，二酪氨酸。在本發明中，我們使用一種釀酒酵母缺陷型菌株Λ ditl，此菌株產生的孢子壁不含最外的二酪氨酸層，暴露在最外面的一層是殼聚糖，我們因此可以將酶直接固定在此缺陷型的孢子上，得到孢子固定化酶。

【發明內容】

[0004]本部分的目的在于概述本發明的實施例的一些方面以及簡要介紹一些較佳實施例。在本部分以及本申請的說明書摘要和發明名稱中可能會做些簡化或省略以避免使本部分、說明書摘要和發明名稱的目的模糊，而這種簡化或省略不能用于限制本發明的范圍。
[0005]鑒于上述和/或現有以釀酒酵母孢子為載體的新型固定化酶的制備方法及應用中存在的問題，提出了本發明。
[0006]因此，本發明的目的是提供一種以釀酒酵母孢子為載體的新型固定化酶的制備方法，以達到制備特定用途的固化酶的目的。
[0007]為解決上述技術問題，本發明提供了如下技術方案:一種以釀酒酵母孢子為載體的新型固定化酶的制備方法，包括，釀酒酵母單菌落的培養，采用基因同源重組的方法敲除負責編碼釀酒酵母SKl孢子壁最外層二酪氨酸層DITl基因，將得到的釀酒酵母缺陷菌株在YPAD固體培養基平板上劃線，28°C?32°C培養至長出單菌落；孢子的制備，挑取單菌落到YPAD液體培養基中，搖床培養后，將菌液轉接到YPAce培養基中，培養后收集細胞，轉到1%?3%的醋酸鉀溶液中培養，使得醋酸鉀溶液中細胞的濃度為2X IOVml?4X IO7/ml，而后離心，將離心后的釀酒酵母菌體用PBS緩沖液洗滌，在36°C?38°C下用一定量的Iyticase處理0.5h?1.5h后,進行超聲波破碎,得到游離狀態的釀酒酵母孢子并對孢子進行純化和冷凍干燥；酶的固定化，將半乳糖苷酶固定到釀酒酵母DITl基因缺陷型的孢子上。將經純化的釀酒酵母Λ ditl孢子，用2%?3%的戊二醛溶液進行處理，然后洗滌釀酒酵母孢子，向釀酒酵母孢子中加入配制好的β -半乳糖苷酶溶液，在:TC?5°C下進行固定，離心，洗滌，得到固定化的β_半乳糖苷酶。
[0008]作為本發明所述以釀酒酵母孢子為載體的新型固定化酶的制備方法的一種優選方案，其中:所述釀酒酵母單菌落的培養，包括，
[0009]引物設計:依據釀酒酵母DITl基因序列設計引物如下:
[0010]上游引物Pl
[0011 ] AATTTGTTAATATCCTAATTCGGTAAAGCTTTGTCGAGACATTAACAAAACGGATCCCCGGGTTAATTAA
[0012]下游引物Ρ2
[0013]TGTTTAAGTAAAAGAACAAAAAGGTAGACCAATGTAGCGCTCTTACTTTAGAATTCGAGCTCGTTTAAAC ；
[0014]PCR擴增，利用上游引物Pl和下游引物Ρ2對質粒pFA6a_His3MX6進行PCR擴增，獲得含釀酒酵母DITl基因上下游序列的敲除片段；
[0015]DITl基因的敲除，通過醋酸鋰/PEG的轉化方法將PCR擴增得到的his片段分別導入到釀酒酵母SKl得單倍體細胞4B和16D中，并進行篩選；
[0016]缺陷性菌株的篩選，將DITl基因的敲除后得到的轉化菌株涂布到SD-His缺陷性平板上，待長出菌落后，挑取一定數目的菌落提取基因組，并進行PCR驗證，以與野生型菌株的基因組進行對比，若驗證.成功，再將單倍體在SD-Leu-Arg平板上融合，得到缺陷性的二倍體菌株；
[0017]驗證引物如下:
[0018]上游引物:CATAAATTGTGCTCCTCCGC
[0019]下游引物:CATTGCAGTGTCTCGAAACC。
[0020]作為本發明所述以釀酒酵母孢子為載體的新型固定化酶的制備方法的一種優選方案，其中:所述釀酒酵母單菌落的培養，YPAD固體培養基的配制為酵母提取物10g，蛋白胨20g，腺嘌呤30mg，瓊脂20g，定容于900mL蒸餾水中，121 °C滅菌15min后，補加IOOmL單獨滅菌的20%葡萄糖。
[0021]作為本發明所述以釀酒酵母孢子為載體的新型固定化酶的制備方法的一種優選方案，其中:所述釀酒酵母孢子的制備，YPAce培養基的配制為酵母提取物10g，蛋白胨20g，腺嘌呤30mg，定容于900mL蒸餾水中，121 °C滅菌15min后，補加IOOmL單獨滅菌的20%醋酸鉀。
[0022]作為本發明所述以釀酒酵母孢子為載體的新型固定化酶的制備方法的一種優選方案，其中:所述對釀酒酵母孢子進行純化，包括，配制Percoll溶液，將處理過的細胞用
0.5%Triton X-100溶液洗滌，以除去其中的裂解酶等雜質，然后將細胞懸浮在0.5%TritonX-100溶液中，配制不同梯度50%?80%不同濃度梯度的Percoll溶液；釀酒酵母孢子的純化，將所述Percoll溶液按照從高濃度到低濃度依次加入到離心管中，最后加釀酒酵母細胞懸浮液，離心，將上層液體除去，得到純化的釀酒酵母孢子。
[0023]本發明的另一目的是提供一種以釀酒酵母孢子為載體的新型固定化酶，以釀酒酵母孢子為載體的新型固定化酶采用本發明中的制備方法制得。
[0024]為解決上述技術問題，本發明提供了如下技術方案:一種以釀酒酵母孢子為載體的新型固定化酶，所述新型固定化酶是將β-半乳糖苷酶固定化到不含有二酪氨酸層的釀酒酵母缺陷型孢子上。
[0025]本發明的目的是提供一種缺陷型釀酒酵母的子囊孢子，可以用來固定化酶，并且表現出較強的固定化能力，有廣泛的應用前景。本發明直接通過培養釀酒酵母Λ ditl菌株獲得大量的的子囊孢子，再加以破壁純化得到目的產品，就可以做相應的應用，且無需使用常規固定化酶所需的載體，方法簡便，易于操作，節省費用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1是釀酒酵母孢子對β -半乳糖苷酶的固定量示意圖；
[0027]圖2是固定化酶的活力測定和比較示意圖。
【具體實施方式】
[0028]為使本發明的上述目的、特征和優點能夠更加明顯易懂，下面結合附圖對本發明的【具體實施方式】做詳細的說明。
[0029]在下面的描述中闡述了很多具體細節以便于充分理解本發明，但是本發明還可以采用其他不同于在此描述的其它方式來實施，本領域技術人員可以在不違背本發明內涵的情況下做類似推廣，因此本發明不受下面公開的具體實施例的限制。
[0030]其次，此處所稱的“ 一個實施例”或“實施例”是指可包含于本發明至少一個實現方式中的特定特征、結構或特性。在本說明書中不同地方出現的“在一個實施例中”并非均指同一個實施例，也不是單獨的或選擇性的與其他實施例互相排斥的實施例。
[0031]下面結合實施例對本發明做進一步說明，木糖異構酶來源于嗜熱棲熱菌的基因，根據酵母的偏好性人工合成，但不僅限于此酶。
[0032]其中，該方法采用如下步驟:
[0033]a采用基因同源重組的方法敲除負責編碼釀酒酵母SKl孢子壁最外層二酪氨酸層DITl基因，將得到的釀酒酵母缺陷菌株在YPAD固體培養基平板上劃線，30°C培養至長出單菌落。IL YPAD培養基的配制為酵母提取物10g，蛋白胨20g，腺嘌呤30mg，定容于900mL蒸餾水中(固體培養基需加瓊脂20g)，121°C滅菌15min后，補加IOOmL單獨滅菌的20%葡萄糖。
[0034]其中，釀酒酵母Aditl突變株的構建采用如下的方法進行:
[0035]I)引物設計:依據釀酒酵母DITl基因序列(GenBank)設計引物如下:
[0036]上游引物Pl
[0037]AATTTGTTAATATCCTAATTCGGTAAAGCTTTGTCGAGACATTAACAAAACGGATCCCCGGGTTAATTAA
[0038]下游引物P2
[0039]TGTTTAAGTAAAAGAACAAAAAGGTAGACCAATGTAGCGCTCTTACTTTAGAATTCGAGCTCGTTTAAAC ；
[0040]PCR擴增，利用上游引物Pl和下游引物P2對質粒pFA6a_His3MX6進行PCR擴增，獲得含釀酒酵母DITl基因上下游序列的敲除片段；
[0041]DITl基因的敲除，通過醋酸鋰/PEG的轉化方法將PCR擴增得到的his片段分別導入到釀酒酵母SKl得單倍體細胞4B和16D中，并進行篩選；
[0042]缺陷性菌株的篩選，將DITl基因的敲除后得到的轉化菌株涂布到SD-His缺陷性平板上，待長出菌落后，挑取一定數目的菌落提取基因組，并進行PCR驗證，以與野生型菌株的基因組進行對比，若驗證成功，再將單倍體在SD-Leu-Arg平板上融合，得到缺陷性的二倍體菌株；
[0043]驗證引物如下:
[0044]上游引物:CATAAATTGTGCTCCTCCGC
[0045]下游引物:CATTGCAGTGTCTCGAAACC。
[0046]b孢子的制備:挑取步驟a得到的單菌落到YPAD液體培養基中，30°C搖床中培養24h。將菌液轉接到YPAce培養基中，過夜培養后收集細胞，轉到2%的醋酸鉀中培養，使醋酸鉀中細胞的濃度為3 X 10Vml，培養20h后，5，OOOrpm離心IOmin后，菌體用PBS緩沖液洗滌，在37°C下用Iyticase處理0.5h，超聲破碎得到游離狀態的孢子并對孢子進行純化和冷凍干燥。IL YPAce液體培養基的配制為酵母提取物IOg,蛋白胨20g,腺嘌呤30mg,定容于900mL蒸餾水中，121°C滅菌15min后，補加IOOmL單獨滅菌的20%醋酸鉀。其中，純化是先將處理過的細胞用0.5%Triton X-100溶液洗滌三次，以除去其中的裂解酶等雜質，然后將細胞懸浮在lmL0.5%Triton X-100溶液中。
[0047]而后配制不同梯度50%_80%不同濃度梯度的Percoll溶液:
[0048](I) 8mL Percoll, ImL0.5%Triton-X, lmL2.5M 鹿糖;
[0049](2) 7mL Percoll, 2mL0.5%Triton-X, lmL2.5M 蔗糖；
[0050](3) 6mL percoll, 3mL0.5%Triton-X, lmL2.5M 鹿糖；
[0051](4) 5mL Percoll, 4mL0.5%Triton-X, lmL2.5M 鹿糖。
[0052]將上述Percoll溶液ImL按照從高濃度到低濃度依次加入到IOmL的離心管，最后加細胞懸浮液，15，OOOg, 4°C離心Ih后，梯度溶液將會分層，純凈的孢子將會位于離心管的底部，將上層液體除去，純化后的孢子在冷凍干燥機中冷凍干燥。
[0053]c酶的固定化，將β_半乳糖苷酶(購買于sigma公司)固定到Λ ditl的孢子上。稱取一定重量的b步驟得到的經純化的孢子于離心管中，加入2%的戊二醛溶液，放在30°C搖床中lh，然后用雙蒸水洗滌孢子三次，向孢子中加入配制好的半乳糖苷酶溶液，在4°C下搖4h后，離心，洗滌，得到固定化的β -半乳糖苷酶。
[0054]實施例1:釀酒酵母孢子對β -半乳糖苷酶的固定
`[0055]如圖1所示，Λ ditl菌株產生孢子后，按照前述方法純化并冷凍干燥后，稱取I?IOmg的孢子粉末于離心管中，并加入2%的戊二醛溶液，于30°C下充分震蕩Ih后，移去戊二醛溶液，并用雙蒸水將孢子洗滌三次，然后再加上半乳糖苷酶溶液，4°C下振蕩4h，15，OOOrpm離心IOmin,上清為殘余的β -半乳糖苷酶溶液,沉淀則為固定化后的孢子，同樣用雙蒸水將孢子洗滌三次，以除去殘余的半乳糖苷酶溶液。最后取上清溶液用試劑盒測定其中的酶的含量，從而計`算出被固定到孢子壁上的酶的含量，得到的數據如下表所示。
【權利要求】
1.一種以釀酒酵母孢子為載體的新型固定化酶的制備方法，其特征在于:包括， 釀酒酵母單菌落的培養，采用基因同源重組的方法敲除負責編碼釀酒酵母SKl孢子壁最外層二酪氨酸層DITl基因，將得到的釀酒酵母缺陷菌株在YPAD固體培養基平板上劃線，28°C?32 °C培養至長出單菌落； 孢子的制備，挑取單菌落到YPAD液體培養基中，搖床培養后，將菌液轉接到YPAce培養基中，培養后收集細胞，轉到1%?3%的醋酸鉀溶液中培養，使得醋酸鉀溶液中細胞的濃度為2X IOVml?4X 107/ml，而后離心，將離心后的釀酒酵母菌體用PBS緩沖液洗滌，在36°C?38°C下用一定量的Iyticase處理0.5h?1.5h后,進行超聲波破碎,得到游離狀態的釀酒酵母孢子并對釀酒酵母孢子進行純化和冷凍干燥； 酶的固定化，將半乳糖苷酶固定到釀酒酵母DITl基因缺陷型的孢子上。將經純化的釀酒酵母Λ ditl孢子，用2%?3%的戊二醛溶液進行處理，然后洗滌釀酒酵母孢子，向釀酒酵母孢子中加入配制好的半乳糖苷酶溶液，在:TC?5°C下進行固定，離心，洗滌，得到固定化的β_半乳糖苷酶。
2.根據權利要求1所述的以釀酒酵母孢子為載體的新型固定化酶的制備方法，其特征在于:所述釀酒酵母單菌落的培養，包括， 引物設計:依據釀酒酵母DITl基因序列設計引物如下: 上游引物Pl
AATTTGTTAATATCCTAATTCGGTAAAGCTTTGTCGAGACATTAACAAAACGGATCCCCGGGTTAATTAA
下游引物Ρ2
TGTTTAAGTAAAAGAACAAAAAGGTAGACCAATGTAGCGCTCTTACTTTAGAATTCGAGCTCGTTTAAAC ；PCR擴增，利用上游引物Pl和下游引物Ρ2對質粒pFA6a-His3MX6進行PCR擴增，獲得含釀酒酵母DITl基因上下游序列的敲除片段； DITl基因的敲除，通過醋酸鋰/PEG的轉化方法將PCR擴增得到的his片段分別導入到釀酒酵母SKl得單倍體細胞4B和16D中，并進行篩選； 缺陷性菌株的篩選，使用SD-His缺陷性平板進行篩選，將得到的轉化菌株涂布到SD-His缺陷性平板上，待長出菌落后，挑取一定數目的菌落提取基因組，并進行PCR驗證，以與野生型菌株的基因組進行對比，若驗證成功，再將單倍體在SD-Leu-Arg平板上融合，得到缺陷性的二倍體菌株； 驗證引物如下: 上游引物:CATAAATTGTGCTCCTCCGC 下游引物:CATTGCAGTGTCTCGAAACC。
3.根據權利要求1所述的以釀酒酵母孢子為載體的新型固定化酶的制備方法，其特征在于:所述釀酒酵母單菌落的培養，YPAD固體培養基的配制為酵母提取物10g，蛋白胨20g，腺嘌呤30mg，瓊脂20g，定容于900mL蒸餾水中，121°C滅菌15min后，補加IOOmL單獨滅菌的20%葡萄糖。
4.根據權利要求1所述的以釀酒酵母孢子為載體的新型固定化酶的制備方法，其特征在于:所述釀酒酵母孢子的制備，YPAce培養基的配制為酵母提取物10g，蛋白胨20g，腺嘌呤30mg，定容于900mL蒸餾水中，121°C滅菌15min后，補加IOOmL單獨滅菌的20%醋酸鉀。
5.根據權利要求1所述的釀酒酵母孢子的制備方法，其特征在于:所述對釀酒酵母孢子進行純化，包括， 配制Percoll溶液，將處理過的細胞用0.5%Triton X-100溶液洗滌，以除去其中的裂解酶等雜質，然后將細胞懸浮在0.5%Triton X-100溶液中，配制不同梯度50%?80%不同濃度梯度的Percoll溶液； 釀酒酵母孢子的純化，將所述Percoll溶液按照從高濃度到低濃度依次加入到離心管中，最后加釀酒酵母細胞懸浮液，離心，將上層液體除去，得到純化的釀酒酵母孢子。
6.一種采用如權利要求1?5任一方法制備的以釀酒酵母孢子為載體的新型固定化酶，其特征在于:所述新型固定化酶是將β_半乳糖苷酶固定化到不含有二酪氨酸層的釀酒酵母缺陷型 孢子上。
【文檔編號】C12N15/09GK103436520SQ201310422568
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年9月16日 優先權日:2013年9月16日
【發明者】中西秀樹, 高曉冬, 張海妮, 李子杰 申請人:江南大學