一種底物特異性提高的角蛋白酶突變體及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種底物特異性提高的角蛋白酶突變體及其制備方法，屬于酶工程領 域。
【背景技術】
[0002] 角蛋白酶（Keratinase)為一種可以特異性降解角蛋白的酶類，由真菌、放線菌和 細菌等多種微生物產生。角蛋白酶在食品、醫藥、飼料、精化和制革等工業中廣泛應用，具有 嫩化肉類、生產高級營養品、免疫制劑和飼料添加劑以及美容、軟化皮革等作用，并可導致 瘋牛病和人類克雅氏癥的阮蛋白（Prion)的降解。雖然角蛋白酶有著巨大的應用和研宄價 值，但是從野生菌中篩選出的角蛋白酶熱穩定性差，底物專一性不高，大大降低了角蛋白酶 的開發和運用。目前已經報道的角蛋白酶基因主要來自國外的一株地衣芽胞桿菌的kerA 基因。本發明將來自嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia)BBEll_l的角蛋 白酶KerSMD進行分子改造，提高角蛋白酶對酪蛋白或羽毛的底物專一性，對角蛋白酶的規 模化生產及推廣具有深遠的技術指導意義。

【發明內容】

[0003] 本發明要解決的第一個技術問題是提供一種底物特異性提高的角蛋白酶突變體， 是將來源于嗜麥芽窄食單胞菌的角蛋白酶的第180位的絲氨酸替換成甘氨酸，或者第208 位的谷氨酸替換為絲氨酸，或者第215位的酪氨酸替換成甘氨酸或者丙氨酸或者絲氨酸或 者苯丙氨酸，或者第180位的絲氨酸替換成甘氨酸同時將第215位的酪氨酸替換成丙氨酸 或者絲氨酸。
[0004] 在本發明的一種實施方式中，所述來源于嗜麥芽窄食單胞菌的角蛋白酶的氨基酸 序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0005] 在本發明的一種實施方式中，所述角蛋白酶突變體為第180位絲氨酸替換成甘氨 酸的S180G。
[0006] 在本發明的一種實施方式中，所述角蛋白酶突變體為第208位谷氨酸替換為絲氨 酸的E208S。
[0007] 在本發明的一種實施方式中，所述角蛋白酶突變體為第215位酪氨酸替換成甘氨 酸或者絲氨酸或者丙氨酸的Y215G、Y215S、Y215A。
[0008] 在本發明的一種實施方式中，所述角蛋白酶組合突變體為第180位絲氨酸替換成 甘氨酸和215位的酪氨酸替換成丙氨酸的S180G/Y215A。
[0009] 在本發明的一種實施方式中，所述角蛋白酶組合突變體為第180位絲氨酸替換成 甘氨酸和215位的酪氨酸替換成絲氨酸S180G/Y215S。
[0010] 本發明要解決的第二個技術問題是提供獲得所述角蛋白酶突變體的方法，具體步 驟如下：
[0011] (1)根據從嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia)BBEll_l 中獲得 編碼角蛋白酶KerSMD基因，克隆到pET22b (+)中，構建重組質粒pET22b+kerSMD ;
[0012] (2)采用滾環PCR的方法，設計中間含有突變氨基酸代表的密碼子堿基的互補引 物，PCR擴增質粒pET22b+kerSMD得到含有編碼角蛋白酶突變體的基因序列的開環重組載 體；
[0013] (3)將含有編碼正確突變體的基因的PCR反應液經過DpnI內切酶消化，除去未突 變的原來質粒，反應液直接轉化感受態大腸桿菌JM109,挑取正確復制子，并提取正確突變 質粒；
[0014] (4)將正確的重組載體轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，誘導表達，發酵上清液即角蛋白 酶突變體粗酶液。
[0015] 所述方法還進一步包括使用AKTA蛋白純化儀和HisTrap FF crude Iml的鎳柱對 角蛋白酶進行純化。
[0016] 將所述方法中步驟（4)獲得的重組菌在含有100 μ g/L的氨芐青霉素的LB培養基 中37 °C液體培養過夜，后接入含有100 μ g/L的氨芐青霉素的LB發酵液體培養基37 °C培養 至OD6tltl= 0. 6,降溫至20°C培養，加入最終濃度0.1 mM的誘導劑IPTG誘導，72h時離心獲得 上清酶液，即為粗酶液。
[0017] 通過對對選定位點的定點突變以及組合突變，本發明所得角蛋白酶突變體對酪蛋 白或羽毛的底物特異性明顯增強，突變體S180G、E208S、Y215S、Y215A、S180G/Y215A對羽毛 底物的特異性提高，突變體Y215G、S180G/Y215S對酪蛋白底物的特異性提高。且部分角蛋 白酶突變體熱穩定性顯著提高，角蛋白酶酶活顯著提高，比酶活也得到提升。對比原始角蛋 白酶，突變體E208S和Y215S，以及組合突變體S180G/Y215S最適反應溫度從原來的50°C提 升到60°C，并且孵育90min酶活損失不到35%。本發明提供的角蛋白酶突變體在40-70°C、 pH9. 0下與不溶性角蛋白底物反應，能夠很好的水解羽毛粉、羊毛，在洗滌、皮革紡織、飼料 消化、醫藥等領域具有很好的應用前景。
【附圖說明】
[0018] 圖1角蛋白酶KerSMD同源性模擬結構示意圖。A :角蛋白酶KerSMD的卡片結構及 三角催化中心（D42，H105，S289)和Sl 口袋組成氨基酸殘基（S180，E208，Y215，R216)。B: 角蛋白酶KerSMD的表明結構及相應氨基酸殘基。
[0019] 圖2構建角蛋白酶突變體質粒的滾環PCR基因操作圖，其中Primer 1和2分別是 互補引物。
[0020] 圖3角蛋白酶KerSMD及其突變體的SDS-PAGE電泳圖。M，蛋白分子量（kDa)，所有 蛋白的分子大小接近46kDa。
[0021] 圖4角蛋白酶突變體在不同溫度下的酶活（A)和在60°C下孵育不同時間后的殘余 酶活（B)。
[0022] 圖5任意組合突變體在60°C下的角蛋白酶活性和酪蛋白酶活性。
[0023] 圖6角蛋白酶KerSMD及其各種突變體的Sl 口袋模擬結構圖，A :WT，B :Y215A，C : Y215S，D :Y215G，E :S180G/Y215A，F :S180G/Y215S，圖中所圈出的線條示意口袋大小。
【具體實施方式】
[0024] 角蛋白酶酶活測定原理：角蛋白酶水解角蛋白底物，釋放出酪氨酸，通過酪氨酸與 福林酚顯色，在660nm下測定吸光度值。吸光值的大小直接與酶活力的高低成正比。
[0025] 角蛋白酶酶活測定步驟：0.1 mL經適當稀釋的酶液，加入0.1 mL的1% (w/v)羽毛 粉或不可溶性角蛋白底物（使用前和0. lmol/L的pH9. 0的Gly-NaOH緩沖液混合），在50°C 反應20min，每個反應樣品中加入0. 2mLTCA反應終止蛋白沉淀劑，搖勻后10, 000r/min離 心5min，取0. 2mL上清液加入ImL的4% (w/v)Na2C03，再加入0. 2mL上海生工公司購買的 福林酚試劑（預先稀釋3倍）在50°C下反應15分鐘。使用0. 5cm的石英比色杯測定清液 在660nm處的吸光值。空白對照是在加入底物之前已經加入同等體積的TCA終止酶活，其 他步驟相同。酶活定義為每毫升酶液每分鐘釋放出多少微克酪氨酸。
[0026] 實施例1編碼角蛋白酶突變體S180G的基因的構建
[0027] (1)先使用一對30bp互補引物S180G-F和S180G-R，以含有嗜麥芽窄食單胞菌 (Stenotrophomonas maltophilia)BBE11-1 (于2011年4月3日保藏于中國典型培養物保 藏中心，保藏編號為CCTCC No :M 2011193)角蛋白酶基因 kerSMD的質粒pET22b+kerSMD為 模版，進行滾環PCR擴增如圖1。反應條件為：95°C預變性5min后進入一下循環：98°C變性 1〇8,55°0退火1〇8,72°0延伸7!1^115〇8，15個循環 ；72°0延伸1〇1^11，然后再降溫到12°〇得 到最終反應液。使用的DNA擴增酶為TaKaRa公司的Primer STAR，使用配方參照產品說明 書。
[0028] (2)將擴增后的PCR產物用Dpn I處理，消化模板。
[0029] (3)將消化液直接進行轉化感受態大腸桿菌JM109,轉化產物涂布含100mg/L氨芐 青霉素的LB平板，37°C培養過夜，挑取單菌落驗證，將此質粒進行序列測定。選擇正確的測 序結果即為我們所需要的重組質粒。
[0030] (4)正確的突變質粒轉化大腸桿菌BL21，37°C培養過夜，挑取單菌落為我們所需 的產重組角蛋白酶工程菌。
[0031] 表1角蛋白酶突變體的重疊 PCR引物序列
[0032]
【主權項】
1. 一種角蛋白酶突變體，其特征在于，是將來源于嗜麥芽窄食單胞菌的角蛋白酶的第 180位的絲氨酸替換成甘氨酸，或者第208位的谷氨酸替換為絲氨酸，或者第215位的酪氨 酸替換成甘氨酸或者丙氨酸或者絲氨酸或者苯丙氨酸，或者第180位的絲氨酸替換成甘氨 酸同時將第215位的酪氨酸替換成丙氨酸或者絲氨酸。
2. 根據權利要求1所述的角蛋白酶突變體，其特征在于，所述來源于嗜麥芽窄食單胞 菌的角蛋白酶的氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示。
3. 編碼權利要求1所述角蛋白酶突變體的基因。
4. 攜帶權利要求3所述基因的載體或重組細胞。
5. -種獲得權利要求1所述角蛋白酶突變體的方法，其特征在于，具體步驟如下： (1)將從嗜麥芽窄食單胞菌BBEll-I中獲得的編碼角蛋白酶的基因，克隆到pET22b(+) 中，構建重組質粒pET22b+kerSMD; (2)采用滾環PCR的方法，設計含有代表突變氨基酸的密碼子堿基的互補引物，PCR擴 增質粒pET22b+kerSMD得到含有編碼角蛋白酶突變體的基因序列的開環重組載體； (3) 將含有編碼正確突變體的基因的PCR反應液經過DpnI內切酶消化，除去未突變的 原質粒，反應液直接轉化感受態大腸桿菌JM109,挑取正確復制子，并提取正確突變質粒； (4) 將正確的重組載體轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，誘導表達，發酵上清液即角蛋白酶突 變體粗酶液。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，還進一步包括使用AKTA蛋白純化儀和 HisTrapFFcrudeIml的鎳柱對角蛋白酶進行純化。
7. 根據權利要求5所述的方法，其特征在于，將步驟（4)獲得的重組菌在含有100yg/ L的氨芐青霉素的LB培養基中37°C液體培養過夜，后接入含有100yg/L的氨芐青霉素的 LB發酵液體培養基37°C培養至OD6qq= 0.6,降溫至20°C培養，加入最終濃度0.ImM的誘導 劑IPTG誘導，72h時離心獲得上清酶液，即為粗酶液。
8. 權利要求1所述角蛋白酶突變體在日化洗滌產品中的應用。
9. 權利要求1所述角蛋白酶突變體在紡織領域的應用。
10. 權利要求1所述角蛋白酶突變體在飼料消化中的應用。
【專利摘要】本發明公開了一種底物特異性提高的角蛋白酶突變體及其制備方法，屬于酶工程領域。本發明通過分析得出最佳突變點進行定點突變，獲得角蛋白酶酶活和底物專一性提高的優秀突變體。該角蛋白酶及其突變體能夠有效水解羽毛，羊毛等非水溶性角蛋白底物，可用于皮革紡織工業和飼料工業。
【IPC分類】C12N15-57, A23K1-165, C12N9-52, C11D3-386, D06M16-00, C12N15-70
【公開號】CN104726436
【申請號】CN201510119684
【發明人】張娟, 方真, 堵國成, 陳堅, 劉柏宏
【申請人】江南大學
【公開日】2015年6月24日
【申請日】2015年3月18日