制備低內毒素殼聚糖的方法
【專利說明】制備低內毒素殼聚糖的方法
[0001] 本發明涉及制備低內毒素堿性殼聚糖的方法，還涉及制備低內毒素中性殼聚糖、 殼聚糖鹽和殼聚糖衍生物的方法，并涉及這些方法的產物。
[0002] 殼聚糖特別用于制備控制出血使用的止血材料。
[0003] 殼聚糖是來自甲殼類動物處理的固體廢物衍生物，并且可從真菌培養物提取。殼 聚糖是水不溶性陽離子聚合物質。在殼聚糖用于止血材料之前，通常首先轉化成水溶性鹽。 以這種方式，殼聚糖鹽在血液中可溶形成阻止血流的凝膠。
[0004] 由于殼聚糖在身體中容易分解，殼聚糖鹽理想適用于本文所述應用。殼聚糖通過 溶菌酶轉化成葡糖胺，并因此自然從身體排泄。不必從身體去除殼聚糖。另外，殼聚糖鹽顯 示溫和的抗菌性質，因此，它們的使用減小感染風險。
[0005] 為了在適用于控制出血的止血材料制備中利用殼聚糖，有必要保證殼聚糖具有足 夠低的內毒素濃度。
[0006] 內毒素是格蘭氏陰性菌的外膜表面上存在的脂多糖。內毒素對哺乳動物為高度毒 性，特別是對人，且眾所周知難以從材料去除。在釋放進入血流或通常未發現它們的其它組 織時，內毒素可變成熱原性。因此，內毒素必須從藥學上可接受的產物去除。
[0007] 處理去除或破壞熱原，特別是內毒素，被稱為"去熱原"法。包含內毒素的材料去 熱原的技術包括離子交換色譜、超濾、蒸餾和針對破壞內毒素的各種化學方法。
[0008] W02008063503涉及從殼聚糖去除內毒素的方法，所述方法包括以下步驟： a) 在無菌環境中使用無菌無熱原設備和材料； b) 使包含內毒素的殼聚糖溶脹最多24小時； c) 使lkg/25L至1. 5kg/25L殼聚糖溶于0. 01M至4. 0M氫氧化物堿； d) 連續攪拌所得殼聚糖堿溶液； e) 在攪拌下，將溶液在60-100°C之間加熱45分鐘至4小時； f) 用最多l〇x體積超純無內毒素水沖洗溶液； g) 將溶液中和到6. 8和7. 5之間的pH ; h) 形成超純低內毒素殼聚糖漿料，并轉移到無內毒素封閉系統； i) 從漿料去除過量水。
[0009] 這是一個復雜且費用大的過程，尤其需要無菌設備，且需要用10x體積無內毒素 的水沖洗溶液。
[0010] US2006293509涉及通過以下步驟制備具有低內毒素的水溶性殼聚糖的方法： (a) 使水不溶性殼聚糖與堿性溶液接觸大于1小時的第一時間段； (b) 理想用無內毒素水沖洗水不溶性殼聚糖，以去除殘余堿性溶液； (c) 使水不溶性殼聚糖在包含相轉移劑的反應溶液中部分乙酰化； (d) 使部分乙酰化的水溶性殼聚糖溶于包含表面活性劑且具有約7. 0至約7. 4的pH的 水溶液； (e) 將水混溶性溶劑加入到水溶液，并進一步將水溶液的pH調節到至少8. 0的pH，以 使具有低內毒素含量的水溶性殼聚糖從水溶液/水混溶性溶劑混合物沉淀；和 (f)任選在非溶劑中洗滌，例如，異丙醇。
[0011] 然而，這一過程復雜且花費大，并且合乎需要包括使用大量無內毒素的水或其它 液體。此過程也需要使用相轉移劑，并且經數小時進行。
[0012] TW593342涉及通過以下步驟減少殼聚糖中內毒素的方法： (a) 使包含內毒素的殼聚糖溶于水溶液； (b) 使水溶液與表面活性劑接觸，以形成不溶性固體和內毒素含量減小的水溶液； (c) 使用固體/液體分離裝置從水溶液分離固體。
[0013] 然而，這一過程需要表面活性劑與溶解的殼聚糖反應產生不溶性固體。得到的固 體為殼聚糖和表面活性劑的混合物或殼聚糖和表面活性劑之間的反應產物。
[0014] 本發明目的在于減輕前述困難。
[0015] 根據本發明的第一個方面，提供一種制備低內毒素堿性殼聚糖的方法，所述方法 包括以下步驟： (a) 使殼聚糖與堿性溶液接觸，以形成混合物；和 (b) 讓混合物保持至少約12小時。
[0016] 根據本發明的另一個方面，提供一種制備低內毒素堿性殼聚糖的方法，所述方法 包括以下步驟： (a) 使殼聚糖與堿性溶液接觸，以形成混合物； (b) 讓混合物保持至少約12小時；和 (c) 干燥混合物。
[0017] 本發明的方法提供得到具有低內毒素濃度的堿性殼聚糖的有效方式。所述方法有 利的是不需要洗滌步驟、沖洗步驟、使用表面活性劑或相轉移劑、無菌設備和/或使用無內 毒素的水。另外，也不需要專用空氣過濾或無菌條件。本發明的方法優選不包括使殼聚糖 乙酰化的步驟。
[0018] 本文所用術語"堿性溶液"是指具有大于pH 7. 5的pH值的溶液。
[0019] 由于內毒素的分子量可顯著不同，因此，內毒素濃度以內毒素單位（EU)/克材料 測定。內毒素濃度的測定是內毒素水平相對于具體量參比內毒素的定量。
[0020] 例如，在本發明中，內毒素濃度以內毒素單位（EU)/克殼聚糖測定。本文所用術語 "低內毒素"是指具有小于1〇〇內毒素單位（EU)/克殼聚糖的內毒素濃度。
[0021] 因此，本發明的方法適用于制備具有小于l〇〇EU/g內毒素濃度的堿性殼聚糖。
[0022] 優選所得堿性殼聚糖具有小于50EU/g的內毒素濃度，更優選小于20EU/g，甚至更 優選小于15EU/g，最優選小于10EU/g。
[0023] 已發現，低濃度堿性溶液在本發明方法中優選。在所述方法中使用的堿性溶液的 濃度可以為約0.01M至約1M。優選堿性溶液的濃度小于1M。優選堿性溶液的濃度為約 0. 02M至0. 2M，甚至更優選堿性溶液的濃度為約0. 04M至0. 06M，一般0. 05M。堿性溶液的濃 度可以為約 〇? 01M、0. 05M、0. 10M、0. 15M、0. 20M、0. 25M、0. 30M、0. 35M、0. 40M、0. 45M、0. 50M、 0? 55M、0. 60M、0. 65M、0. 70M、0. 75M、0. 80M、0. 85M、0. 90M 或 0? 95M。已利用 0? 1M 堿性溶液的 濃度觀察到良好結果。
[0024] 在一些實施方案中，堿性溶液與殼聚糖的量可以為約1份殼聚糖比約10份堿性溶 液至約10份殼聚糖比約1份堿性溶液。優選堿性溶液與殼聚糖的量為約1份堿性溶液比 約2份殼聚糖，更優選約1份堿性溶液比約1份殼聚糖。
[0025] 堿性溶液可包含堿或堿土金屬（alkaline earth)組分，所述堿或堿土金屬組分 選自單獨或組合的以下組分：金屬氫氧化物、金屬碳酸鹽、金屬亞硫酸氫鹽、金屬過硅酸鹽 (persilicate)、共軛堿和氫氧化銨。
[0026] 適合的金屬包括鈉、鉀、鈣或鎂。
[0027] 優選堿組分為氫氧化鈉、氫氧化鉀或碳酸鈉。一般使用氫氧化鈉。
[0028] 可通過在本領域已知的任何適合方法使堿性溶液與殼聚糖接觸。例如，可使堿性 溶液噴到殼聚糖上，或者可使殼聚糖與堿性溶液混合。優選堿接觸的殼聚糖均勻分布。
[0029] 優選使殼聚糖與堿性溶液混合。在低分子量，殼聚糖可完全或部分溶于堿性溶液。 可使殼聚糖與堿性溶液混合最多約30分鐘，更優選約10分鐘。在一些實施方案中，可使殼 聚糖與堿性溶液混合大于30分鐘。在一些實施方案中，可將殼聚糖和堿性溶液的混合物間 歇攪拌步驟（b)的持續時間。
[0030] 將殼聚糖和堿性溶液的混合物保持一段其中內毒素被堿破壞的時間。將殼聚糖和 堿性溶液的混合物保持至少約12小時。已發現，殼聚糖和堿性溶液的混合物保持的時間越 長，得到的堿性殼聚糖的內毒素濃度越低。在混合物已保持約12小時時，已觀察到適合的 低內毒素濃度。本發明方法的另一個優勢是，可保持混合物，而不需要不斷混合殼聚糖與堿 性溶液。
[0031] 在一些實施方案中，混合物可保持至少約13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、 49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72 小時。
[0032] 優選保持混合物至少48小時。
[0033] 在一些實施方案中，混合物可保持至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、 40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、 65、66、67、68、69、70天或更長時間。
[0034] 在一些實施方案中，混合物保持約2至4星期（或14至30天）或更長時間。優 選混合物保持24小時和70天之間，更優選7天和35天之間，最優選14天和21天之間。
[0035] 通過使殼聚糖與0. 1M氫氧化鈉溶液接觸，并保持混合物約12至16天，優選約14 天，已觀察到良好結果。
[0036] 可在室溫和室內壓力保持混合物。室溫和室內壓力是指約20_25°C溫度和約1大 氣壓（atm)壓力。有利的是，所述混合物不需要保持在無菌環境。