專利名稱:新的小球藻的制作方法
本發明是關于一種新的小球藻，特別是通過兩種不同類型的小球藻的原生質體融合得到的一種小球藻。眾所周知，小球藻是單細胞綠藻門的一種，具有光合作用，天然生長在淡水或海水中，也可人工栽培。小球藻細胞富含氨基酸平衡的蛋白，礦物質，維生素，糖類，類脂，色素和酶。因而它具有很高的營養價值。由于它的這些營養和有用的成份，小球藻可用在各種工業領域。小球藻不僅以細胞形式被利用，還以諸如單細胞蛋白(SCP)，類脂(含高聚不飽和脂肪酸，如卄碳五烯酸)和色素(如葉綠素等形式用于制造如健康食品，動物飼料，小魚及輪蟲綱生物肥料，化粧品，印刷及繪畫用墨汁及醫藥等。
總之，本發明是有關一種有廣泛用途的新小球藻。
已有許多種培養小球藻的方法為前人所建議和應用。在一種已知方法中，收集人工培養的小球藻，將其濃縮后消毒，再用諸如高壓均漿，霧化干燥及超聲微粒化等物理或機械方法破碎細胞，然后用水或其他合適溶劑直接萃取細胞的有用成份。然而不利的是，小球藻是一種繁殖率很低的藻類。用天然或人造光線人工培養小球藻需要一個很大的培養池(或缸)，及很長的培養時間。這將提高利用小球藻內含物的成本。
在小球藻培養技術的領域中，采用的共同措施是在天然環境中采用普通的純培養，從中選出單一品系或復合品系，然后再人工培養它。近年來很少采用其他方法。如日本專利公開No 144976/1982指出，發現一些小球藻不同品系，可用于無細胞壁的人工培養。日本專利公開No 47476/1986揭示了特定的培養基質和培養方法。
小球藻minutissima(下面稱C.minutissima)具有兩種類型;海水小球藻和淡水小球藻。海水C.minutissima含卄碳五烯酸(下面稱為“EPA)和其他高碳不飽和脂肪酸，和/或含這些脂肪酸的類脂。EPA是一種魚類脂的成分，最近被證實可防止動脈硬化和溶解血栓。為此人們注意到EPA可用作生產健康食品及制藥。但是迄今為止還沒有培育C.minutissima和其他小球藻試圖用于生產有用物質。
另一方面，當今生物學迅速發展也加速了高等植物和微生物細胞融合的研究。例如作為培育有用微生物生產酶的方法在日本專利公開No.163883/1979中已建議。在1979年農業生物化學43期(5)，1007-1013頁;日本專利公開No.158184/1983敘述了用于發酵生產氨基微生物原生質體融合的方法;在日本專利公開No.120098/1984中敘述了促進植物原生質體融合的方法。然而，至今沒有任何關于藻類，特別是小球藻細胞融合的建議，只是在日本專利公開No 181692/1982中揭示了一種除小球藻細胞壁的方法。
本發明基于以下事實，通過一種特定類型小球藻原生質體間及不同類型小球藻原生質體間的反復融合，可以得到一種新的小球藻，它將具有參于融合各類原生質體的優點。
然而，本發明的主要目的是提供一種新的小球藻，可從它的細胞中有效而經濟地萃取出有用的成分。
本發明另一個目的是提供一種能高產EPA并具有高繁殖率的新小球藻。
本發明這些及其他目的將在下面的敘述中更加清晰。
根據本發明，通過小球藻融合細胞的原生質體與一特定類型小球藻的原生質體間至少一次融合得到一種新小球藻，小球藻融合細胞是通過一種特定類型小球藻的原生質體和一種不同類型小球藻原生質體間融合得到的。
本發明中所用的特定類型小球藻是用于細胞融合的顯示不同性質的兩種類型小球藻之一。這種特定類型小球藻的典型例子是能生產含16到26個碳和3個或3個以上雙鍵的高聚不飽和脂肪酸或含這種脂肪酸的類脂的小球藻。其它例子是能生產二磷酸核酮糖羧化酶(一種在光合作用中固定二氧化碳的酶)或碳酸酐酶(利用太陽能捕捉二氧化碳的酶)的小球藻。這些不同的小球藻中，優先選用的是能生產EPA或由EPA構成的類脂的小球藻。特定類型的小球藻可以是生長在海水中或生長在含海水培養基的品系。術語“含海水的培養基”的意思是該培養基含至少10%(體積比)的海水。該培養基可用蒸餾水稀釋或可含有其它營養成分。不管它是否能完成次生類胡蘿卜素代謝，C.minutissima適于用作特定類型的小球藻。該類型的小球藻可從天然海水收集，也可以諸如縣養魚研究所或養魚中心，大學等公共科研單位得到。用于本發明的特定類型小球藻不局限于上述途徑得到的C.minutissima屬于這種類型的其它品系如野生系，突變系，營養突變系，抗藥系等均可有效地用作C.minutissima。
另一方面，用于本發明的不同類型的小球藻是具有與上述特定類型小球藻不同性質的小球藻，它比特定類型小球藻的繁殖率高，優選的是至少高兩倍的品系。例如一種在淡水培養基生長的品系。這里用的術語“淡水培養基”的意思是這種培養基不含天然海水或海鹽萃取物。可用作這種不同類型小球藻的例子是橢園小球藻(C.ellipsoidea)，如IAM C-27和IAM C-87，及普通小球藻(C.Vulgaris)如IAM C-30和IAM C-169IAM C-27已貯存在東京大學應用微生物研究所，貯存號為No C-27。一種細胞較大的小球藻，如蛋白核小球藻IAM C-28(C.pyrenoidosa)及其可在低溫或高溫下生長的突變系都可用作不同類型的小球藻，不限于上述舉例的不同類型小球藻，屬于例中各類型的其它品系如野生系，突變系，營養系和抗藥系均可用于不同類型的小球藻，其中最優選的是具高繁殖率的品系。
要導致一特定類型與一不同類型的小球藻融合，就要制備這兩種小球藻的原生質體。與其它微生物比較。雖然小球藻具有一個堅硬的細胞壁，但仍可以根據日本專利公開No 181692/1982揭示的除去小球藻細胞壁的方法或在日本專利申請No 264428/1984及45226/1985中本發明者提出的用酶處理小球藻細胞壁的方法來制備原生質體。這些方法中，最好的是在有滲透壓調節劑存在下，用下列一組酶中選出的細胞壁分解酶來處理小球藻細胞壁。這些酶是纖維素酶，半纖維素酶，果膠酶，幾丁質酶，β-葡糖醛酸苷酶和瓊脂水解酶。另一種方法是用浮游生物萃取物來除去細胞壁。
將制備的原生質體進行細胞融合處理，根據本發明，優先選用的是聚合劑融合法，電融合法和脂質體融合法。這些方法都用高pH值下的高滲透壓。通常，這種高滲態是用含鈣離子的可溶性聚合物水溶液得到的，聚合物諸如聚乙二醇，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮;所含鈣離子是來自硫酸鈣和氯化鈣;再通過山梨醇，甘露醇，蔗糖及硫酸鎂調節其滲透壓。聚合劑融合是如下述程序進行的。將一個特定類型小球藻的原生質體和一個不同類型小球藻的原生質體以1∶1的比例混合，通過離心得到這些原生質體的混合物。將該混合物懸在含大于10mM鈣離子的高滲液(pH8～13)，再加入10%到50%的聚乙二醇(PEG 1540，4000，6000等)。將懸液在20到40℃間擱置10分鐘4小時。然后通過如離心等手段除去融合劑和其它不需要的物質，再通過下述的方法再生細胞壁。一個典型的細胞壁再生法包括制備含諸如山梨醇、甘露醇、蔗糖等滲透壓調節劑的小球藻培養液或固體培養基，在培養液或固體培養基中培養小球藻1到2天，則細胞壁得以再生。培養液可以是從海水制備的天然培養液或可以是淡水培養基。也可用包括如下物質的人工培養基氯化物、硝酸鹽、硫酸鹽或其復合物，諸如氯化銨、硫酸銨硝酸銨的氮源;如碳酸氫鈉的碳酸鹽類;諸如乳酸、醋酸、檸檬酸和葡萄糖等碳源;和諸如鉀、鈣、鎂、鐵、硼、鎢、鋅、銅和鉬等金屬元素;加入或沒加各種維生素和氨基酸。為最有效地再生細胞壁，可將培養液或固體培養基置于天然或人工光照下，10到60℃間，優選的溫度為20到45℃，通入空氣，二氧化碳或其混合氣或者不通這些氣體，攪拌或不攪拌。
為得到一個所需的融合細胞，最好結合使用海水和淡水培養基。例如先將融合細胞培養在海水或含海水成分的培養基使細胞壁再生，再將其轉移到淡水培養基上培養幾天以形成細胞群落。再將這些培養的細胞群藻用作細胞融合。
根據本發明，上述的細胞融合至少進行兩次。即本發明的方法包括先根據上述方法將一個特定類型小球藻與不同類型小球藻的原生質體融合，再生細胞壁，培養該融合細胞，再與起始的特定類型小球藻融合。
在實施例中，將培養在含海水培養基中的C.minutissima的原生質體(從Kanagwa縣漁業實驗站得到)與培養在淡水培養基中的橢園小球藻原生質體(IAM C-87)融合。將融合的品系再與培養在含海水培養基中的C.minutissima的原生質體融合(該樣品貯存在美國奧斯丁，得克薩斯州植物學系，藻類培養物貯存中心，Texas 78713-7640 U.S.A)，或培養在淡水培養基中的橢園小球藻(IAM，C-87)，從而得到第二代的融合細胞。也可以重復該步驟得到第三代及更多代后的融合細胞。通過重復融合得到的新小球藻與僅融合一步的小球藻比較顯示了高繁殖率，和EPA的高產率。通過多次融合的方法生產新品系時，如果將海水培養的小球藻與通過海水培養小球藻與淡水小球藻融合的品系再融合，融合品系對高海水濃度培養基的適應性隨著融合重復次數的增加而加強，基于這個原理，建議選擇在逐步增加海水濃度的培養基中培養的融合品系。
表1表示本發明新小球藻的例子，該表中，PCV代表1升小球藻培養液經過10分鐘以3，000轉/分轉速離心得到的小球藻細胞沉降物的體積(ml/l)。表1表示的PCV值是在起始PCV值為1時培養7天后觀察到的，它反映了繁殖率。表1中EPA含量是用常規方法破碎小球藻細胞，然后用一種溶劑萃取油質的含量，再經過諸如GLC化學的分析方法測量脂肪酸組分來測定的。
表1小球藻定性融合例號 小球藻 總脂肪酸中次數 PCVEPA含量1 ATCC 40208 3 11.0 24.02 ATCC 40209 4 10.0 30.0C.minutissima- 4.0 37.0(K)比較例 C.minutissima- 3.5 20.5(N)橢園小球藻 - 12.5 0普通小球藻 - 9.5 0融合細胞的定性(1)形態特征將在含25%(重量比)海水的培養基中，于21℃，5000勒克司下培養7天得到的融合細胞置于光學顯微鏡下測定細胞大小和形狀，所得結果表示于下細胞形狀 細胞大小(μ)ATCC 40208 球形 4～5ATCC 40209 球形 4～6(2)真菌學特征(ⅰ)營養缺陷性
融合細胞號培養基成分ATCC 40208 ATCC 40205NH4Cl + +(NH4)2SO4± -(NH2)2CO + + + +KNO3+ + ++++NaHCO3+++ +++乳酸 + + + +丙酮酸 ++++ ++++醋酸 ++++ ++++順烏頭酸 + +檸檬酸 ± -α-酮戌二酸 + + + +琥珀酸 - +富馬酸 ± ±馬來酸 + + + +丁酸 + + + +丙酸 ± + +注標記 - ± + + + +++ ++++PCV 0 0-2 2-4 4-6 6-8 ＞8PCV為收集的細胞體積，它表示了細胞的生長速度(ⅱ)依賴的pH
融合細胞號ATCC 40208 ATCC 40209pH4 ± ±5 + +6 + + + +7 ++++ ++++8 +++ +++9 + + + +(ⅲ)在培養基中的生長狀況
MC培養基(用于淡水小球藻)融合細胞培養在21℃，5000勒克司下7天(下面的條件相同)。
融合細胞號 ATCC 40208 ATCC 40209生長速度 + + + +
DM培養基(用于淡水小球藻)融合細胞號 ATCC 40208 ATCC 40209生長速度 + + + +
含重量比25%海水的培養基(用于海水小球藻)融合細胞號 ATCC 40208 ATCC 40209生長速度 ++++ ++++通過下面例子將更具體地說明本發明，但它們不限制本發明。
表2表示本發明小球藻培養用培養基的成分。通過氟石白(Calcofluor white)染色法在熒光顯微鏡下觀察細胞壁，證實原生質體生成及細胞壁再生。天然紅試劑試驗也用來檢驗活的原生質體。
表2
＊M溶液Na2EDTA 3.0g/l水H3BO30.6g/l水FeSO4·7H2O 0.2g/l水MnSO4·H2O 0.2g/l水ZnSO4·7H2O 0.033g/l水Co(NH3)2·6H2O 0.0007g/l水CaSO4·5H2O 0.002g/l水土壤萃取物 50ml/l水＊l溶液AH3BO32.9g/l水MnCl2·4H2O 1.81g/l水ZnCl20.11g/l水CuSO4·5H2O 0.08g/l水3(NH4)2O·7MoO3·4H2O 0.018g/l水例1將海水生長的C.minutissima(K)和淡水中生長的橢園小球藻(IAM C-27)培養在人工海水培養基和MC培養基中。再根據日本專利申請No 045226/1985用浮游生物萃取物酶解細胞壁，形成原生質體。用含1∶1比例山梨醇和甘露醇的0.05M磷酸鹽緩沖液(pH6.0)(下面稱其為等滲液)洗原生質體。離心濃縮，再將這兩種原生質體以1∶1比例混合。將含40%聚乙二醇4000，100mM的氯化鈣及0.3M琥珀酸二鈉pH8.5的等滲液加入上述混合物，放置1小時令其融合細胞。用等滲液稀釋其濃度至原來的一半。再放置15分鐘，離心，將上清液除去。然后再稀釋，離心。重復幾次后即得到融合細胞混合物。再將其轉移到含0.6M甘露醇/山梨醇(1∶1)50%人工海水培養基，再生細胞壁。1到2天后觀察再生情況。將部分這種培養物轉移到含1.5%瓊脂的MC培養基，照光下幾天后長成細胞群落。再將其涂布到含1.5%瓊脂的人工海水培養基，培養幾天后，又長出新的群落，然后萃取融合的品系。
得到的第一次融合的品系培養在50%人工海水培養基中，而將C.minutissima(K)培養在100%人工海水培養基中。制備原生質體，用上述方法將其融合，將融合原生質體培養在除去第一個品系的100%人工海水培養基中。將融合的原生質體培養在除去K品系的淡水培養基(MC)，然后收集具高生長速度和EPA含量的第二融合品系。將選擇的第二融合品系與C.minutissima(N)(N.Nagasaki縣漁業研究所得到的品系)分別培養在25%人工海水培養基和100%人工海水培養基，再根據日本專利申請No 264428/1984揭示的方法融合細胞，再將融合的原生質體培養在除去第二融合品系101到108%人工海水培養基(鹽濃度為27-29g/l)，然后再培養在除去N品系的MC瓊脂培養基，從而篩選出ATCC 40208品系。得到各品系的生長速度及EPA含量見表3。
項目融合品系 PCV EPA含量(%)1 10.0 18.32 9.5 16.03 11.0 24.0(ATCC 40208)4 10.5 18.65 9.0 14.06 8.5 22.87 9.0 26.08 9.0 23.59 9.5 19.010 9.5 18.0C.minutissima 3.5 20.5(N)例2分別在25%的人工海水培養基和另一種人工海水培養基培養例1得到的第二個融合品系和C.minutissima(K)，用例1同樣方式形成原生質體。然后用35%聚乙烯吡咯烷酮10000和聚乙二醇3000以1∶1比率的混合物使原生質體融合，再用例1同樣的方式再生細胞壁，然后將融合品系培養在除去第二融合品系的101-108%人工海水培養基(鹽濃度為27-29g/l)，再將其轉到除去K品系的淡水培養基(MC)，從而得到第三代具高生長速度和EPA高含量的融合品系。將該第三代融合品系與C.minutissima(N)分別培養在25%人工海水培養基和100%人工海水培養基，在用例1同樣方式進行細胞融合，再生細胞壁。然后，將融合品系培養在除去第三融合品系的108到116%人工海水培養基(海鹽濃度29到31g/l)，然后轉到除去N品系的淡水培養基，從而選出第四代融合品系ATCC 40209。這第四代品系的生長速率和EPA含量示在表4。
表4項目PCV EPA含量(%)融合品系1 8.5 18.52 9.0 23.03 11.5 22.74 10.0 26.15 10.0 30.0(ATCC 40209)6 5.5 25.07 12.0 20.08 10.5 20.8通過上面敘述，顯然由于一些已知和類型的小球藻一般都顯示較低的繁殖率，所以難于有效地用于工業生產有用物質。這個問題可通過本發明的小球藻來克服。本發明有利于在不能經濟有效地利用的小球藻細胞中，工業生產有用的物質，從而大大改善這些有用物質的產率。
本發明的新小球藻，EPA產率至少是特定類型小球藻的一半，繁殖率至少為特定類型小球藻的一倍。
本發明的新小球藻是通過重復融合產生的，比只融合一次的新小球藻顯示EPA高產率和高繁殖率。此外，雖然第一代的融合品系顯示的EPA產率非常不穩定，但從K品系起經過幾個融合周期得到的新小球藻即使在繼代培養后也沒出現EPA產率的降低。
權利要求
1.制備新小球藻的方法，包括將一個小球藻融合細胞的原生質體和一個特定類型小球藻的原生質體至少融合一次，所述的小球藻融合細胞是通過一個特定類型小球藻與一個不同類型的小球藻融合得到的。
2.根據權利要求
1所述方法，其中所述特定類型小球藻是產生高聚不飽和脂肪酸和/或一種含該脂肪酸類脂的品系。
3.根據權利要求
1所述方法，其中所述高聚不飽和脂肪酸是廿碳五烯酸。
4.根據權利要求
2所述方法，其中所述特定類型的小球藻是在海水培養基或含海水的培養基中培養的品系。
5.根據權利要求
2所述方法，其中所述特定類型的小球藻是C.minutissima。
6.根據權利要求
1所述方法，其中所述不同類型的小球藻具有比前述特定類型小球藻更高的繁殖率。
7.根據權利要求
1所述方法，其中所述不同類型的小球藻是屬于橢園小球藻和普通小球藻的品系。
8.根據權利要求
1所述方法，其中所述不同類型的小球藻是培養在淡水培養基的品系。
9.根據權利要求
1所述方法，其中所述特定類型小球藻是野生型或突變型小球藻。
10.根據權利要求
1所述方法，其中所述小球藻融合細胞是產生高聚不飽和脂肪酸和/或含該脂肪酸類脂的小球藻原生質體和另一種比第一次提到的小球藻繁殖率高的另一種類型小球藻原生質體融合的產物。
11.根據權利要求
1所述方法，其中進行的細胞融合不少于重復兩次。
12.根據權利要求
2所述方法，其中所述新小球藻產生的廿碳五烯酸至少是特定類型小球藻產生量的一半，所述新小球藻的繁殖率至少是特定類型小球藻的一倍。
13.根據權利要求
1所述方法，其中所述新小球藻是Chlorella，sp.ATCC 40208。
14.根據權利要求
1所述的方法，其中所述的新小球藻是Chlorella，sp.ATCC 40209。
專利摘要
本發明提供了能以高密度生產廿碳五烯酸和具有高繁殖率的新小球藻。該小球藻是通過將一種融合的小球藻細胞原生質體與一種產生高聚不飽和脂肪酸的小球藻原生質體至少一次融合得到的，上述融合的小球藻細胞是通過一種產生，高聚不飽和脂肪酸的小球藻和比產生高聚不飽和脂肪酸小球藻繁殖率高的一種小球藻間的融合得到的。
文檔編號C12N15/02GK86105790SQ86105790
公開日1987年2月4日 申請日期1986年7月23日
發明者衰島良一, 山田理, 藤田匡 申請人:日清制油株式會社導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan