一種靈芝孢子活性成分的提取方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物與化妝品領域，具體涉及靈芝孢子活性成分的提取方法，以及 靈芝孢子活性成分在抗衰老產品中的應用。
【背景技術】
[0002] 靈芝，又稱之為靈芝草、仙草等，原產于亞洲東部，中國分布最廣的在江西。靈芝屬 于擔子菌亞門、多孔菌目、多孔菌科、靈芝菌屬的真菌。李時珍在《本草綱目》中指出，靈芝 有"增智慧，好顏色"之功效，靈芝是一種具有抗皺、消炎、清除色斑、保護皮膚的真菌。靈芝 含有抑制黑色素的成分及多種對皮膚有益的微量元素等，這些成分能夠通過減少人體自由 基，加速細胞的再生，增加皮膚的厚度并增加膠原質，達到豐潤皮膚、消除細紋與皺紋的效 果。其中的多糖成分能夠通過保持和調節皮膚水性，恢復皮膚彈性，使皮膚濕潤、細膩。近 年來，大家對靈芝中的靈芝酸、靈芝多糖及靈芝多肽的提取及藥用價值研宄頗多，而真正提 取靈芝孢子活性成分的很少，更別提將其應用于抗衰老產品中。本發明主要研宄靈芝孢子 活性成分的分離以及該活性成分在抗衰老產品中的應用。
[0003] 靈芝孢子長在靈芝菌蓋中，成熟后由靈芝菌管彈射出來，一些會落在菌蓋表面，一 些會飄灑在四周。對于靈芝孢子，其呈褐色、卵形（8. 5?11.2) ymX (5. 2-6. 9) ym，具雙層 壁。且靈芝孢子包裹的兩層壁十分堅韌，一般的化學，物理方法很難將其打破，故限制了對 其化學成分、生物活性成分的研宄。建立有效的破壁方法，可以促進對其生物活性成分的提 取、藥用價值及抗衰老方面的研宄。
[0004] 現有的破壁方法主要有兩種：一是生物破壁法，以無菌的靈芝孢子粉加入蛹蟲草 進行固體發酵，使靈芝孢子粉破壁。由于其制備過程中需要經過長時間的發酵，而且發酵 后必須經過固液分離，干燥，才能得到破壁后的靈芝孢子粉，工藝較為復雜，容易引入其它 雜質，破壞靈芝孢子的營養成分。二是機械粉碎法，精選靈芝孢子粉，添加20?80%的水， 50°C干燥12h以上，放入罐體，球料比（2-3) :1，球料占罐體的四分之三左右，球磨時間4? 9h，大珠、中珠、小珠的個數比例為1:1: 1，進行破壁處理，得破壁靈芝粉。此種方法球磨效率 一般，破壁率較低，球磨過程中對于營養成分的損失較大，且容易引入重金屬元素。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供了一種更為有效的破壁方法，即先 將靈芝孢子用質量濃度為0. 2-0. 5 %果膠酶和質量濃度為0. 2-0. 5 %纖維素酶聯合消化 后，再將干冰和無水乙醇的組成混合溶液將溫度控制在（_6〇°C )-(-20°C )，采用超聲波機 械粉碎破碎的方法破碎靈芝孢子細胞壁，從而有效得到靈芝孢子活性成分。并將靈芝孢子 活性成分進行純化凍干，應用在抗衰老產品中。
[0006] 本發明的目的通過以下技術方案來實現：
[0007] -種靈芝孢子活性成分的提取方法，將準備好的靈芝孢子進行以下處理：
[0008] (1)軟化處理：將靈芝孢子浸泡在質量濃度為0. 2-0. 5%纖維素酶和質量濃度為 0. 2-0. 5%果膠酶組成的混合酶溶液里，軟化靈芝孢子壁；
[0009] (2)低溫真空干燥：將靈芝孢子置于（_60°C )-(-20°C )的干冰和無水乙醇的混合 溶液中保存，真空干燥處理；
[0010] (3)低溫破壁：在（_60°C )-(-20°C )下對靈芝孢子用超聲波進行機械粉碎破壁， 得到靈芝孢子提取物。
[0011] 優選的，軟化所述靈芝孢子壁3-8小時。
[0012] 優選的，所述靈芝孢子低溫保存時間為1-5小時。
[0013] 優選的，將所述靈芝孢子置于干冰和無水乙醇的混合物中，并優選為_20°C的條件 下，采用超聲波進行機械粉碎破壁。本發明中采用的機械粉碎破壁方法相對傳統的機械粉 碎方法其時間更短，破壁率更高，可充分使靈芝孢子內部有效活性成分釋放，提高了靈芝孢 子制品的應用價值。
[0014] 所述靈芝孢子的準備包括以下步驟：
[0015] (1)收集：人工培養靈芝結束后，收集靈芝孢子；
[0016] (2)篩選：將靈芝孢子用篩網進行過濾；
[0017] (3)漂洗：用水沖洗過濾后的靈芝孢子。
[0018] 優選的，所述靈芝孢子篩選采用200目以上的篩網進行過濾。
[0019] 一種將權利要求1的靈芝孢子提取物制成靈芝孢子活性成分凍干粉的方法，包括 以下步驟：
[0020] (1)過濾：收集靈芝孢子提取液，用孔徑小于0. 45yM的濾膜過濾；
[0021] (2)濃縮：濃縮上清液，濃縮至濃縮液中蛋白濃度為50±0. 5 y g/ml ;
[0022] (3)過濾：經濃縮液采用孔徑小于0. 22 y M的濾膜過濾；
[0023] (4)凍干處理：凍干溫度為（_20°C )-(_35°C)，真空度為50-200Pa，凍干時間為 24-36小時，即得到靈芝孢子活性成分凍干粉。
[0024] 所述的靈芝孢子活性成分凍干粉在抗衰老扶護品中應用，尤其是在化妝品中的應 用。所述抗衰老扶護品即不局限于在面霜、面膜、乳液、洗面乳、爽膚水、眼霜等化妝品或其 它抗衰老產品中的應用。能有效達到祛痘、消除痘痕、除皺、去細紋等的效果。
[0025] 所述靈芝孢子活性成分凍干粉在抗衰老扶護品中的添加量為1-5 y g/ml。
[0026] 有益效果：
[0027] 1、破碎靈芝孢子細胞壁時間短。本發明結合了雙酶溶液和低溫機械法軟化并破碎 靈芝孢子細胞壁的方法，即先用纖維素酶和果膠酶聯合軟化靈芝孢子壁，然后在低溫環境 中對靈芝孢子進行機械粉碎破壁處理。有效縮短了破碎靈芝孢子細胞壁的時間，大大的提 高了靈芝孢子的破壁率。
[0028] 2、本發明提取的靈芝孢子活性成分對人皮膚成纖維細胞無毒、無副作用，能有效 應用于抗衰老產品中。本發明將靈芝孢子活性成分應用于抗衰老產品中，如面膜、面霜、乳 液等化妝品，有效達到祛痘、消除痘痕、除皺、去細紋等的效果。
【附圖說明】
[0029] 圖1為靈芝孢子活性成分的提取及應用流程圖；
[0030] 圖2為靈芝孢子活性成分凍干粉水溶液對人皮膚成纖維細胞（HSF)增殖活力的影 響。
【具體實施方式】
[0031] 為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明 進行進一步詳細說明。
[0032] 圖1為靈芝孢子活性成分的提取及應用流程圖。下面結合實施例進一步說明。
[0033] 實施例1
[0034] 一種靈芝孢子活性成分的提取方法，包括以下步驟：
[0035] 1、靈芝孢子的培育
[0036] (1)本發明采用斜面培養基培養靈芝菌種（購自中國普通微生物菌種保藏管理中 心，編號為CGMCC 5. 616)。該斜面培養基為馬鈴薯葡萄糖（PDA)瓊脂培養基，具體配方見表 1。靈芝菌種的培養條件是：培養溫度28°C，濕度暗培養，培養時間為7天。
[0037] 表1馬鈴薯葡萄糖（PDA)瓊脂培養基配方
[0038]
【主權項】
1. 一種靈芝孢子活性成分的提取方法，其特征在于，將準備好的靈芝孢子進行以下處 理： (1) 軟化處理：將靈芝孢子浸泡在質量濃度為0. 2-0. 5 %纖維素酶和質量濃度為 0. 2-0. 5%果膠酶組成的混合酶溶液里，軟化靈芝孢子壁； (2) 低溫真空干燥：將靈芝孢子置于（_60°C )-(-20°C )下保存，真空干燥處理； (3) 低溫破壁：在（_60°C )-(_20°C )下對靈芝孢子進行機械粉碎破壁，得到靈芝孢子 提取物。
2. 根據權利要求1所述的一種靈芝孢子活性成分的提取方法，其特征在于，軟化所述 靈芝孢子壁3-8小時。
3. 根據權利要求1所述的一種靈芝孢子活性成分的提取方法，其特征在于，所述靈芝 孢子低溫保存時間為1-5小時。
4. 根據權利要求1所述的一種靈芝孢子活性成分的提取方法，其特征在于，將所述靈 芝孢子置于干冰和無水乙醇的混合物中，采用超聲波進行機械粉碎破壁。
5. 根據權利要求1所述的一種靈芝孢子活性成分的提取方法，其特征在于，所述靈芝 孢子的準備包括以下步驟： (1) 收集：人工培養靈芝結束后，收集靈芝孢子； (2) 篩選：將靈芝孢子用篩網進行過濾； (3) 漂洗：用水沖洗過濾后的靈芝孢子。
6. 根據權利要求5所述的一種靈芝孢子活性成分的提取方法，其特征在于，所述靈芝 孢子篩選采用200目以上的篩網進行過濾。
7. -種將權利要求1的靈芝孢子提取物制成靈芝孢子活性成分凍干粉的方法，其特征 在于包括以下步驟： (1) 過濾：收集靈芝孢子提取液，用孔徑小于0. 45 μ M的濾膜過濾； (2) 濃縮：濃縮上清液，濃縮至濃縮液中蛋白濃度為50 ±0. 5 μ g/ml ; (3) 過濾：經濃縮液采用孔徑小于0. 22 μ M的濾膜過濾； (4) 凍干處理：凍干溫度為（_20°C )-(_35°C )，真空度為50-200Pa，凍干時間為24-36 小時，即得到靈芝孢子活性成分凍干粉。
8. 權利要求7所述的靈芝孢子活性成分凍干粉在抗衰老扶護品中應用。
9. 如權利要求8所述的應用，其特征在于：所述抗衰老扶護品為面膜、爽膚水、面霜、乳 液、眼箱、洗面乳。
10. 如權利要求8所述的應用，其特征在于：所述靈芝孢子活性成分凍干粉在抗衰老扶 護品中的添加量為1-5 μ g/ml。
【專利摘要】本發明公開了一種靈芝孢子活性成分的提取方法及其應用，提取方法包括以下步驟：(1)軟化處理：將靈芝孢子浸泡在質量濃度為0.2-0.5％纖維素酶和質量濃度為0.2-0.5％果膠酶組成的混合酶溶液里，軟化靈芝孢子壁；(2)低溫真空干燥；(3)低溫破壁：在低溫環境下對靈芝孢子進行機械粉碎破壁。本發明結合了雙酶溶液和低溫機械法軟化并破碎靈芝孢子細胞壁的方法，有效減低了破碎靈芝孢子細胞壁的難度且縮短了時間。本發明提取的靈芝孢子活性成分對人皮膚成纖維細胞無毒、無副作用，能有效應用于抗衰老化妝產品中。如面膜、面霜、乳液等化妝品，有效達到祛痘、消除痘痕、除皺、去細紋等的效果。
【IPC分類】A61Q19-10, C12N1-06, A61Q19-00, A61K8-02, C12R1-645, A61Q19-08, A61K8-99
【公開號】CN104611226
【申請號】CN201410718505
【發明人】陳海佳, 王一飛, 葛嘯虎, 羅二梅, 王小燕, 馬巖巖
【申請人】廣州賽萊拉干細胞科技股份有限公司
【公開日】2015年5月13日
【申請日】2014年11月28日