專利名稱:阻斷c5a受體的化合物及其在治療中的應用的制作方法
本發明涉及結合C5a受體(C5aR)并阻斷由內源性C5a介導的炎性和免疫調節活性，以治療炎性疾病和疾病狀況的化合物。本發明進一步涉及C5a受體(C5aR)N末端氨基酸序列用于選擇和開發抗C5aR化合物的用途。
我們的先天免疫系統保護身體不被外來侵入者(例如，細菌、病毒、真菌和癌細胞)入侵。此系統最重要的細胞是單核細胞和嗜中性粒細胞。識別后它們攝取并殺死入侵者如細菌、真菌和病毒。由于它們是身體的第一道防線的一部分，因而其最重要的任務是盡可能快地殺死并去除侵入者。這通過極具攻擊性的物質(如自由基和酶)來完成，這些物質不僅對入侵者是致命的，也導致鄰近宿主細胞的損傷。來自這些被損傷的細胞和先天系統本身局部激活的細胞的物質將進一步吸引更多數量的嗜中性粒細胞和單核細胞，引發局部炎癥。一旦所有的入侵者被殺死并去除，同時去除了該進程中被殺死的多種細胞，炎癥將平息。然后，炎癥反應所引發的創傷開始康復。
在一些情況下，這種由嗜中性粒細胞的過度激活而導致的攻擊性破壞性炎癥反應過度強烈，或者甚至在沒有感染性觸發的情況下啟動。在一些情況下，這種炎癥反應是形成嚴重的、有時候致死性紊亂的原因，其包括像成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、血栓活動如心臟病發作和中風后的嚴重組織損傷、炎性腸道疾病和類風濕性關節炎。
補體(C)系統是先天性免疫系統的關鍵成員，在宿主抗病原體中扮演中樞角色。它還是啟動炎癥的強大的驅動器，如果不加調節，能夠導致引發嚴重組織損傷的病理。當細菌已經侵入身體并且，例如感染了中樞神經系統(如在腦膜炎中)時，微生物來源的物質導致補體因子5(C5)轉化酶-復合體的激活，其將補體系統的C5轉化為其活化的C5a形式。C5a是化學引誘劑激活并從血管吸引細胞(遷移過程)的物質。嗜中性粒細胞對這兩種物質起反應，也對白介素-8(IL-8)起反應。
活化的嗜中性粒細胞能夠輕易地從血管遷移。這是因為化學引誘劑、微生物產物和來自活化單核細胞的物質將增加血管的通透性并刺激血管壁的內皮細胞表達某些粘附分子。嗜中性粒細胞表達選擇蛋白和整聯蛋白(例如，CD11b/CD18)，其結合這些粘附分子。一旦嗜中性粒細胞粘附到內皮細胞，其能夠在化學引誘劑/趨化因子的引導下通過細胞遷移到感染部位，此處這些物質的濃度最高。
這些物質還激活嗜中性粒細胞以生產一定范圍的其他分子，其中一些吸引更多的嗜中性粒細胞(接著是單核細胞)，但它們主要負責破壞入侵細菌。一些這樣的物質(例如，自由基、降解蛋白質的酶(蛋白酶)和降解細胞膜的酶(脂肪酶))具有如此的反應性和非特異性，以致來自周圍組織的細胞(和嗜中性粒細胞本身)被破壞，引發組織損傷。此損傷由于源于血液的液體的存在而加劇，所述的流體越過滲漏的血管壁，造成總是伴隨炎癥的腫脹(稱為水腫)。此過多的液體所引發的壓力增大導致更多的細胞損傷和死亡。
在以后的炎癥過程中，單核細胞遷移到現場而激活。除了在去除細菌和細胞碎片中的作用，它們還生產一些物質如腫瘤壞死因子(TNF)和IL-8，其繼而吸引更多活化的嗜中性粒細胞，引發更多的局部損傷。TNF還對嗜中性粒細胞有直接的刺激效應。一旦全部入侵者已被去除，炎癥反應將平息，所述區域的剩余″傷亡″將被清理。然后創傷愈合進程開始。通常，損傷的組織將被主要由成纖維細胞和膠原形成的疤痕組織所取代。當炎癥在身體具有重要功能的區域例如由心肌細胞、腦細胞或肺泡細胞形成的組織中發生時，正常功能將被形成的疤痕所損害，引發嚴重癥狀如心力衰竭、麻痹和肺氣腫。為了最小化這些癥狀的衰弱性后果，盡可能快地“阻抑”所述的炎癥反應是重要的。
干預以控制所述的急性早期炎癥反應為許多具有可歸因于上述事件的癥狀的受試者提供了改善預后的機會。這樣的方法已被提倡用于許多基于急慢性炎癥的疾病，而且相關疾病模型中的研究結果顯示其具有潛力。在功效或安全性方面，經典抗炎藥如甾體類和非甾體類抗炎藥(NSAIDS)不具有所述的理想作用譜。甾體類影響″錯誤的″細胞類型(單核細胞)，并且其阻抑作用很容易被繞開。NSAIDS通常顯示相對溫和的效果，這部分地是由于它們是在炎性進程晚期介入的。兩類藥物都由于其藥理學活性的其他方面而產生一定程度的不良副作用。直接而特異地防止嗜中性粒細胞的遷移和活化的藥物可能具有許多好處。幾種尚處于早期開發中的藥物只干擾嗜中性粒細胞活化(例如C5轉化酶抑制劑、抗C5a的抗體、C5a受體阻斷藥物)和遷移(抗嗜中性粒細胞上的整聯蛋白(象CD11b/CD18)和L-選擇蛋白的抗體以及抗內皮細胞上的粘附分子(像ICAM-1和E-選擇蛋白)的抗體)的一個方面。抗TNF和IL-8的抗體在慢性炎癥中有影響，但在急性炎癥中只有邊緣性的作用，因為單核細胞(其主要負責這些物質的產生)在急性期中起的作用最小。
有時，急性炎癥的成因不能去除，從而炎癥變成慢性的。除肺結核、慢性肝炎和某些其他適應癥之外，在感染中很少出現這樣的情況。然而，慢性炎癥還可以由非細菌的刺激例如自身免疫反應所引起。研究已顯示在慢性炎癥中單核細胞的作用突出得多，嗜中性粒細胞遷移和活化、單核細胞遷移和活化、組織損傷、死亡細胞的去除和創傷愈合都同時發生。細胞與許多不同細胞因子和趨化因子之間相互作用的復雜級聯反應已成為許多年集中研究的課題。人們曾經相信單核細胞及其產物是阻抑慢性炎癥所需要抑制的最重要的成分。這解釋了為什么與單核細胞特異地相互作用的甾體類通常相對于急性炎癥在慢性炎癥中更為有效。然而長期用甾體類治療不是理想的選擇，因為在產生臨床效果所需的劑量下，會產生嚴重的不可接受的副作用。后來使用抗TNF或IL-8抗體的治療顯示了良好效果，而且最初被視為單核細胞在慢性炎癥中起主要作用的證據。但新近的研究對單核細胞在炎癥中獨一無二的作用提出了疑問，并指出嗜中性粒細胞的關鍵性作用，目前看來嗜中性粒細胞代表了治療干預的更好的靶標。
慢性炎性癥狀的潛在病因并不總是清楚的，而且最初的病因可能不會總是導致將來的復發。一些科學家相信在某些慢性炎性疾病中存在事件的連續循環。他們的想法是現有的活化嗜中性粒細胞和單核細胞持續地吸引和活化新的細胞群，這樣，即使最初的刺激已不復存在，炎癥反應也將無限地持續下去。這暗示，使用嗜中性粒細胞和單核細胞活化的有效抑制劑進行急性和周期性治療，可能終止新細胞募集的循環，從而適時地導致病癥進展的改變，或者甚至是完全治愈，而不僅僅是癥狀的減輕。
希望發現可用于炎癥治療的替代性化合物。
一種有希望的候選化合物是具有炎癥抑制特性的新藥物，其發現于生長中的金黃色葡萄球菌(S.aureus)的胞外基質中，命名為來自于金黃色葡萄球菌的趨化性抑制蛋白(CHIPS)，如WO00/02913中所述。在fMLP-和C5a-誘導的嗜中性粒細胞趨化性中，發現CHIPS抑制fMLP-和C5a-誘導的嗜中性粒細胞活化。使用FITC-標記的CHIPS發現，CHIPS以不同的結構域結合C5aR和FPR二者。這些受體屬于趨化因子受體家族，它們都是7次跨膜的異源三聚體G蛋白偶聯受體(GPCR)超家族的成員。嗜中性粒細胞在其表面上包含該受體家族的幾個成員，包括甲酰化肽、C5a、C3a、PAF和LTB4的受體，以及分別識別IL-8和NAP/GRO/ENA的趨化因子受體CXCR1和CXCR2。GPCR具有胞外的N-端部分、三個胞外和三個胞內環和胞內C-端部分。
然而，預期完整分子太大而不能用于治療。此外，發現當給予個體CHIPS時，由于預先存在抗這種細菌毒力因子的抗體而導致免疫復合物的形成。
因此本發明的目的是提供具有炎癥抑制特性的替代性化合物。
本發明基于CHIPS與C5aR相互作用并因此抑制C5a介導的活化作用的研究。由文獻得知C5a在兩個不同的位點識別位點和活化位點結合其受體。認為識別位點位于C5aR N-端殘基21-30片段。然而，存在于C5aR N-端位置10、15、16和18的天冬氨酸對于受體對C5a的結合親和性似乎也是關鍵的。
這些結果使本發明人想到，C5a結合于由氨基酸21-30組成的識別位點，并且通過C5aR N-端殘基10-18與C5aR包外環的分子內接觸穩定如此獲得的構象。該結合和穩定化將C5a置于適當的位置，以通過其C末端活化位點激活所述受體。
發明人使用兩種不同的表達系統，在HEK293細胞中表達完整C5aR和單獨表達C5aR N-端。由此發現CHIPS主要結合到C5aR N-端。
C5aR N-端定點突變研究驚奇地證實，CHIPS-結合位點不位于C5a識別位點(氨基酸21-30)。看起來CHIPS通過C5aR N端殘基10-18區域而防止所述氨基酸10-18與C5aR胞外環的分子內接觸。位置10、15和18的天冬氨酸(D10、D15、和D18)和位置12的甘氨酸(G12)在這里起重要作用。
完整C5aR的N-端定點突變顯示，D18和G12是涉及CHIPS結合的最重要的氨基酸，但至少兩個天冬氨酸突變的組合對于完全抑制CHIPS的結合是必需的。
C5aR的氨基酸38-350不涉及CHIPS的結合。
另外，在核磁共振(NMR)中，使用包含氨基酸7至28的磺酸化C5aR-衍生肽(這里稱為“SO4-C5AR pep7-28”)，其中用C5aR-pep7-28滴定5N-標記的CHIPSΔ30(CHIPS減去前30個氨基酸)，發現了CHIPSΔ30中涉及結合C5aR N端的確切的氨基酸。最明顯涉及的氨基酸是R46、K50、K51、G52、K54、E60、K100、K101、G102、K105、Y108、V109、和Y121，但下列的氨基酸可能也涉及CHIPS與C5aR-N-端的結合T37，L38，R44，L45，N47，Y48，L49，T53，A57，F59，K61，V63，I64，L65，Y71，T73，L76，L80，D83，R84，K85，E88，L89，G91，M93，T96，Y97，E103，I110，N111，和K115。
初步試驗使用了兩個CHIPS突變體，它們含有賴氨酸突變K50、K51+K54和K100、K101+K105，初步試驗確實地顯示這兩個賴氨酸區域都涉及CHIPS與C5aR的結合。
因此，本發明基于CHIPS與C5aR的精確結合位置信息。另外，本發明還提供了有關CHIPS分子內涉及結合C5aR的氨基酸的信息。然后將上述雙重發現用于開發抗-C5aR化合物，所述化合物可以是CHIPS-衍生的化合物或者非CHIPS-衍生的化合物。
因而本發明涉及化合物，該化合物能夠防止人C5aR的N-端殘基10至18與其胞外環的分子內接觸。特別地，本發明涉及化合物，該化合物能夠結合到人C5a受體(C5aR)中的下列殘基位置10、15、和18的天冬氨酸(D10、D15、和D18)和位置12的甘氨酸(G12)。
本發明更特別地涉及如下通式的化合物
Xn-E-X39-K-X7-Y-V-X11-Y-Xm (I)
其中
Xn可以存在或者可以不存在，并且是成蛋白質性氨基酸、非成蛋白質性氨基酸、D-氨基酸、肽模擬物構建單元或其組合的序列段(stretch)；
K是賴氨酸或其非成蛋白質性類似物；
E是谷氨酸或其非成蛋白質性類似物；
Y是酪氨酸或其非成蛋白質性類似物；
V是纈氨酸或其非成蛋白質性類似物；
X39、X7和X11各自分別是39、7或11個成蛋白質性氨基酸、非成蛋白質性氨基酸、D-氨基酸、肽模擬物構建單元或其組合的序列段；
Xm可以存在或者可以不存在，并且是成蛋白質性氨基酸、非成蛋白質性氨基酸、D-氨基酸、肽模擬物構建單元或其組合的序列段；并且具有與天然CHIPS相同的三維構象。
具體而言，本發明涉及如下通式的化合物
Xn-R-X3-K-K-G-X-K-X5-E-X39-K-K-G-X2-K-X2-Y-V-X11-Y-Xm (II)
其中
Xn可以存在或者可以不存在，并且是成蛋白質性氨基酸、非成蛋白質性氨基酸、D-氨基酸、肽模擬物構建單元或其組合的序列段；
R是精氨酸或其非成蛋白質性類似物；
K是賴氨酸或其非成蛋白質性類似物；
E是谷氨酸或其非成蛋白質性類似物；
X、X2、X3、X5、X11和X39各自分別是1、2、3、5、11和39個成蛋白質性氨基酸、非成蛋白質性氨基酸、D-氨基酸、肽模擬物構建單元或其組合的序列段。
Y是酪氨酸或其非成蛋白質性類似物；
V是纈氨酸或其非成蛋白質性類似物；
Xm可以存在或者可以不存在，并且是成蛋白質性氨基酸、非成蛋白質性氨基酸、D-氨基酸、肽模擬物構建單元或其組合的序列段；并且具有與天然CHIPS相同的三維構象。
本發明的特定實施方案中，所述化合物具有通式
Xn-T-X6-R-L-R-N-X2-K-K-G-T-K-X4-F-E-K-X-V-X7-Y-X4-L-X11-E-X11-K-K-G-E-X-K-X2-Y-V-X-N-X3-K-X5-Y-Xm (III)
其中
Xn可以存在或者可以不存在，并且是成蛋白質性氨基酸、非成蛋白質性氨基酸、D-氨基酸、肽模擬物構建單元或其組合的序列段；
T是蘇氨酸或其非成蛋白質性類似物；
R是精氨酸或其非成蛋白質性類似物；
L是亮氨酸或其非成蛋白質性類似物；
N是天冬酰胺或其非成蛋白質性類似物；
X，X2，X3，X4，X5，X6，X7，X11和X16各自分別是1、2、3、4、5、6、7或16個成蛋白質性氨基酸、非成蛋白質性氨基酸、D-氨基酸、肽模擬物構建單元或其組合的序列段；
K是賴氨酸或其非成蛋白質性類似物；
G是甘氨酸或其非成蛋白質性類似物；
F是苯丙氨酸或其非成蛋白質性類似物；
E是谷氨酸或其非成蛋白質性類似物；
Y是酪氨酸或其非成蛋白質性類似物；
V是纈氨酸或其非成蛋白質性類似物；并且有與天然CHIPS相同的三維構象。
在本發明的另一實施方案中，所述化合物具有通式
Xn-T-L-X5-R-L-R-N-Y-L-K-K-G-T-K-X2-A-X-F-E-K-X-V-I-L-X5-Y-X-T-X2-L-X3-L-X2-D-R-K-X2-E-L-X-G-X-M-X2-T-Y-X2-K-K-G-E-X-K-X2-Y-V-I-N-X3-K-X5-Y-Xm (IV)
其中
Xn可以存在或者可以不存在，并且是成蛋白質性氨基酸、非成蛋白質性氨基酸、D-氨基酸、肽模擬物構建單元或其組合的序列段；
T是蘇氨酸或其非成蛋白質性類似物；
R是精氨酸或其非成蛋白質性類似物；
L是亮氨酸或其非成蛋白質性類似物；
I是異亮氨酸或其非成蛋白質性類似物；
M是蛋氨酸或其非成蛋白質性類似物；
A是丙氨酸或其非成蛋白質性類似物；
D是天冬酰胺或其非成蛋白質性類似物；
N是天冬酰胺或其非成蛋白質性類似物；
K是賴氨酸或其非成蛋白質性類似物；
G是甘氨酸或其非成蛋白質性類似物；
F是苯丙氨酸或其非成蛋白質性類似物；
E是谷氨酸或其非成蛋白質性類似物；
Y是酪氨酸或其非成蛋白質性類似物；
V是纈氨酸或其非成蛋白質性類似物；
X、X2、X3和X5，各自分別是1、2、3或5個成蛋白質性氨基酸、非成蛋白質性氨基酸、D-氨基酸、肽模擬物構建單元或其組合的序列段；
并且具有與天然CHIPS相同的三維構象。
在式I中，Xn和Xm可以各自包含0-100個，優選1-90個，更優選-75個，最優選1-59個。
在式II中，Xn和Xm可以各自包含0-100個，優選1-50個，更優選1-25個，最優選1-15個。
在式III和IV中，Xn和Xm可以各自包含0-100個，優選1-50個，更優選1-25個，最優選1-6個。
更具體的實施方案是CHIPSΔ1，CHIPSΔ17，CHIPSΔ30，其缺少天然產生的CHIPS N末端結構域的1、17和30個氨基酸。天然CHIPS不包括于本發明所要求的范圍內。
因此本發明涉及具有骨架的化合物，在所述骨架中，與CHIPS中相同或相似的氨基酸殘基以與CHIPS中相同或相似的構象存在，這允許它們結合于C5aR的10、15和18位天冬氨酸(D10、D15和D18)和12位甘氨酸(G12)。涉及結合的CHIPS的氨基酸殘基的鑒定是生產一系列化合物的基礎，這些化合物可能差異很大，但是有一個共同之處，即所需構象中的結合殘基。在此基礎上，分子建模領域的技術人員通過使用抗體或所謂的結合體(bindingbodies)，通過篩選肽文庫或其他使用這些序列為模板的方法，將能設計出滿足這些要求并因此能用于涉及C5aR的適應癥的治療的化合物。
可以通過多種方式來在本發明的化合物中提供與天然CHIPS構象相同或相似的結合殘基，例如通過以氨基酸、非成蛋白質性類似物、或跨越相同空間距離的其他分子來連接熱點。
或者，可以用從C5aR方面獲得的信息由化合物文庫篩選結合C5aR的化合物。因此本發明提供了鑒定能夠結合C5aR的化合物的方法，包括
a)提供候選化合物文庫，
b)將文庫成員與C5aR相關化合物接觸，該C5aR相關化合物包含基序Xq-D-X-G-X2-D-X2-D-Xr，其中Xq、X、X2和Xr分別是0-9、1、2和0-20個成蛋白質性氨基酸或其非成蛋白質性類似物的序列段，D是天冬氨酸，G是甘氨酸，其以與天然C5aR中發現的相同或相似的構象存在，
c)鑒定結合C5aR相關化合物的文庫成員，C5aR相關化合物可以是C5aR本身或至少包含目前發現涉及結合天然構象形式的CHIPS的殘基。
以上方法可以進一步包括提供如此鑒定的成員，以用于預防或治療的步驟。本發明還涉及這樣鑒定的化合物和其用途。
適合地，具有CHIPS中發現的C5aR結合殘基的化合物為肽或多肽。然而，所有的這些肽可以作為起點進行進一步修飾，例如用其他構建單元取代一個或多個氨基酸。
具有結合C5aR能力的肽可以通過已知的化學合成方法制備。通過合成方法構建肽的方法是本領域技術人員已知的。這些合成的肽由于與涉及結合C5aR的CHIPS的序列段有共同的一級，二級和/或三級結構和/或構象特征，將擁有與之相同的活性，指結合C5aR的性質。因此，這樣合成生產的肽，可以作為生物學活性上或免疫上的替代物來替代具有所需的C5aR結合能力并由成蛋白質性氨基酸組成的(多)肽。
這里提供的化合物還包括以氨基酸序列為特征的化合物，在所述氨基酸序列中天然地提供了或者有意地引入了修飾。肽的修飾可由本領域技術人員使用已知的常規技術完成。化合物序列中感興趣的修飾包括置換、插入或缺失編碼序列中所選擇的氨基酸殘基。
在一些實例中，肽在藥物中使用的潛能可能由于幾種原因而受到限制。例如肽可能過于親水而不能穿過像細胞膜和血腦屏障之類的膜，可能通過腎臟和肝臟迅速地從體內排出，從而導致低的生物利用度。另外，由于可能被蛋白酶迅速降解，例如在胃腸道中，肽的生物穩定性和化學穩定性可能較差。同樣，肽通常是可呈現為數千種構象的柔性化合物。生物活性構象通常只是這些可能性中的一種，其有時可能會導致對靶受體例如C5aR的低選擇性和親和性。最后，肽的效力可能不足以用于治療目的。
由于上述缺陷，肽有時主要用作設計其他藥物的來源，而本身不作為實際藥物。在這種情況下，需要開發減少了這些缺陷的化合物。肽的替代物為所謂的肽模擬物。以本發明的化合物為基礎的肽模擬物也是本申請的一部分。在那種情況下，一個或多個氨基酸被肽模擬物構建單元所取代。
文獻中描述了肽模擬物的多種定義。其中，將肽模擬物描述為“設計用于將肽中包含的信息轉變為小型非肽結構的化學結構”，“模擬肽的生物學活性但不包含任何肽鍵的分子”，“在與受體和酶相互作用中作為肽的合適替代物的結構”以及“化學特洛伊木馬”。
總體上，肽模擬物可分為兩類。第一類由具有非肽樣結構的化合物組成，通常是其上附著了藥效基團的支架。因此，它們是低分子量化合物，并且與天然肽無結構相似性，因此對蛋白水解酶的穩定性更高。
第二類主要的肽模擬物由具有與肽相似的模塊構造的化合物即寡聚肽模擬物組成。這些化合物可通過肽側鏈或肽骨架的修飾而獲得。后一類肽模擬物可認為是通過用其他部分替換肽的酰胺鍵而由肽衍生的。因此，預期這些化合物對于蛋白酶降解更加不敏感。酰胺鍵的修飾也影響其他特征，例如親脂性，氫鍵容量，構象柔性，這在有利的實例中可能導致化合物的藥理學和/或制藥學特性全面改善。
寡聚肽模擬物原則上可從單體構建單元起始，在反應步驟的重復循環中制備。因此，這些化合物可能適合于自動合成，類似于已經完善的在肽合成儀中制備肽的方法。單體構建單元的另一種應用在于制備肽/肽模擬物雜交體組合天然氨基酸和肽模擬物構建單元來生成只有一些酰胺鍵被替代的產物。這可使化合物與天然肽的差異足夠大，以獲得增強的生物穩定性，但仍具有與原始結構足夠的相似性，以保留生物活性。
用于本發明的合適的肽模擬物構建單元是酰胺鍵替代物(surrogates)，例如寡聚-β-肽(Juaristi，E.Enantioselective Synthesis of b-Amino Acids；Wiley-VCHNew YorK，1996)，插烯肽(vinylogous peptides)(Hagihari，M.等，J.Am.Chem.Soc.1992，114，10672-10674)，擬肽(peptoids)(Simon，R.J.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1992，89，9367-9371；Zuckermann，R.N.等，J.Med.Chem.1994，37，2678-2685；Kruijtzer，J.A.W.&Liskamp，R.M.J.TetrahedronLett.1995，36，6969-6972)；Kruijtzer，J.A.W.Thesis；Utrecht University，1996；Kruijtzer，J.A.W.等，Chem.Eur.J.1998，4，1570-1580)，寡砜(oligosulfones)(Sommerfield，I.&Seebach，D.Angew.Chem.，Int.Ed.Eng.1995，34，553-554)，磷酸二酯(Lin，P.S.；Ganesan，A.Bioorg.Med.Chem.Lett.1998，8，511-514)，寡聚磺酰胺(Moree，W.J.等，Tetrahedron Lett.1991，32，409-412；Moree，W.J.等，Tetrahedron Lett.1992，33，6389-6392；Moree，W.J.等，Tetrahedron 1993，49，1133-1150；Moree，W.J.Thesis；Leiden University，1994；Moree，W.J.等，J.Org.Chem.1995，60，5157-5169；de Bont，D.B.A.等，Bioorg.Med.Chem.Lett.1996，6，3035-3040；de Bont，D.B.A.等，Bioorg.Med.Chem.1996，4，667-672；Lwik，D.W.P.M.Thesis；Utrecht University，1998)，擬肽磺酰胺(van Ameijde，J.&Liskamp，R.M.J.Tetrahedron Lett.2000，41，1103-1106)，插烯磺酰胺(vinylogous sulfonamides)(Gennari，C.等，Eur.J.Org.Chem.1998，2437-2449)，azatides(或肼基肽)(Han，H.&Janda，K.D.J.Am.Chem.Soc.1996，118，2539-2544)，寡聚氨基甲酸酯(Paikoff，S.J.等，Tetrahedron Lett.1996，37，5653-5656；Cho，C.Y.等，Science 1993，261，1303-1305)，脲擬肽(ureapepoids)(Kruijtzer，J.A.W.等，Tetrahedron Lett.1997，38，5335-5338；Wilson，M.E.&Nowick，J.S.Tetrahedron Lett.1998，39，6613-6616)和oligopyrrolinones(Smith III，A.B.等，J.Am.Chem.Soc.1992，114，10672-10674)。
已經開發了插烯肽和oligopyrrolinones，用于形成類似于肽的那些二級結構(β-鏈構象)，或模擬肽的二級結構。預期所有這些寡聚肽模擬物都是抗蛋白酶的，可以在高產率偶聯反應中從光學活性單體(除了擬肽)裝配。
肽磺酰胺由包含一個或多個磺酰胺過渡態等排物的α-或β-取代氨基乙烷磺酰胺組成，所述磺酰胺過渡態等排物為酰胺鍵的水解類似物。已發現包含酰胺鍵水解的過渡態類似物的肽類似物在蛋白酶抑制劑如HIV-蛋白酶抑制劑開發中的廣泛用途。
另一種開發寡聚肽模擬物的方法是，通過用不可水解的替代物如氨基甲酸酯、砜、脲和磺胺基團替換所有的酰胺鍵，從而完全修飾肽的骨架。這樣的寡聚肽模擬物可能具有增強的代謝穩定性。最近，已設計出以酰胺為基礎的替代性寡聚肽模擬物，即N-取代的甘氨酸寡肽，所謂的擬肽。擬肽的特點是氨基酸側鏈存在于酰胺氮上，而不象肽中那樣存在于α-C原子上，這導致代謝穩定性增強，同時消除骨架的手性。手性α-C原子的缺失可認為是優點，因為對于擬肽來說不再存在肽中存在的空間限制。另外，擬肽中側鏈與羰基之間的空間與肽中相同。盡管肽與擬肽不同，但已表明它們產生生物活性化合物。
將肽鏈翻譯成擬肽肽模擬物可能產生擬肽(直接翻譯)或反擬肽(retropeptoid)(反序列)。在后一類中保持了羰基對側鏈的相對方向，因此與親本肽更為相似。
此處將有關肽模擬物的綜述性文章引入作為參考Adang，A.E.P.等；Recl.Tav.Chim.Pays-Bas 1994，113，63-78；Giannis，A.&Kolter，T.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1993，32，1244-1267；Moos，W.H.等，Annu.Rep.Med.Chem.1993，28，315-324；Gallop，M.A.等，J.Med.Chem.1994，37，1233-1251；Olson，G.L.等，J.Med.Chem.1993，36，3039-30304；Liskamp，R.M.J.Recl.Tav.Chim.Pays-Bas 1994，113，1-19；Liskamp，R.M.J.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1994，33，305-307；Gante，J.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1994，33，1699-1720；Gordon，E.M.等，Med.Chem.1994，37，1385-1401；和Liskamp，R.M.J.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1994，33，633-636。
因此，本發明還涉及這樣的化合物，它們本身不是肽或多肽，但具有與本發明的化合物相似的結構和功能。這種分子的例子有上述的肽模擬物，還有其中一個或多個成蛋白質性氨基酸被非成蛋白質性氨基酸或D-氨基酸所取代的化合物。當本申請中涉及化合物時，還將包括這樣的其他化合物，這些化合物具有與原始肽化合物相似或相同的結構和功能，因此也就具有相似或相同的生物學活性。
更具體而言，可用于取代的非成蛋白質性氨基酸選自下列2-萘基丙氨酸(Nal(2))、β-環己基丙氨酸(Cha)、對-氨基-苯丙氨酸((Phe(p-NH2)、對-苯甲酰基苯丙氨酸(Bpa)、鳥氨酸(Orn)、正亮氨酸(Nle)、4-氟-苯丙氨酸(Phe(p-F))、4-氯-苯丙氨酸(Phe(p-Cl))、4-溴-苯丙氨酸(Phe(p-Br))、4-碘-苯丙氨酸(Phe(p-I))、4-甲基-苯丙氨酸(Phe(p-Me))、4-甲氧基-苯丙氨酸(Tyr(Me))、4-硝基-苯丙氨酸(Phe(p-NO2))。
在本發明的化合物中取代成蛋白質性氨基酸的合適的D-氨基酸為例如選自下列D-苯丙氨酸、D-丙氨酸、D-精氨酸、D-天冬酰胺、D-天冬氨酸、D-半胱氨酸、D-谷氨酸、D-谷氨酰胺、D-組氨酸、D-異亮氨酸、D-亮氨酸、D-賴氨酸、D-蛋氨酸、D-脯氨酸、D-絲氨酸、D-蘇氨酸、D-色氨酸、D-酪氨酸、D-纈氨酸、D-2-萘基丙氨酸(D-Nal(2))、β-環己基-D-丙氨酸(D-Cha)、4-氨基-D-苯丙氨酸(DPhe(p-NH2))、對-苯甲酰基-D-苯丙氨酸(D-Bpa)、D-鳥氨酸(D-Orn)、D-正亮氨酸(D-Nle)、4-氟-D-苯丙氨酸(D-Phe(p-F))、4-氯-D-苯丙氨酸(D-Phe(p-Cl))、4-溴-D-苯丙氨酸(D-Phe(p-Br))、4-碘-D-苯丙氨酸(D-Phe(p-I))、4-甲基-D-苯丙氨酸(D-Phe(p-Me))、4-甲氧基-D-苯丙氨酸(D-TYr(Me))、4-硝基-D-苯丙氨酸(D-Phe(p-NO2))。
本發明化合物中的一個或多個成蛋白質性氨基酸可由例如選自下列的擬肽構建單元所取代N-取代的甘氨酸，如N-芐基甘氨酸(NPhe)、N-甲基甘氨酸(NAla)、N-(3-胍基丙基)甘氨酸(NArg)、N-(羧甲基)甘氨酸(NAsp)、N-(氨基甲酰基甲基)甘氨酸(NAsn)、N-(硫代乙基)-甘氨酸(NhCys)、N-(2-羧乙基)甘氨酸(NGlu)、N-(2-氨基甲酰基乙基)甘氨酸(NGln)、N-(咪唑基乙基)甘氨酸(NhHis)、N-(1-甲基丙基)甘氨酸(NIle)、N-(2-甲基丙基)甘氨酸(NLeu)、N-(4-氨基丁基)甘氨酸(NLys)、N-(2-甲基硫代乙基)甘氨酸(NMet)、N-(羥乙基)甘氨酸(NhSer)、N-(2-羥丙基)甘氨酸(NhThr)、N-(3-吲哚甲基)甘氨酸(NTrp)、N-(對羥基苯甲基)-甘氨酸(NTyr)、N-(1-甲基乙基)甘氨酸(NVal)。
本發明的所有化合物也可以是環狀的。環狀化合物可以具有改善的效力、穩定性、剛性和/或其他制藥學和/或藥理學特征。
另一方面，本發明涉及抗C5aR或C5aR相關化合物的抗體或其衍生物，該C5aR相關化合物包含基序Xq-D-X-G-X2-D-X2-D-Xr，其中Xq、X、X2和Xr是0-9、1、2和0-20個的序列段。這里所用的衍生物是眾所周知的具有抗體的特異性但不是完整抗體的化合物。衍生物的例子是本領域熟知的，包括scFv、Fab片段、嵌合抗體、雙功能抗體及其他。
本發明化合物的功能活性可通過多種方法測定。可通過用流式細胞儀測定化合物防止熒光-C5a(如FITC-C5a)結合嗜中性粒細胞的能力而測定化合物的C5aR結合活性。
也可通過趨化性試驗如轉孔系統(Transwell system)測定化合物防止嗜中性粒細胞向C5a遷移的能力而測定化合物的活性。另外，基于趨化因子包括C5a啟動細胞內鈣濃度迅速瞬時提高的能力的試驗，可用于篩選本發明化合物的生物學活性。或者，基于趨化因子包括C5a啟動例如彈性蛋白酶的分泌的能力的試驗，可用于篩選本發明的化合物的生物學活性，其中彈性蛋白酶由細胞松弛素B刺激的嗜中性粒細胞分泌。可使用本領域已知的多種其他試驗，包括但不限于多種鈣特異性熒光探針與流式細胞儀或熒光測定法、或微量生理測定組合。作為用于以任何方法篩選生物學活性的細胞，例如可以使用新分離的嗜中性粒細胞或用C5aR、野生型或突變形式的該受體轉染的細胞。
本發明的化合物可用于預防或治療涉及嗜中性粒細胞、單核細胞和內皮細胞上的C5a受體(C5aR)的適應癥。這類適應癥可涉及急性或慢性炎癥反應，可選自表4所列出的組。表4并不意味著限制本發明化合物的可能用途。化合物在未來的適應癥中的用途也是本發明的一部分。
本發明進一步涉及所述化合物在預防或治療涉及除嗜中性粒細胞、單核細胞和內皮細胞以外的其他細胞上的C5aR的適應癥。其他細胞可以是淋巴細胞、樹突狀細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、巨噬細胞、小膠質細胞、星形膠質細胞、Kupfer細胞、肝細胞和上皮細胞。
本發明的化合物也可用于針對由產CHIPS細菌如金黃色葡萄球菌引起的感染的預防性或治療性疫苗中。
本發明的化合物也可用于制備涂覆組合物，用于通過皮膚介入人體的或在手術過程中置于體內的醫學裝置表面上。該表面可以是導管尖端的表面。適合地，所述組合物為緩釋組合物。
本發明涉及化合物本身以及如上所述的化合物的多種用途。另外，本發明提供治療性和預防性組合物，包含合適的賦形劑和一種或多種所要求的化合物。
根據另一方面，本發明涉及預防或治療受試者的方法，所述受試者患有涉及嗜中性粒細胞、單核細胞和內皮細胞上的C5aR的適應癥，該方法包括給藥預防或治療有效量的一種或多種所要求的化合物。所要治療的適應癥與上述相同。
在其另一實施方案中，本發明涉及預防或治療受試者的方法，所述受試者患有涉及除嗜中性粒細胞、單核細胞和內皮細胞以外的其他細胞上的C5aR的適應癥，所述方法包括給藥預防或治療有效量的一種或多種所要求的化合物。所述的其他細胞為淋巴細胞、樹突狀細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、巨噬細胞、小膠質細胞、星形膠質細胞、Kupfer細胞、肝細胞和上皮細胞。
本發明的對受試者進行抗產CHIPS細菌感染的預防或治療性處理的方法，該方法包括施用預防或治療有效量的一種或多種所要求的化合物。
標準遺傳密碼編碼20種氨基酸，這些氨基酸被稱為成蛋白質性(proteinogenic)(構成蛋白質)的。在自然界中已發現500種以上的其他氨基酸。這些其他的氨基酸此處稱為“非成蛋白質性氨基酸”。
蛋白中的所有氨基酸呈現出與L-甘油醛相同的絕對空間構型。因此，它們都是L-氨基酸。D-氨基酸從未在蛋白中發現，盡管它們存在于自然界中。此處將其稱為“D-氨基酸”。
肽模擬物(peptidomimetic)是包括非肽結構成分、能模仿或拮抗天然親本肽的生物學作用的化合物。肽模擬物不再有經典的肽特征如肽鍵。肽模擬物的組成部分此處稱為“肽模擬物構建單元”(peptidomimetic building blocks)。
所有特定氨基酸的非蛋白質變異體此處稱為“其非成蛋白質性類似物”。
將進一步在下述實施例中闡述本發明，這些實施例不意味著以任何方式限制本發明。實施例中參考下述附圖
圖1顯示CHIPS-FITC與C5aR N末端的結合，C5aR N末端包括不同的點突變和缺失，用pDISPLAY載體表達于HEK-293細胞上。
圖2A顯示CHIPS-FITC與完整C5aR的結合，C5aR其N末端包含不同的點突變和缺失，用pcDNA3.1載體表達于HEK-293細胞上。
圖2B顯示CHIPS-FITC與完整C5aR和C5aR嵌合體的結合，其中N末端和胞外環由其他G蛋白偶聯受體的相應區域所交換。在大多數嵌合體中也構建了額外的D10A突變。所有受體均使用pcDNA3.1載體表達于HEK-293細胞上。
圖3顯示包含7-28位氨基酸的SO4-C5aR-N末端肽對CHIPS-FITC結合野生型C5aR的抑制，該野生型C5aR表達于U937細胞上。
圖4顯示人嗜中性粒細胞中WT-CHIPS和CHIPS31-121抑制C5a誘導的鈣動員的能力。
圖5A+B顯示CHIPS31-121和CHIPS31-121的所示突變體對抗C5aR單克隆抗體結合C5aR的抑制，其中C5aR表達于U937細胞上。
表1顯示所有涉及結合野生型CHIPS(WT-CHIPS)的C5aR的氨基酸，其通過測試所有C5aR突變體和C5aR嵌合體的WT-CHIPS結合而獲得，如圖1和2中所描述的。
表2顯示所有涉及或可能涉及CHIPS31-121與C5aR結合的CHIPS31-121的氨基酸，其通過在15N-1H-HSQC NMR試驗中用SO4-C5AR pep7-28滴定15N-標記的CHIPS31-121而獲得。
表3顯示不同CHIPS31-121突變體的IC50值，其中單個的氨基酸取代為丙氨酸(除非另有說明)。用圖6A+B所示試驗完成IC50的測定。
表4列出了由炎癥反應引發的疾病和疾病狀況，其涉及補體活化和/或嗜中性粒細胞和/或單核細胞。對本發明多肽治療這些疾病的治療有效性的支持可在以下參考文獻中所發現
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實施例
實施例1
C5aR中CHIPS結合位點的鑒定
材料與方法
1.1完整C5aR和C5aR N-端的克隆
用引物PCR擴增編碼人全長C5aR的DNA序列，所述引物的序列經修飾，在C5aR開放閱讀框(ORF)的第一個蛋氨酸(起始密碼子)的下游引入了N末端FLAG表位標簽(DYKDDDDK)，以及允許在表達質粒pcDNA3.1(Invitrogen，Paisley，UK)中克隆帶FLAG標簽的C5aR序列的限制性位點(EcoRI和XbaI)。所述片段以合適的方向插入，使得可以由CMV啟動子表達帶FLAG標簽的C5aR。通過序列分析確認克隆的FLAG-標記的C5aR序列。FLAG-標簽使得可以用單克隆抗體(mAb)M2(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA)檢測C5aR。
用引物通過PCR克隆編碼人C5aR的前38個氨基酸(相當于C5aR N末端)的DNA序列，所述引物序列被修飾以引入限制性位點(AccI和BglII)，從而可以在表達質粒pDISPLAY(Invitrogen，Paisley，UK)中克隆C5aR N末端序列。所述片段以合適的方向插入，使得可以由CMV啟動子表達C5aR N末端。存在于C5aR N末端序列上游的鼠Igκ鏈V-J2-C信號肽序列使C5aR N末端蛋白得以被定向引導至真核細胞的分泌途徑。存在于C5aR N-端序列下游的PDGF受體的跨膜結構域將C5aR N-端蛋白錨定于真核細胞的質膜以進行展示。存在于C5aR N末端序列上游和信號肽下游的血凝素A表位標簽使得可以用mAb 12CA5(Roche，Molecular Biochemicals，Mannheim，Germany)檢測pDISPLAY C5aR N-末端蛋白。通過序列分析確認克隆的C5aR N末端序列。
1.2 CHIPS制備
用Thermal Ace DNA聚合酶(Invitrogen，Paisley，UK)PCR擴增編碼WT-CHIPS(CHIPS 1-121)的金黃色葡萄球菌的染色體DNA，所用引物為
CHIPS 1-121的5’TTTACTTTTGAACCGTTTCCTAC與
3’CGTCCTGAATTCTTAGTATGCATATTCATTAG(加下劃線的序列代表EcoRI位點)的組合。用金黃色葡萄球菌Newman的染色體DNA作為模板進行擴增反應，所述模板是用高純度PCR模板制備試劑盒(Roche MolecularBiochemicals，Mannheim，Germany)分離的。提供N-端組氨酸標簽的pRSET表達載體(Invitrogen)用BamHI消化并用S1核酸酶(Roche Diagnostics；100U/ml，30min 37℃)處理，以準確地在編碼腸激酶裂解位點的DNA序列之后提供平端載體。
隨后，用EcoRI消化載體，并與EcoRI-消化的PCR產物連接。在TOP10F’大腸桿菌(E.Coli)中增殖質粒。為了表達，轉化了BL21(DE3)E.Coli，1個克隆在含有50μg/ml羧芐青霉素(Sigma)的2ml LB中生長一整天，隨后過夜(1∶1000)。第二天早上，沉淀細胞并重懸于含50μg/ml羧芐青霉素的新鮮LB中，獲得0.1的OD660。培養物生長至OD660為0.8，用1mM IPTG 37℃誘導2.5小時。然后，沉淀細胞并重懸于含500mM NaCl，pH7.8的20mM磷酸鈉緩沖液中，-20℃保存直至使用。
為分離CHIPS1-121或CHIPS31-121，用100μg/ml卵清溶菌酶(Sigma)在冰上處理細胞15分鐘。為進一步裂解細胞，超聲處理細菌，在液氮中冷凍并在37℃水浴中解凍，總共四個循環。
之后，在冰上加入RNase和DNase(5μg/ml)，作用30分鐘。隨后，將溶解產物于3000g 4℃下離心30分鐘，以0.45μm過濾器過濾，用冰冷的pH7.8磷酸鹽緩沖液1∶1稀釋，并以0.2ml/min的流速通過帶電荷的鎳柱(Invitrogen)。分別用pH7.8、pH6.0、和pH5.3的磷酸鹽緩沖液沖洗柱子。用PBS/50mMEDTA洗脫柱子。室溫下用腸激酶(1U/ml蛋白)裂解4小時以去除組氨酸標簽。
1.3用FITC標記純化的CHIPS蛋白
室溫下將純化的CHIPS(500μg/ml蛋白)和1/10體積的1mg/ml FITC(異硫氰酸熒光素，Fluorescein Isothiocyanate，異構體I；Sigma)一起在pH9.6的1M碳酸鈉緩沖液中溫育1小時。使混合物通過脫鹽柱(Pharmacia，Fast DesaltingHR 10/10)，將FITC-標記的CHIPS與游離的FITC分離，由在線偶聯熒光儀(on-line coupled fluorometer)(Perkin Elmer)監測洗出液的OD280和熒光。合并具有高OD280和熒光的級分，用Micro BCA蛋白測定(Pierce)分析蛋白含量。將CHIPS-FITC在-20℃以小等份保存。
1.4 C5aR與C5aR N-端的表達
在HEK293細胞中通過轉染包含C5aR的ORF的pcDNA3.1質粒來表達完整C5aR。因此，根據生產商的說明(Invitrogen)，在6孔平板中用lipofectamine2000(5μl)以1μgDNA轉染HEK293細胞，所述HEK293細胞保持在含有0.1mM非必需氨基酸、1mM丙酮酸鈉、10μg/ml慶大霉素和10％FCS的MEM(Gibco Invitrogen Corporation)中。
轉染2至3天后，用PBS/胰蛋白酶收集細胞，用RPMI/0.05％人血清白蛋白(HSA；CLB，Amsterdam，The Neterlands)洗滌，與10μg/ml抗-FLAG M2mAb和3μg/ml FITC-標記的CHIPS一起培養，隨后與2μ/ml APC標記的羊抗小鼠Igs(PharMingen，San Diego，CA，USA)一起培養。在添加碘化丙啶(propidium jodide)后，洗滌細胞并在流式細胞儀上檢測CHIPS-FITC與表達C5aR N-端蛋白(APC-陽性)且為碘化丙啶陰性(活的)細胞的結合。
為了表達C5aR N-端，如上述在HEK293細胞中轉染包含C5aR N-端序列的pDISPLAY質粒，不同的是當檢測CHIPS-FITC的結合時，所述細胞與5μg/ml抗-HA標簽12CA5mAb而不是抗-FLAG M2 mAb一起培養。
1.5 C5aR-或C5aRN-末端-突變體和C5aR嵌合體的克隆與表達
通過重疊延伸PCR(Ho SN等，1989，Gene 77；51)在C5aR和/或C5aR N末端上進行定點誘變。誘變在C5aR N末端從氨基酸脯氨酸9(命名為P9)直到天冬氨酸21(命名為D21)的所有氨基酸上進行。表1描述了C5aRN末端的全部氨基酸序列。所有的氨基酸都突變為丙氨酸(A；命名為P9A、D10A等)，作為單突變或突變組合。只有酪氨酸(Y)11和14變為苯丙氨酸(F；命名為Y11F等.)而不是丙氨酸。其他的突變體是缺失N末端8、13、或18位氨基酸，命名為del-8、del-13、del-18。還通過重疊延伸PCR構建了下述的C5aR嵌合體
*N-C3aR+C5aRC5aR的N-末端(對應于C5aR的氨基酸1-37)替換為C3aR的N-末端(對應于C3aR的氨基酸1-23)。
*N-C5aR+C3aRC3aR的N-末端(對應于C3aR的氨基酸1-23)替換為C5aR的N-末端(對應于C5aR的氨基酸1-37)。
*C5aR-lp1(IL8R)C5aR胞外環1(對應于C5aR的氨基酸90-117)替換為IL8R的胞外環1(對應于IL8R的氨基酸93-118)。
*C5aR-lp2(IL8R)C5aR胞外環2(對應于C5aR的氨基酸172-211)替換為IL8R的胞外環2(對應于IL8R的氨基酸172-211)。
*C5aR-lp3(C3aR)C5aR胞外環3(對應于C5aR的氨基酸265-280)替換為C3aR的胞外環3(對應于C3aR的氨基酸400-415)。
在上述所有的C5aR嵌合體中，除N-C3aR+C5aR外，還構建了額外的D10A突變。如1.1所述將突變的完整C5aR和C5aR嵌合體的PCR片段克隆到pcDNA3.1質粒中。如1.1中所述將突變的C5aR N-末端的PCR片段克隆到pDISPLAY質粒中。
結果
圖1顯示CHIPS-FITC與C5aR N末端的結合，C5aR N末端包含不同的點突變和缺失，用pDISPLAY載體表達于HEK-293細胞上。由此可見，通過位置15和18的突變和1-13位以及更多氨基酸的刪除使結合幾乎完全消除。
圖2A顯示CHIPS-FITC與完整C5aR的結合，在C5aR的N末端包含不同的點突變和刪除，其用pcDNA3.1載體表達于HEK-293細胞上。由此可見第10、15和18位3個天冬氨酸的突變最顯著地減少了CHIPS-FITC與完整C5aR的結合。
圖2B顯示CHIPS-FITC與完整C5aR和C5aR嵌合體的結合，其中N末端和胞外環替換為其他G蛋白偶聯受體的相應區域。在大部分嵌合體中也構建了額外的D10A突變。所有的受體都用pcDNA3.1載體表達于HEK-293細胞上。圖2B顯示沒有一個C5aR的胞外環涉及與CHIPS的結合。因而，CHIPS只結合C5aRN-末端。
表1顯示所有涉及結合WT-CHIPS的C5aR的氨基酸，其通過測試所有C5aR突變體和C5aR嵌合體的WT-CHIPS結合而獲得，如圖1和2中所描述。發現位置10、15和18的天冬氨酸和位置12的甘氨酸涉及此結合。未發現氨基酸38-350與結合有關。
實施例2
磺化的C5aR N-末端肽7-28對CHIPS-FITC結合C5aR的影響
材料與方法
SO4-C5aR pep7-28對CHIPS-FITC結合C5aR的影響
4℃下，將CHIPS-FITC(0至1μg/ml)與200μM的SO4-C5aR pep7-28一起預培養30分鐘。然后，加入表達野生型C5aR的U937細胞(5×106個細胞/ml)，4℃下再培養30分鐘。隨后，在流式細胞儀上分析CHIPS-FITC與U937細胞的結合。
結果
圖3顯示SO4-C5aR pep 7-28對CHIPS-FITC結合野生型C5aR的抑制，該野生型C5aR表達于U937細胞上。由這些結果可以推斷只有一部分合成為硫酸化肽(該肽中存在的兩個酪氨酸都是硫酸化的，天然C5aR中同樣如此)的C5aRN-末端(氨基酸7至28)能結合CHIPS，并防止其結合表達于U937細胞上的C5aR。
實施例3
WT-CHIPS(CHIPS1-121)和CHIPS31-121的C5a抑制活性的比較
材料與方法
3.1 CHIPS31-121的表達與純化
如1.2節CHIPS的制備中所述克隆、表達和純化CHIPS31-121，使用引物
5’AATAGTGGTCTTCCTACAAC和
3’CGTCCTGAATTCTTAGTATGCATATTCATTAG(加下劃線的序列代表EcoRI位點)。
3.2嗜中性粒細胞中的細胞內鈣動員
為了測定WT-CHIPS(CHIPS1-121)和CHIPS31-121對C5a誘導的細胞內鈣動員的影響，室溫并持續攪拌的情況下，向嗜中性粒細胞加載RPMI/0.05％HAS中的2μM的Fluo-3AM，用緩沖液洗滌兩次，在RPMI/0.05％HAS中懸浮至1×106個細胞/ml。隨后，室溫下，在有或沒有30nM WT-CHIPS或CHIPS31-121的情況下預培養細胞15分鐘。每個細胞樣品首先測定約10秒鐘以確定基礎熒光水平。接下來，加入濃縮的C5a(所用C5a的濃度范圍10-12M至10-7M)，并迅速放回樣品容器中繼續測定。在FACScan或Calibur流式細胞儀上以前向散射和側向散射設門分析細胞，以排除死亡細胞和碎片。
結果
圖4顯示WT-CHIPS和CHIPS31-121抑制C5a誘導的人嗜中性粒細胞中鈣動員的能力。由此可見，CHIPS31-121在抑制C5a-誘導的鈣動員方面與WT-CHIPS同樣有效或者更加有效。因此，對于C5a-抑制能力而言，WT-CHIPS的前30個氨基酸并不重要。
實施例4
涉及CHIPS與C5aR結合的CHIPS31-121的氨基酸
材料與方法
4.1 15N-和13C/15N-均一標記的CHIPS31-121的制備
如1.2節CHIPS制備中所述克隆并表達15N-標記的和13C/15N-標記的CHIPS31-121(CHIPS，缺少前30個氨基酸)，使用引物
5’AATAGTGGTCTTCCTACAAC和
3’CGTCCTGAATTCTTAGTATGCATATTCATTAG(加下劃線的序列代表EcoRI位點)。
對于CHIPS31-121的15N-標記，用pRSET/CHIPS31-121質粒轉化的BL21(DE3)大腸桿菌不培養在LB培養基中，而是培養在M9基本培養基中，每升該基本培養基包含6g Na2HPO4、3g KH2PO4、0.5g NaCl、1g 15NH4Cl、2ml 1M MgSO4、10μl CaCl2、1ml 0.01M FeSO4、10ml 20％葡萄糖、1ml1000×維生素溶液(每升1000×維生素溶液包含0.4g氯化膽堿、0.5g葉酸、0.5g泛酸、0.5g煙酰胺、1.0g肌醇、0.5g鹽酸吡哆醛、0.5g鹽酸硫胺素、0.05g核黃素、和1g生物素)，和1ml的1000X微量營養素(每升1000X微量營養素包含3×10-6 M鉬酸銨，4×10-4M H3BO3，3×10-5M CoCl2，1×10-5MCuSO4，8×10-5M MnCl2，和1×10-5M ZnSO4)。
對于CHIPS31-121的13C/15N-標記，每升M9基本培養基使用1g 15NH4Cl和2g 13C-葡萄糖。將純化的CHIPS31-121樣品在含有20mM磷酸鈉緩沖液pH5.0/0.01％NaN3的93％1H2O/7％2H2O(v/v)中溶解至1-2mM的濃度。
4.2 NMR波譜
4.2.1概述
所有的NMR數據均在Varian Unity INOVA 500(UIPS)或INOVA600(GBB)NMR波譜儀上于298K獲得。用NMRPipe包(Delaglio等，1995)處理NMR數據，并用Sparky NNR歸屬與積分軟件(T.D.Goddard and D.G.Kneller，SPARKY 3，University of California，San Francisco)分析。
4.2.2波譜歸屬
用標準三重共振試驗(參見Cavanagh等，1996)對骨架1H，15N，13Cα/β和1Hα/β核進行歸屬。用先前13Cα/β和1Hα/β核的歸屬作為起點，通過HC(C)H-TOCSY(Kay等，1993)試驗的解析完成脂肪族側鏈的歸屬。用2D試驗歸屬芳香族側鏈，其將13Cβ和1Hβ共振與芳香族部分的質子相關聯(Yamazaki等，1993)，再加上13C載體置于芳香族區域的的3DHC(C)H-TOCSY，以連接芳香族自旋系統。用15.5ms DIPSI-3混合序列(Shaka等，1988)完成HC(C)H-TOCSY試驗中的相干混合。
4.2.3 NMR滴定試驗
進行滴定試驗，其中監測CHIPS31-1211H和15N的化學位移，作為遞增的SO4-C5AR pep7-28量的函數。獲得了樣品的1H-15N HSQC系列試驗，其中[SO4-C5AR pep7-28]∶[CHIPS31-121]的比率在0∶1和1∶1之間變動。這是通過向400ml的0.45mM CHIPS31-121溶液加入9ml的4mM SO4-C5ARpep7-28(這提供了1∶5的初始[SO4-C5AR pep7-28]∶[CHIPS31-121]比率)以及隨后加入9ml的等份而實現的。
結果
表2顯示了所有涉及或可能涉及CHIPS31-121與C5aR結合的CHIPS31-121的氨基酸，其由15N-1H-HSQC NMR試驗中通過用SO4-C5ARpep7-2815滴定N-標記的CHIPS31-121而獲得。證實了殘基R46，K50，K51，K54，E60，K100，K101，G102，K105，Y108，V109和Y121與結合有關。
實施例5
涉及CHIPS與C5aR結合的CHIPS31-121的氨基酸的分子生物學確認
材料與方法
5.1 CHIPS31-121和CHIPS31-121突變體在周質滲漏(periplasmic leaky)表達系統中的表達
為了在周質滲漏表達系統中表達CHIPS31-121和CHIPS31-121突變體，將CHIPS31-121克隆到pET-22b(+)-載體(Novagen)中。這樣，如1.2節CHIPS制備中所述，PCR擴增CHIPS31-121，使用引物
5’CGATGGCCAATAGTGGTCTTCCTACAACG和
3’CTACTAGCTGAATTCTTAGTATGCATATTCATTAG。
通過重疊延伸PCR(Ho SN等，1989，Gene 77；51)在CHIPS31-121上使用定點誘變構建所有的CHIPS31-121突變體。用MscI和EcoRI消化純化的PCR產物，隨后連接到MscI-和EcoRI-消化的pET-22b(+)-載體中。在TOP10F’大腸桿菌中增殖質粒。
用構建體轉化BL21(DE3)E.Coli用于表達。30℃下用1mM異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)誘導過夜，完成CHIPS31-121和CHIPS31-121突變體的表達。加入HSA(0.1％)以抵消蛋白的損耗。隨后，收集上清并加入PMSF以避免針對所表達的蛋白的蛋白酶活性。
用捕獲ELISA(capture ELISA)測定細菌上清中表達的CHIPS31-121或CHIPS31-121突變體的濃度，其中多克隆兔抗-CHIPS抗體包被到ELISA平板上。
結合后，用生物素化的多克隆兔抗-CHIPS抗體，隨后用鏈霉親合素-過氧化物酶結合檢測CHIPS31-121或CHIPS31-121突變體。
5.2 CHIPS31-121或CHIPS31-121突變體與抗-C5aR mAb競爭結合表達C5aR的U937細胞
表達C5aR的U937細胞與遞增濃度的CHIPS31-121或CHIPS31-121突變體(存在于細菌上清中)一起在含有0.05％人血清白蛋白(RPMI/0.05％HSA)的RPMI中于冰上培養15分鐘。然后，將所述樣品與10μg/ml FITC-標記的抗-C5aR S5/1mAb(抗-CD88(Serotec，Oxford，UK))一起在冰上培養30分鐘。洗滌后，在FACscan流式細胞儀(Becton Dickinson，San Jose，CA，USA)上分析細胞。
結果
圖5A+B顯示CHIPS31-121和所示的CHIPS31-121突變體對抗C5aR單克隆抗體結合C5aR的抑制，其中C5aR表達于U937細胞上。圖5A中的粗線顯示CHIPS31-121和在結合C5aR中影響最大的CHIPS31-121突變體(為E60，K100，Y108，V109和Y121)。圖5B中的粗線顯示在CHIPS31-121和結合C5aR中影響最大的CHIPS31-121突變體(為R46，N47，K50，K51，K54，K101，G102，K105和Y121刪除的)。所有突變體均為單一氨基酸取代為丙氨酸(除非另作說明)。
表3顯示不同的CHIPS31-121突變體的IC50值，其中的單個氨基酸取代為丙氨酸(除非另作說明)。用圖5A+B所示試驗完成IC50的測定。
表1
涉及或可能涉及CHIPS與C5aR結合的C5aR的氨基酸，通過C5aR-N末端和完整C5aR+/-突變體的表達獲得

氨基酸38-350
ILALVIFAVVFLVGVLGNALVVWVTAFEAKRTINAIWFLNLAVADFLSCLALPILFTSIVQHHHWPFGGAACSILPSLILLNMYASILLLATISADRFLLVFKPIWCQNFRGAGLAWIACAVAWGLALLLTIPSFLYRVVREEYFPPKVLCGVDYSHDKRRERAVAIVRLVLGFLWPLLTLTICYTFILLRTWSRRATRSTKTLKVVVAVVASFFIFWLPYQVTGIMMSFLEPSSPTFLLLNKLDSLCVSFAYINCCINPIIYVVAGQGFQGRLRKSLPSLLRNVLTEESVVRESKSFTRSTVDTMAQKTQAV
不涉及CHIPS的結合
表2涉及或可能涉及CHIPS與C5aR結合的CHIPS的氨基酸，在15N-1H-HSQC NMR試驗中通過用C5aR-pep7-2B滴定15N-標記的CHIPS-delta-30而獲得





表3
CHIPS31-121突變體(取代為丙氨酸，除非另作說明)的IC50值，其在抑制抗-C5aR mAb與表達C5aR的U937細胞結合中測得。
表4
涉及補體激活和/或涉及嗜中性粒細胞和或單核細胞的炎癥反應引發的疾病。
·急性反應性關節炎 30 ·中樞神經系統疾病
·急性移植排斥 ·子宮內膜異位癥
·成人呼吸窘迫綜合癥(ARDS) ·實驗性變應性腦脊髓炎(EAE)
·酒精性肝炎 ·實驗性變應性神經炎(EAN)
·異基因移植 ·凍傷
·阿爾茨海默氏病 35 ·胃癌
·動脈硬化 ·胃腸疾病
·阿蒂斯反應(Arthus reaction) ·泌尿生殖性疾病
·哮喘 ·痛風
·動脈粥樣硬化 ·幽門螺桿菌(Heliobacter pylon)
·特應性皮炎 40 胃炎
·細菌性腦膜炎 ·血液透析
·支氣管癌 ·遺傳性血管水腫
·大皰性類天皰瘡 ·高敏性肺炎
·燒傷 ·原發性肺纖維化
·心肺轉流術 45 ·免疫復合物(IC)-誘導的血管炎
·心血管疾病 ·缺血性(ischaemic)休克
·慢性支氣管炎 ·缺血-再灌注事件(episodes)
·慢性淋巴自血病 ·缺血-再灌注損傷
·慢性阻塞性肺病(COPD) ·關節病
·接觸性皮炎 50 ·(大)血管手術
·Crohn氏病 ·金屬煙霧熱
·皮膚T-細胞淋巴瘤 ·多發性硬化
·囊性纖維化病 ·多發性系統器官衰竭
·皮膚病 ·重癥肌無力
·心肌梗塞
·胰腺炎
·腹膜炎
·胸膜肺氣腫(pleural emphesema)
·心肺轉流術后(CBP)炎癥
·牛皮癬
·重復性勞損(RSI)(repetitve strain injury)
·呼吸系統疾病
·類風濕性關節炎
·敗血癥
·敗血性休克
·鼻竇炎
·皮膚疾病
·中風
·系統性紅斑狼瘡(SLE)
·移植
·(外傷性)腦損傷
·潰瘍性結腸炎
·尿道感染
·血管滲漏綜合征
·脈管炎
·異種移植
權利要求
1.化合物，其能夠防止人C5aR N-端殘基10至18與其胞外環的分子內接觸。
2.如權利要求
1所述的化合物，其特征在于其能夠結合人C5aR位置10、15和18的天冬氨酸和位置12的甘氨酸。
3.如權利要求
1-3中任一項所述的化合物，其中該化合物具有通式
Xn-E-X39-K-X7-Y-V-X11-Y-Xm (I)
其中
Xn可以存在或者可以不存在，并且是成蛋白質性氨基酸、非成蛋白質性氨基酸、D-氨基酸、肽模擬物構建單元或其組合的序列段；
K是賴氨酸或其非成蛋白質性類似物；
E是谷氨酸或其非成蛋白質性類似物；
Y是酪氨酸或其非成蛋白質性類似物；
V是纈氨酸或其非成蛋白質性類似物；
X39、X7、和X11各自分別是39、7或11個成蛋白質性氨基酸、非成蛋白質性氨基酸、D-氨基酸、肽模擬物構建單元或其組合的序列段；
Xm可以存在或者可以不存在，并且是成蛋白質性氨基酸、非成蛋白質性氨基酸、D-氨基酸、肽模擬物構建單元或其組合的序列段；并且具有與天然CHIPS相同的三維構象。
4.如權利要求
3中所述的化合物，其中通式I中的Xn和Xm可以各自包含0-100個，優選1-90個，更優選-75個，最優選1-59個殘基。
5.如權利要求
1-3中任一項所述的化合物，其中所述化合物具有通式
Xn-R-X3-K-K-G-X-K-X5-E-X39-K-K-G-X2-K-X2-Y-V-X11-Y-Xm(II)
其中
Xn可以存在或者可以不存在，并且是成蛋白質性氨基酸、非成蛋白質性氨基酸、D-氨基酸、肽模擬物構建單元或其組合的序列段；
R是精氨酸或其非成蛋白質性類似物；
K是賴氨酸或其非成蛋白質性類似物；
E是谷氨酸或其非成蛋白質性類似物；
X，X2，X3，X5和X39各自分別是1、2、3、5、11和39個成蛋白質性氨基酸，非成蛋白質性氨基酸，D-氨基酸，肽模擬物構建單元或其組合的序列段；
Y是酪氨酸或其非成蛋白質性類似物；
V是纈氨酸或其非成蛋白質性類似物；
Xm可以存在或者可以不存在，并且是成蛋白質性氨基酸、非成蛋白質性氨基酸、D-氨基酸、肽模擬物構建單元或其組合的序列段；并且具有與天然CHIPS相同的三維構象。
6.如權利要求
5中所述的化合物，其中式II中的Xn和Xm可以各自包含0-100個，優選1-50個，更優選1-25個，最優選1-15個。
7.如權利要求
1-3中任一項所述的化合物，其中所述化合物具有通式
Xn-T-X6-R-L-R-N-X2-K-K-G-T-K-X4-F-E-K-X-V-X7-Y-X4-L-X11-E-X11-K-K-G-E-X-K-X2-Y-V-X-N-X3-K-X5-Y-Xm (III)，
其中
Xn可以存在或者可以不存在，并且是成蛋白質性氨基酸、非成蛋白質性氨基酸、D-氨基酸、肽模擬物構建單元或其組合的序列段；
T是蘇氨酸或其非成蛋白質性類似物；
R是精氨酸或其非成蛋白質性類似物；
L是亮氨酸或其非成蛋白質性類似物；
N是天冬酰胺或其非成蛋白質性類似物；
X，X2，X3，X4，X5，X6，X7和X11各自分別是1、2、3、4、5、6、7或11個成蛋白質性氨基酸、非成蛋白質性氨基酸、D-氨基酸、肽模擬物構建單元或其組合的序列段；
K是賴氨酸或其非成蛋白質性類似物；
G是甘氨酸或其非成蛋白質性類似物；
F是苯丙氨酸或其非成蛋白質性類似物；
E是谷氨酸或其非成蛋白質性類似物；
Y是酪氨酸或其非成蛋白質性類似物；
V是纈氨酸或其非成蛋白質性類似物；
并且具有與天然CHIPS相同的三維構象。
8.如權利要求
1-4中任一項所述的化合物，其中該化合物具有通式
Xn-T-L-X5-R-L-R-N-Y-L-K-K-G-T-K-X2-A-X-F-E-K-X-V-I-L-X5-Y-X-T-X2-L-X3-L-X2-D-R-K-X2-E-L-X-G-X-M-X2-T-Y-X2-K-K-G-E-X-K-X2-Y-V-I-N-X3-K-X5-Y-Xm(IV)，
其中，
Xn可以存在或者可以不存在，并且是成蛋白質性氨基酸、非成蛋白質性氨基酸、D-氨基酸、肽模擬物構建單元或其組合的序列段；
T是蘇氨酸或其非成蛋白質性類似物；
R是精氨酸或其非成蛋白質性類似物；
L是亮氨酸或其非成蛋白質性類似物；
I是異亮氨酸或其非成蛋白質性類似物；
M是蛋氨酸或其非成蛋白質性類似物；
A是丙氨酸或其非成蛋白質性類似物；
D是天冬酰胺或其非成蛋白質性類似物；
N是天冬酰胺或其非成蛋白質性類似物；
K是賴氨酸或其非成蛋白質性類似物；
G是甘氨酸或其非成蛋白質性類似物；
F是苯丙氨酸或其非成蛋白質性類似物；
E是谷氨酸或其非成蛋白質性類似物；
Y是酪氨酸或其非成蛋白質性類似物；
V是纈氨酸或其非成蛋白質性類似物；
X，X2，X3和X5各自分別是1、2、3或5個成蛋白質性氨基酸、非成蛋白質性氨基酸、D-氨基酸、肽模擬物構建單元或其組合的序列段；并且具有與天然CHIPS相同的三維構象。
9.如權利要求
7或8所述的化合物，其中式III和IV中的Xn和Xm可以各自包含0-100個，優選1-50個，更優選1-25個，最優選1-6個。
10.如權利要求
1-9中任一項所述的化合物，其中所述化合物選自CHIPSΔ1、CHIPSΔ17、CHIPSΔ30，其分別缺失天然CHIPS的N末端結構域的1、17和30個氨基酸。
11.如權利要求
1-10任一項中的化合物，其中所述非成蛋白質性類似物選自下組2-萘基丙氨酸(Nal(2))、β-環己基丙氨酸(Cha)、對-氨基-苯丙氨酸((Phe(p-NH2)、對-苯甲酰基苯丙氨酸(Bpa)、鳥氨酸(Orn)、正亮氨酸(Nle)、4-氟-苯丙氨酸(Phe(p-F))、4-氯-苯丙氨酸(Phe(p-Cl))、4-溴-苯丙氨酸(Phe(p-Br))，4-碘-苯丙氨酸(Phe(p-I))、4-甲基-苯丙氨酸(Phe(p-Me))，4-甲氧基-苯丙氨酸(Tyr(Me))，4-硝基-苯丙氨酸(Phe(p-NO2))。
12.如權利要求
1-11任一項中所述的化合物，其中所述非成蛋白質性類似物為選自下列的D氨基酸D-苯丙氨酸、D-丙氨酸、D-精氨酸、D-天冬酰胺、D-天冬氨酸、D-半胱氨酸、D-谷氨酸、D-谷氨酰胺、D-組氨酸、D-異亮氨酸、D-亮氨酸、D-賴氨酸、D-蛋氨酸、D-脯氨酸、D-絲氨酸、D-蘇氨酸、D-色氨酸、D-酪氨酸、D-纈氨酸、D-2-萘基丙氨酸(D-Nal(2))、β-環己基-D-丙氨酸(D-Cha)、4-氨基-D-苯丙氨酸(D-Phe(p-NH2))、對-苯甲酰基-D-苯丙氨酸(D-Bpa)、D-鳥氨酸(D-Orn)、D-正亮氨酸(D-Nle)、4-氟-D-苯丙氨酸(D-Phe(p-F))、4-氯-D-苯丙氨酸(D-Phe(p-Cl))、4-溴-D-苯丙氨酸(D-Phe(p-Br)、4-碘-D-苯丙氨酸(D-Phe(p-I))、4-甲基-D-苯丙氨酸(D-Phe(p-Me))、4-甲氧基-D-苯丙氨酸(D-Tyr(Me))、4-硝基-D-苯丙氨酸(D-Phe(p-NO2))。
13.如權利要求
1-12任一項中所述的化合物，其中所述非成蛋白質性類似物為選自下列的肽模擬物構建單元寡聚-β-肽、寡聚磺酰胺、插烯磺酰胺、肼基肽/azatides、寡聚氨基甲酸酯、脲擬肽、oligourea、磷酸二酯、擬肽、寡砜、擬肽磺酰胺、插烯肽。
14.如權利要求
13中所述的化合物，其中的肽模擬物構建單元選自N-取代的甘氨酸，如N-芐基甘氨酸(NPhe)、N-甲基甘氨酸(NAla)、N-(3-胍基丙基)甘氨酸(NArg)、N-(羧甲基)甘氨酸(NAsp)、N-(氨基甲酰甲基)甘氨酸(NAsn)、N-(硫代乙基)-甘氨酸(NhCys)、N-(2-羧乙基)甘氨酸(NGlu)、N-(2-氨基甲酰基乙基)甘氨酸(NGln)、N-(咪唑基乙基)甘氨酸(NhHis)、N-(1-甲基丙基)甘氨酸(NIle)、N-(2-甲基丙基)甘氨酸(NLeu)、N-(4-氨基丁基)甘氨酸(NLys)、N-(2-甲基硫代乙基)甘氨酸(NMet)、N-(羥乙基)甘氨酸(NhSer)、N-(2-羥丙基)甘氨酸(NhThr)、N-(3-吲哚甲基)甘氨酸(NTrp)、N-(對-羥基苯甲基)-甘氨酸(NTyr)、N-(1-甲基乙基)甘氨酸(NVal)。
15.如權利要求
1-14中任一項所述的化合物，其為環狀的。
16.如權利要求
1和2所述的化合物，該化合物為抗C5aR或C5aR相關化合物的抗體或其衍生物，C5aR相關化合物包含基序Xq-D-X-G-X2-D-X2-D-Xr，其中Xq、X、X2和Xr是0-9、1、2和0-20個的序列段。
17.用于預防或治療的如權利要求
1-16中任一項所述的化合物。
18.用于預防或治療適應癥的如權利要求
1-16中任一項所述的化合物，所述適應癥涉及嗜中性粒細胞、單核細胞和內皮細胞上的C5a受體(C5aR)。
19.如權利要求
18所述的化合物，其中所述適應癥涉及急性或慢性炎癥反應。
20.如權利要求
19所述的化合物，其中所述適應癥選自表4所列出的組。
21.用于預防或治療適應癥的如權利要求
1-16中任一項所述的化合物，所述適應癥涉及除嗜中性粒細胞、單核細胞和內皮細胞以外的其他細胞上的C5aR。
22.如權利要求
21所述的化合物，其中其他細胞為淋巴細胞，樹突狀細胞，嗜酸性粒細胞，嗜堿性粒細胞，巨噬細胞，小膠質細胞，星形膠質細胞，Kupfer細胞，肝細胞和上皮細胞。
23.用于預防性或治療性疫苗中的如權利要求
1-16任一項中所述的化合物，所述疫苗用于產CHIPS細菌所引起的感染。
24.如權利要求
23中所述的化合物，其中產CHIPS細菌為金黃色葡萄球菌。
25.如權利要求
1-16中所述的化合物在制備用于預防或治療用的治療制劑中的用途。
26.如權利要求
25中所述的用途，其中治療制劑用于預防和治療涉及嗜中性粒細胞、單核細胞和內皮細胞上的C5aR的適應癥。
27.如權利要求
25所述的用途，其中所述適應癥涉及急性或慢性炎癥反應。
28.如權利要求
27所述的用途，其中所述適應癥選自表4所列出的組。
29.如權利要求
25所述的用途，其中治療組合物用于預防或治療涉及除嗜中性粒細胞、單核細胞和內皮細胞以外的其他細胞上的C5aR的適應癥。
30.如權利要求
29所述的用途，其中其他細胞為淋巴細胞，樹突狀細胞，嗜酸性粒細胞，嗜堿性粒細胞，巨噬細胞，小膠質細胞，星形膠質細胞，Kupfer細胞，肝細胞和上皮細胞。
31.如權利要求
25中所述的用途，其中所述治療制劑為預防性或治療性疫苗，所述疫苗用于針對產CHIPS細菌所引起的感染的預防或治療。
32.如權利要求
31中所述的用途，其中產CHIPS細菌為金黃色葡萄球菌。
33.治療組合物，包含合適的賦形劑和一種或多種如權利要求
1-16中所述的化合物。
34.預防組合物，其包含合適的賦形劑和一種或多種如權利要求
1-16中所述的化合物。
35.如權利要求
1-16中任一項中所述的化合物在制備用于醫用裝置表面上的涂覆組合物中的用途，所述醫用裝置通過皮膚介入人體或在手術過程中置于體內。
36.如權利要求
35中所述的用途，其中所述表面為導管尖端的表面。
37.如權利要求
35和36中所述的用途，其中所述組合物為緩釋組合物。
38.治療性或預防性組合物，其包含合適的賦形劑和一種或多種如權利要求
1-16任一項中所述的化合物。
39.預防或治療受試者的方法，所述受試者患有涉及嗜中性粒細胞、單核細胞和內皮細胞上的C5aR的適應癥，該方法包括施用預防或治療有效量的如權利要求
1-16任一項中所述的一種或多種化合物。
40.如權利要求
39中所述的方法，其中所述適應癥涉及急性或慢性炎癥反應。
41.如權利要求
39中所述的方法，其中所述適應癥選自表4所列出的組。
42.預防或治療受試者的方法，所述受試者患有涉及除嗜中性粒細胞、單核細胞和內皮細胞以外的其他細胞上的C5aR的適應癥，所述方法包括給予預防或治療有效量的如權利要求
1-16任一項中所述的一種或多種化合物。
43.如權利要求
42中所述的方法，其中所述其他細胞為淋巴細胞、樹突狀細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、巨噬細胞、小膠質細胞、星形膠質細胞、Kupfer細胞、肝細胞和上皮細胞。
44.對受試者施行抗產CHIPS細菌感染的預防性或治療性處理的方法，所述方法包括施用預防或治療有效量的如權利要求
1-16任一項中所述的一種或多種化合物。
45.鑒定可與C5aR結合的化合物的方法，所述方法包括
a)提供候選化合物文庫，
b)將文庫成員與C5aR相關化合物接觸，該C5aR相關化合物包含基序Xq-D-X-G-X2-D-X2-D-Xr，其中Xq、X、X2和Xr分別是0-9、1、2和0-20個成蛋白質性氨基酸或其非成蛋白質性類似物的序列段，D是天冬氨酸，G是甘氨酸，其以與天然產生的C5aR中發現的構象相同或相似的構象存在，和
c)鑒定文庫中結合所述C5aR相關化合物的成員。
46.如權利要求
45所述的方法，其還包括提供如此鑒定的成員用于預防或治療的步驟。
47.按照權利要求
45所述方法鑒定的化合物。
48.如權利要求
47所述的化合物在制備治療和預防與C5aR有關的適應癥的藥物組合物中的用途。
專利摘要
本發明涉及能夠防止人C5aR N－端殘基10至18與其胞外環分子內接觸的化合物。更特別地，本發明涉及能夠結合人C5aR位置10、15和18的天冬氨酸以及位置12的甘氨酸的化合物。這樣的化合物優選具有通式Xn－E－X39－K－X7－Y－V－X11－Y－Xm，其中Xn、X39、X7、X11和Xm為氨基酸和其他字母代表相應的氨基酸或其非成蛋白質性類似物的序列段。本發明還涉及其在預防和治療中的用途。
文檔編號G01N33/566GK1997664SQ200580019673
公開日2007年7月11日 申請日期2005年4月15日
發明者約翰尼斯·A·G·范斯特里普, 卡拉·J·C·德哈斯, 約翰·凱明克, 科克·P·M·范凱塞爾 申請人:鱷魚生物科學公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan