多肽藥物DiaPep277 的合成方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種多肽的合成方法，更具體而言，涉及DiaPep277的合成方法。
【背景技術】
[0002] 以色列安多米達生物技術公司的合成肽--DiaP印277是源自人熱休克蛋白60 序列上的一段含24個氨基酸的肽段，其序列如下：
[0003] H-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Val-Ala-Leu-Leu-Arg-Val-Ile-Pr〇-Ala-Leu-Asp-Ser -Leu-Thr-Pr〇-Ala-Asn-Glu_Asp-〇H
[0004] 多項臨床前試驗結果顯示，DiaPep277能通過誘導Th2和Treg的產生來抑制致糖 尿病免疫反應，從而有效阻止0細胞的破壞，并保留其胰島素分泌功能，進而有可能改善 血糖控制，減少胰島素用量。更重要的是，DiaPep277的免疫調節作用具有特異性，不會干擾 其他免疫功能，因此在臨床試驗中表現出極佳的安全性。這種藥物可以明顯提高I型糖尿 病患者的生存質量，延緩或阻止各種并發癥的發生，以提高患者的預期壽命。目前，FDA已 授予DiaPep277孤兒藥地位，用于治療有殘余0細胞功能的I型糖尿病患者。
[0005] 鑒于DiaPep277在治療I型糖尿病中的特殊地位和廣泛的應用前景，其合成方法 的開發也變得日趨緊要。由于DiaPep277肽段中存在大量的疏水殘基，會引起樹脂收縮嚴 重，如采用標準的固相逐步偶聯縮合技術難以順利偶聯，導致純度很低，特別是偶聯片段 Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Val時容易產生缺損肽及增加或減少Gly的雜質。
[0006] 因此，需要開發一種新的合成DiaP印277的方法，其具有改進的純度和收率。

【發明內容】

[0007] 針對現有技術的不足，本發明通過采用片段固相縮合手段，可有效的避免樹脂收 縮帶來的偶聯不完全的缺損肽及增加或減少Gly的雜質，進而提高DiaPep277粗肽的純度 與收率。
[0008] 本發明的目的是提供一種DiaP印277的合成方法，具體提供一種DiaP印277的片 段固相合成方法，其包括下述步驟：
[0009] (1)以王樹脂或2-CTC樹脂為載體合成Fmoc-Asp(OtBu)-樹脂，然后采用固相多肽 合成方法將其從C端到N端逐一偶聯氨基酸、然后脫除Fmoc保護基，得到肽樹脂A:
[0010] H-Val-Ala-Leu-Leu-Arg(pbf)-Val-Ile-Pr〇-Ala-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Leu -Thr(tBu) -Pro-Ala-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-樹脂；
[0011] (2)以2-CTC樹脂為載體合成Fmoc-Gly-2-CTC樹脂，然后采用固相多肽合成方法 將其從C端到N端逐一偶聯氨基酸，得到肽樹脂B:Fm〇C-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-2-CTC樹 脂；
[0012] (3)將肽樹脂B進行裂解，得多肽片段b:
[0013] Fmoc-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-〇H；
[0014] (4)將多肽片段b與肽樹脂A進行固相偶聯得到肽樹脂C:
[0015] Fmoc-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Val-Ala-Leu-Leu-Arg(pbf)-Val-Ile-Pr〇-Ala-Leu -Asp(OtBu)-Ser(tBu) -Leu-Thr(tBu) -Pro-Ala-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-樹脂；
[0016] (5)將肽樹脂C裂解得到DiaPep277 :
[0017] H-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Val-Ala-Leu-Leu-Arg-Val-Ile-Pr〇-Ala-Leu-Asp-Ser -Leu-Thr-Pr〇-Ala-Asn-Glu_Asp-〇H〇
[0018] 本發明的DiaPep277的片段固相合成方法相對于傳統的固相逐步偶聯縮合法不 僅保持了操作簡便、后處理容易等優點，還具有收率高、純度好的優勢，為DiaPep277的大 規模生產提供了一種全新的思路。
【具體實施方式】
[0019] 術語解釋
[0020] 本文通篇的術語"固相多肽合成方法"、"固相偶聯"是指多肽合成領域已知的 Fmoc固相合成方法，例如記載于FmocSolidPhasePeptideSynthesis:APractical Approach,W.C.Chan,PeterD.White著，March2, 2〇00(ISBN-10:0199637245)，英國Oxford UniversityPress。
[0021] 本文通篇的術語"片段固相合成"是一種運用Fmoc固相合成方法來合成多個多肽 片段，然后將該多個多肽片段固相偶聯的方法。
[0022] 本文通篇的術語"肽樹脂"是指多肽的C端連有樹脂的多肽樹脂。
[0023] 本文通篇的術語"多肽片段"是指上文提及的"肽樹脂"脫除C端樹脂而露出游離 羧基的多肽。
[0024] 說明書和權利要求書中所使用英文縮寫的含義列于下表中：
[0025]
[00：
【主權項】
1. 一種合成DiaP印277的方法，包括下述步驟： (1) 以王樹脂或2-CTC樹脂為載體合成Fmoc-Asp (OtBu)-樹脂，然后采用固相多肽合成 方法將其從C端到N端逐一偶聯氨基酸、然后脫除Fmoc保護基，得到肽樹脂A: H-Val-Ala-Leu-Leu-Arg(pbf)-Val-Ile-Pro-Ala-Leu-Asp(OtBu)-Ser (tBu)-Leu-Thr (tBu) -Pro-Ala-Asn (Trt) -Glu (OtBu) -Asp (OtBu)-樹脂； (2) 以2-CTC樹脂為載體合成Fmoc-Gly-2-CTC樹脂，然后采用固相多肽合成方法將其 從C端到N端逐一偶聯氨基酸，得到肽樹脂B: Fmoc-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-2-CTC樹脂； (3) 將肽樹脂B進行裂解，得多肽片段b: Fmoc-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-OH ； (4) 將多肽片段b與肽樹脂A進行固相偶聯得到肽樹脂C : Fmoc-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Val-Ala-Leu-Leu-Arg(pbf)-Val-Ile-Pro-Ala-Leu-Asp (OtBu) -Ser (tBu) -Leu-Thr (tBu) -Pro-Ala-Asn (Trt) -Glu (OtBu) -Asp (OtBu)-樹脂； (5) 將肽樹脂C裂解得到DiaPep277 : H-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Val-Ala-Leu-Leu-Arg-Val-Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu -Thr-Pr〇-Ala-Asn-Glu-Asp-〇H〇
2. 權利要求1的方法，其中，步驟（1)中的樹脂為王樹脂；所得的Fmoc-Asp (OtBu)-樹 脂的替代度為〇. 4~0. 7mmol/g。
3. 權利要求1的方法，其中，步驟（2)中所述2-CTC樹脂的替代度范圍為0.6~ I. 2mmol/g，優選為 0· 8 ~1.0 mmol/g。
4. 權利要求1的方法，其中，步驟（1)和（2)中的固相多肽合成方法在偶聯劑的存在 下進行，所用的偶聯劑為以下成分的組合物：DIP⑶I和HOBt ;PyB0P、HOBt和DIPEA ;TBTU、 HOBt 和 DIPEA ;或 HBTU、HOBt 和 DIPEA。
5. 權利要求1的方法，其中，步驟（1)和（2)中的固相多肽合成方法在偶聯劑的存 在下進行，所用的偶聯劑為DIPCDI和HOBt的組合物，其中各成分的比例以摩爾比計為 DIPCDI:H0BT=1:1 ~1. 2。
6. 權利要求1的方法，其中，步驟（4)中的固相偶聯在偶聯劑的存在下進行，所用的 偶聯劑為以下成分的組合物：PyB0P、HOBT和DIPEA ;PyB0P和DIPEA ;DIPCDI和HOAT ;或 DIPCDI 和 HOBT。
7. 權利要求1的方法，其中，步驟（4)中的固相偶聯在偶聯劑的存在下進行，所用的偶 聯劑為PyBOP、HOBT和DIPEA的組合物，其中偶聯劑中各成分的比例以摩爾比計為PyBOP : HOBT :DIPEA=L 0:L 2:2. 0。
8. 權利要求1的方法，其中，步驟（3)中的裂解過程在裂解液的存在下進行，所述裂解 液為以體積計為TFE :DCM=1:99的混合物。
9. 權利要求1的方法，其中，步驟（5)中的裂解過程在裂解液的存在下進行，所述裂解 液為以體積計為TFA :TIS :H20=95 :5 :5的混合物。
10. 權利要求1-9中任一項的方法，還包括DiaPep277的純化步驟，所述純化步驟采用 反相高壓液相色譜法，包括：以反相十八烷基硅烷為固定相，以〇. 2%三氟乙酸/乙腈為流動 相，收集目的峰餾分，濃縮凍干。
【專利摘要】本發明涉及DiaPep277的片段固相合成方法：構建肽樹脂A:H-Val-Ala-Leu-Leu-Arg(pbf)-Val-Ile-Pro-Ala-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Leu-Thr(tBu)-Pro-Ala-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-樹脂和肽樹脂B:Fmoc-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-2-CTC樹脂，然后將兩個片段偶聯。所述方法收率高且純度好，為DiaPep277的工業規模生產提供了一種新的思路。
【IPC分類】C07K14-47, C07K1-04, C07K1-06
【公開號】CN104650209
【申請號】CN201310585416
【發明人】張文治, 劉建, 馬亞平, 袁建成
【申請人】深圳翰宇藥業股份有限公司
【公開日】2015年5月27日
【申請日】2013年11月19日