一種基于等溫指數擴增法快速檢測miRNA的方法
【專利摘要】本專利公開了一種基于等溫指數擴增法快速檢測miRNA的方法，涉及熒光探針檢測技術領域。通過microRNA與模板DNA特異性結合，在聚合酶和內切酶的作用下實現目標物以指數的形式放大，較傳統方法有更高的靈敏度。本方法包括探針預變性?等溫指數擴增反應?熒光檢測三個步驟，反應時間短，能夠較好的區分單核苷酸的差異性，此外，等溫條件和簡單的熒光測量，將大大促進一個簡單，快速，低成本的檢測系統的發展，有助于我們對microRNA進行定量分析以及生物體的生理病理機制的理解，并最終為疾病的診斷和治療提供新的思路和理論基礎。
【專利說明】
一種基于等溫指數擴増法快速檢測m i RNA的方法
技術領域
[0001]本發明涉及熒光探針檢測技術領域，更具體地說是一種綜合了等溫指數擴增法和利用兩種發夾探針實現對miRNA的快速超靈敏的熒光檢測方法。【背景技術】
[0002]MicroRNA目前是一個十分活躍的研究領域，它對于深入探討生命現象的本質、解釋細胞行為和疾病發生機制、以及疾病診斷、基因治療藥物的開發都具有重大意義。同時細胞內microRNA的表達水平與人類重大疾病如癌癥等密切相關。為此microRNA的檢測成為當前研究的熱點和前沿，先后出現了一些microRNA檢測方法，但目前microRNA的檢測仍不能滿足實際需要，追求更高的檢測限、更靈敏的檢測方法一直是microRNA研究的目標。因此通過對microRNA高靈敏的檢測，能夠實現疾病早期預警的目的。
[0003]MicroRNA被視為一種新型的生物標志物和各種疾病的潛在治療靶標。在生物醫學領域上，microRNA有著十分重要的調節作用，microRNA的異常表達與癌癥的發展和各種疾病相關。microRNA具有調節基因表達活性的功能，廣泛存在于真核生物體內。microRNA的廣泛存在與進化上的保守性，暗示它在生命活動中具有必不可少的調節作用，他們參與動植物生長發育、細胞分化、細胞增殖與調亡、激素分泌、腫瘤形成等各種過程。microRNA無論在數量上還是功能上，可能都遠遠超過目前的發現，對其進行深入的研究，將有助于我們對生物體的各種生理病理機制的理解，并最終為疾病的診斷和治療提供新的思路和理論基礎。
[0004]為了解決microRNA在低濃度下也能進行檢測的問題，microRNA識別和信號放大策略變的尤為重要。然而，目前檢測方法，如單引物等溫擴增技術、滾環擴增反應、恒溫指數放大反應雖然具有較高的靈敏度和特異性，但是都比較耗時。因此發展一種既能特異性識別， 又能夠檢測到低濃度microRNA的方法具有重要意義。microRNA與模板DNA特異性結合，在聚合酶和內切酶的作用下實現microRNA以指數的形式放大，靈敏度高且操作簡單、省時省力。
【發明內容】
[0005]本發明要解決的技術問題是構建一種發夾探針特異性識別microRNA以及能實現快速靈敏檢測microRNA的方法。
[0006]—種基于等溫指數擴增的利用發夾探針靈敏、快速檢測microRNA的方法，其特征是包括以下步驟:(1)探針預變性首先，FAM標記的發卡探針1和DABCYL標記的發卡探針2以及模板DNA，在95 °C下分別孵育5min;將這三種溶液在室溫條件下放置30min;(2)等溫指數擴增反應以下步驟進行的總反應混合液體積為80 yL，不同濃度的microRNA與120 nM的模板 DNA部分序列雜交，加入0.25 mM的dNTPs，在濃度為65.0 U/mL的Vent DNA polymerase的作用下，使單鏈模板DNA進行復制形成雙鏈DNA，再加入666.7 U/mL的Nt.BstNBI，剪切下一條短的DNA引物鏈，最后加入20.0 nM的發卡探針1和發卡探針2混合于緩沖溶液中，混合溶液在55 °C反應1 h;緩沖溶液的成分為Nt.BstNBI buffer和ThermoPol buffer;(3)熒光檢測熒光檢測的實驗參數如下:激發波長為496 nm，發射波長范圍為500-650 nm。
[0007]本發明的有益效果(1)通過microRNA與模板DNA雜交，在聚合酶、內切酶作用下能夠實現目標物的指數擴增；(2)利用發卡探針1和發卡探針2特異性識別microRNA，實現熒光信號快速放大；(3)本發明所述方法操作簡單、反應快速。【附圖說明】
[0008]圖1為本文所述方法的實驗原理圖。【具體實施方式】
[0009]為了更好地理解本發明，下面結合實施例和附圖進一步闡明本發明的內容，但本發明的內容不僅僅局限于下面的實施。
[0010]實施例1一種基于等溫指數擴增的利用發夾探針靈敏、快速檢測microRNA的方法，其特征是包括以下步驟:(1)探針預變性首先，FAM標記的發卡探針1和DABCYL標記的發卡探針2以及模板DNA，在95 °C下分別孵育5 min;將這三種溶液在室溫條件下放置30 min;(2)等溫指數擴增反應以下步驟進行的總反應混合液體積為80 yL，不同濃度的microRNA與120 nM的模板 DNA部分序列雜交，加入0.25 mM的dNTPs，在濃度為65.0 U/mL的Vent DNA polymerase的作用下，使單鏈模板DNA進行復制形成雙鏈DNA，再加入666.7 U/mL的Nt.BstNBI，剪切下一條短的DNA引物鏈，最后加入20.0 nM的發卡探針1和發卡探針2混合于緩沖溶液中，混合溶液在55 °C反應1 h;緩沖溶液的成分為Nt.BstNBI buffer和ThermoPol buffer;(3)熒光檢測熒光檢測的實驗參數如下:激發波長為496 nm，發射波長范圍為500-650 nm。
[0011]實施例2檢測步驟同例1，不同之處是:步驟2中反應時間為0.5 h。
【主權項】
1.一種基于等溫指數擴增法快速檢測miRNA的方法，其特征是包括以下步驟:(1)探針預變性首先，FAM標記的發卡探針1和DABCYL標記的發卡探針2以及模板DNA，在95 °C下分別孵 育5 min;將這三種溶液在室溫條件下放置30 min;(2)等溫指數擴增反應以下步驟進行的總反應混合液體積為80 yL，不同濃度的microRNA與120 nM的模板 DNA部分序列雜交，加入0.25 mM的dNTPs，在濃度為65.0 U/mL的Vent DNA polymerase的作 用下，使單鏈模板DNA進行復制形成雙鏈DNA，再加入666.7 U/mL的Nt.BstNBI，剪切下一條 短的DNA引物鏈，最后加入20.0 nM的發卡探針1和發卡探針2混合于緩沖溶液中，混合溶液 在55 °C反應1 h;緩沖溶液的成分為Nt.BstNBI buffer和ThermoPol buffer;(3)熒光檢測熒光檢測的實驗參數如下:激發波長為496 nm，發射波長范圍為500-650 nm。2.如權利要求1所述的一種基于等溫指數擴增的利用發夾探針靈敏、快速檢測 microRNA的方法，其特征是步驟(2)中microRNA的濃度為0.375 nM，其核苷酸序列為說明書 核苷酸序列表中所述序列。3.如權利要求1所述的一種基于等溫指數擴增的利用發夾探針靈敏、快速檢測 microRNA的方法，其特征是步驟(2)中的反應溫度為55°C，反應時間為1 h。
【文檔編號】C12Q1/68GK106011274SQ201610551469
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月14日
【發明人】劉海云, 田甜, 顏梅, 于京華, 葛慎光, 張彥, 馬超
【申請人】濟南大學