一種通過超高壓誘變提高啤酒酵母富鋅能力的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種通過超高壓誘變提高啤酒酵母富鋅能力的方法，屬于微生物育種技術領域，特指一種將啤酒酵母細胞經超高壓處理誘變后，再利用含鋅選擇性培養基對突變株篩選、馴化，提高啤酒酵母對鋅的富集能力的方法。
【背景技術】
[0002]鋅作為人體必需的微量元素之一越來越受到人們的關注。鋅在人體內部主要是以有機態的形式被吸收、代謝，無機態的鋅不但不能被人體消化吸收，且具有一定的毒性。利用微生物的方法富集人和動物必需的微量元素，制造成本低廉且安全的功能性食品，也日益受到人們的青睞。酵母菌對鋅有一定的富集能力，可以將無機鋅轉化為有機鋅。常見的紫外線和化學誘變劑等誘變方法由于具有輻射性或毒性，在很大程度上限制了它們的應用。隨著高壓理論和技術的發展，高壓生物學的研宄已經深入到生物學的多個領域，超高壓誘變技術在工業微生物育種方面有了新的進展，但是利用超高壓技術來進行富鋅酵母選育的研宄較少。利用超高壓技術對啤酒酵母菌株進行誘變處理，可以獲取富鋅性能顯著性提高的正突變菌株，因其簡單實用、效果明顯。

【發明內容】

[0003]針對目前篩選高效富鋅微生物技術中存在的問題，本發明提供了一種通過超高壓誘變提高啤酒酵母富鋅能力的方法，從而獲得高產鋅的啤酒酵母以應用于食品、藥品等行業。
[0004]本發明的一種通過超高壓誘變提高啤酒酵母富鋅能力的方法，其包括以下步驟: ⑴將斜面保存的啤酒酵母菌進行預培養，接種于YH)液體培養基上，經28°C、150rpm
搖瓶培養1h達到對數生長期，取培養菌液于4°C、4000rpm離心lOmin，以無菌生理鹽水制備細胞濃度為16?10 7個/mL的菌體懸液。
[0005](2)將所制備的啤酒酵母菌懸液轉入滅菌的聚丙烯塑料包裝袋內并封口，置于超高壓處理機內在250MPa條件下高壓處理20min，進行超高壓誘變。
[0006](3)將誘變后的突變菌株涂布在啤酒酵母最大耐受鋅濃度(0.8mmol/L)的Zn-YPD選擇性培養基平板上，在28°C恒溫箱中倒置培養72h。觀察培養皿上長菌情況，挑取生長快、菌落較大的單菌落菌株。
[0007]⑷將初篩出的菌株接種于倍增的最大耐受鋅濃度的Zn-YPD選擇性培養基平板上，28°C恒溫培養72h，連續馴化傳代，得到穩定的抗性突變株，其對鋅的耐受濃度為3.2mmol/Lo
[0008]本發明通過超高壓誘變、初篩和馴化，得到對高濃度鋅充分耐受且富鋅能力較高的啤酒酵母突變菌株，其對鋅的耐受濃度達到3.2mmol/L，含鋅量達到2.75mg/g，比啤酒酵母出發菌含鋅量高出6.55倍。通過本方法大大地提高了啤酒酵母對鋅的耐受性及富鋅能力，相比較紫外線、化學誘變劑誘變更安全、操作簡單、效果更明顯。
【具體實施方式】
[0009]誘變流程:
啤酒酵母出發菌株活化一菌懸液超高壓誘變一含鋅選擇性培養基初篩一耐鋅性馴化—獲得高富鋅菌株。
[0010]從保藏試管的斜面里挑取啤酒酵母出發菌兩環，至盛有50mL YPD液體培養基的250mL三角瓶中，在28°C、150rpm搖瓶培養10h，達到對數生長期。取培養后的啤酒酵母菌液10mL，4°C、4000rpm離心1min后，以無菌生理鹽水洗滌三次制得菌體懸液。使用前在搖床內輕微振蕩30min，讓菌體分散均勻。將制備好的菌懸液適當稀釋，采用血球計數板調整細胞濃度為16個/mL，備用。
[0011]無菌操作條件下取啤酒酵母菌懸液5mL，轉入經121°C、20min條件下滅菌的聚丙烯塑料包裝袋內并封口，置于超高壓處理機內在250MPa條件下高壓處理20min，進行超高壓誘變。
[0012]將誘變后的突變菌株涂布在0.8mmol/L (最大耐受鋅濃度)的Zn-YPD選擇性培養基平板上，在28°C恒溫箱中倒置培養72h。挑取生長快、菌落較大的單菌落，依次涂布在兩至四倍最大耐受鋅濃度的Zn-YPD選擇性培養基平板上馴化傳代。在該平板上生長良好且穩定的菌落即為高效富鋅突變菌株。
【主權項】
1.一種通過超高壓誘變提高啤酒酵母富鋅能力的方法，其特征在于依次包括以下步驟: ⑴將斜面保存的啤酒酵母菌進行預培養，接種于Yro液體培養基上，經28°C、150rpm搖瓶培養1h達到對數生長期，取培養菌液于4°C、4000rpm離心lOmin，以無菌生理鹽水制備細胞濃度為16?10 7個/mL的菌體懸液； ⑵將所制備的啤酒酵母菌懸液轉入滅菌的聚丙烯塑料包裝袋內并封口，置于超高壓處理機內在250MPa條件下高壓處理20min，進行超高壓誘變； ⑶將誘變后的突變菌株涂布在啤酒酵母最大耐受鋅濃度(0.8mmol/L)的Zn-YPD選擇性培養基平板上，在28°C恒溫箱中倒置培養72h ; 觀察培養皿上長菌情況，挑取生長快、菌落較大的單菌落菌株； ⑷將初篩出的菌株接種于倍增的最大耐受鋅濃度的Zn-YH)選擇性培養基平板上，28°C恒溫培養72h，連續馴化傳代，得到穩定的抗性突變株，其對鋅的耐受濃度達到3.2mmol/Lo
2.根據權利要求1所述的通過超高壓誘變提高啤酒酵母富鋅能力的方法，其特征在于:步驟⑵的在250MPa條件下高壓處理20min。
3.根據權利要求1所述的通過超高壓誘變提高啤酒酵母富鋅能力的方法，其特征在于:步驟⑶的啤酒酵母最大耐受鋅濃度0.8mmol/Lo
4.根據權利要求1所述的通過超高壓誘變提高啤酒酵母富鋅能力的方法，其特征在于:步驟⑷的啤酒酵母突變株對鋅的耐受濃度為3.2mmol/Lo
【專利摘要】本發明公開了一種通過超高壓誘變提高啤酒酵母富鋅能力的方法，屬于微生物育種技術領域。將啤酒酵母出發菌株經活化、菌懸液細胞超高壓誘變處理、利用含鋅選擇性培養基對突變菌株篩選、馴化而提高啤酒酵母對鋅的富集能力。采用超高壓誘變獲得高富鋅啤酒酵母突變株，該方法相比較紫外線、化學誘變劑誘變更安全、操作簡單、效果更明顯。啤酒酵母突變菌株對鋅的耐受濃度達到3.2mmol/L，含鋅量達到2.75mg/g，比啤酒酵母出發菌含鋅量高出6.55倍。
【IPC分類】C12R1-865, C12N15-01
【公開號】CN104726446
【申請號】CN201510085777
【發明人】馬龍, 許秀勤
【申請人】馬龍
【公開日】2015年6月24日
【申請日】2015年2月18日