本發(fa)明(ming)涉及單(dan)(dan)克隆抗體領域，具體涉及一種靶向真菌烯(xi)醇(chun)化酶1的單(dan)(dan)克隆抗體及其制備和應用。

背景技術：

1、近二十多年(nian)來，由于(yu)艾滋病(bing)、腫瘤(liu)放化療、器官移植等原(yuan)因，使免(mian)疫缺陷(xian)患者持續增多，侵(qin)襲真(zhen)菌感染(ran)(ifis)發病(bing)率顯著(zhu)上升(sheng)，在全(quan)世界(jie)范圍內其(qi)致死(si)率超過(guo)50％。每年(nian)全(quan)球有(you)約(yue)10億人(ren)被真(zhen)菌感染(ran)，其(qi)中(zhong)約(yue)375萬(wan)人(ren)死(si)于(yu)真(zhen)菌感染(ran)，其(qi)中(zhong)白念(nian)珠菌為最主(zhu)要的致病(bing)真(zhen)菌。

2、烯(xi)醇(chun)化酶(eno1)，也稱為(wei)2磷酸(suan)甘(gan)油(you)(you)酸(suan)水(shui)解酶，是(shi)一種金(jin)屬(shu)酶，催化2磷酸(suan)甘(gan)油(you)(you)酸(suan)在(zai)糖酵解途徑(jing)中(zhong)轉(zhuan)化為(wei)烯(xi)醇(chun)式丙酮酸(suan)，對生(sheng)物(wu)(wu)體的(de)生(sheng)長(chang)和(he)代(dai)謝十分(fen)重要。烯(xi)醇(chun)化酶在(zai)不同物(wu)(wu)種中(zhong)可能被多個(ge)基因(yin)所編碼。例如，人的(de)基因(yin)組中(zhong)至少有4個(ge)編碼enolase的(de)基因(yin)(eno1，eno2，eno3和(he)eno4)。白念珠(zhu)菌(jun)eno1是(shi)一種多功能蛋白，在(zai)白念珠(zhu)菌(jun)細(xi)胞(bao)內和(he)細(xi)胞(bao)表面(mian)均(jun)有分(fen)布，被認為(wei)是(shi)主(zhu)(zhu)要的(de)細(xi)胞(bao)表面(mian)抗(kang)原和(he)毒(du)力因(yin)子(zi)，參與了白念珠(zhu)菌(jun)侵襲性(xing)感(gan)(gan)染(ran)形成(cheng)，宿主(zhu)(zhu)感(gan)(gan)染(ran)后會(hui)因(yin)刺激而可以(yi)產生(sheng)保(bao)護性(xing)抗(kang)體。因(yin)此(ci)，eno1具有作(zuo)為(wei)開(kai)發治療(liao)侵襲性(xing)真菌(jun)感(gan)(gan)染(ran)藥物(wu)(wu)靶(ba)點的(de)潛在(zai)價值。

3、單(dan)(dan)克隆(long)(long)抗體是由單(dan)(dan)一克隆(long)(long)的雜交(jiao)瘤細胞(bao)產(chan)生，僅(jin)識別(bie)單(dan)(dan)一抗原表位的特(te)異性(xing)抗體，具有高特(te)異性(xing)、治療(liao)效果顯(xian)著、產(chan)生的交(jiao)叉(cha)反應或副作用(yong)少、易于修飾改造(zao)、體內存在周期(qi)較長等特(te)點。

4、現用(yong)的(de)抗(kang)真(zhen)菌(jun)藥物主要(yao)有(you)(you)氮唑類(lei)、多烯類(lei)、棘白菌(jun)素(su)類(lei)等(deng)(deng)，存在(zai)品種少、真(zhen)菌(jun)耐藥性(xing)增加和毒副作用(yong)大等(deng)(deng)問題，給(gei)臨床抗(kang)真(zhen)菌(jun)治(zhi)療(liao)的(de)藥物選擇帶來(lai)很大困擾(rao)，迫(po)切(qie)需(xu)要(yao)研制新型(xing)抗(kang)真(zhen)菌(jun)藥物。在(zai)多數侵襲性(xing)真(zhen)菌(jun)感染患者(zhe)的(de)免(mian)疫功能低下(xia)、真(zhen)菌(jun)易(yi)對小(xiao)分子藥物產(chan)生耐藥性(xing)、小(xiao)分子藥物抗(kang)侵襲性(xing)真(zhen)菌(jun)感染的(de)有(you)(you)效性(xing)和安(an)全性(xing)亟待提高的(de)情況(kuang)下(xia)，研究抗(kang)真(zhen)菌(jun)治(zhi)療(liao)的(de)新策略具有(you)(you)極(ji)其重要(yao)的(de)意(yi)義(yi)。單克隆抗(kang)體具有(you)(you)精準(zhun)靶向的(de)抗(kang)真(zhen)菌(jun)作用(yong)，兼有(you)(you)調節機體免(mian)疫反應的(de)功能，是治(zhi)療(liao)真(zhen)菌(jun)感染的(de)一種可行(xing)且具有(you)(you)獨(du)特優勢的(de)方法。

5、對(dui)(dui)于目前臨床上對(dui)(dui)于侵襲真菌感(gan)染的(de)(de)診斷的(de)(de)方法(fa)(fa)，主(zhu)要通過平板培(pei)養法(fa)(fa)，g實驗等(deng)，存(cun)在著時(shi)間(jian)長，靈敏度(du)低等(deng)問(wen)題。但是感(gan)染患(huan)者(zhe)的(de)(de)診斷時(shi)間(jian)的(de)(de)早晚對(dui)(dui)患(huan)者(zhe)的(de)(de)預后有著很(hen)大的(de)(de)影(ying)響，以及(ji)抗(kang)菌藥的(de)(de)不當使用會導致治療無效和耐藥的(de)(de)問(wen)題。

6、綜上，亟需研發(fa)一種能夠用來靶(ba)向真菌烯醇化酶(mei)1(eno1)的單克隆抗(kang)體。

技術實現思路

1、本發明是為(wei)了解決上(shang)述問題而進行(xing)的，目的在于(yu)提供一(yi)種靶向(xiang)真菌烯醇化酶1的單克隆抗體(ti)及(ji)其制備和應用(yong)。

2、本(ben)發明提(ti)供了一種靶向(xiang)真菌(jun)烯醇化酶1的(de)(de)單克(ke)隆(long)(long)抗(kang)體，具有這樣的(de)(de)特(te)征，包括：單克(ke)隆(long)(long)抗(kang)體12g10和/或單克(ke)隆(long)(long)抗(kang)體5c4，其中，單克(ke)隆(long)(long)抗(kang)體12g10包含重(zhong)鏈(lian)可變區和輕鏈(lian)可變區，單克(ke)隆(long)(long)抗(kang)體12g10的(de)(de)重(zhong)鏈(lian)可變區的(de)(de)3個互補決定區(cdr)序(xu)列分(fen)別為：重(zhong)鏈(lian)cdr1氨(an)基(ji)(ji)酸：gftfssya，重(zhong)鏈(lian)cdr2氨(an)基(ji)(ji)酸：issggsyt，重(zhong)鏈(lian)cdr3氨(an)基(ji)(ji)酸：arisydlfdy，

3、單克隆抗體12g10的(de)輕鏈(lian)可變區的(de)3個互補決定區(cdr)序列分別(bie)為：輕鏈(lian)cdr1氨(an)基酸(suan)：ssvsy，輕鏈(lian)cdr2氨(an)基酸(suan)：sts，輕鏈(lian)cdr3氨(an)基酸(suan)：hqwsiyrt，

4、單(dan)克隆(long)抗體5c4包含(han)重鏈可變區和輕(qing)鏈可變區，單(dan)克隆(long)抗體5c4的(de)重鏈可變區的(de)3個(ge)互補(bu)決定區(cdr)序列(lie)分別為：重鏈cdr1氨基(ji)酸(suan)：gfsltsya，重鏈cdr2氨基(ji)酸(suan)：iwgdgst，重鏈cdr3氨基(ji)酸(suan)：akadyydyfdy，

5、單克隆抗(kang)體5c4的輕鏈(lian)(lian)(lian)可(ke)變區的3個互補決定(ding)區(cdr)序(xu)列分別為：輕鏈(lian)(lian)(lian)cdr1氨(an)(an)基(ji)(ji)酸：qdinry，輕鏈(lian)(lian)(lian)cdr2氨(an)(an)基(ji)(ji)酸：ran，輕鏈(lian)(lian)(lian)cdr3氨(an)(an)基(ji)(ji)酸：lqydefplt。

6、在(zai)本(ben)發(fa)明(ming)提供的(de)靶向(xiang)真菌(jun)烯醇化酶1的(de)單(dan)克隆(long)抗(kang)(kang)體中(zhong)，還可以(yi)具有(you)這樣(yang)的(de)特征：其(qi)中(zhong)，單(dan)克隆(long)抗(kang)(kang)體12g10的(de)重鏈可變(bian)區的(de)氨(an)(an)基酸序(xu)列如seq?id?no：1所(suo)示，單(dan)克隆(long)抗(kang)(kang)體12g10的(de)輕鏈可變(bian)區的(de)氨(an)(an)基酸序(xu)列如seq?id?no：2所(suo)示。

7、在本發明提供的靶向真菌烯醇化酶1的單克隆(long)抗體中(zhong)，還可(ke)以具有這樣的特征：其中(zhong)，單克隆(long)抗體12g10的重鏈可(ke)變區的基(ji)(ji)因(yin)(yin)序列(lie)如seq?id?no：3所示，單克隆(long)抗體12g10的輕鏈可(ke)變區的基(ji)(ji)因(yin)(yin)序列(lie)如seq?id?no：4所示。

8、在本發明提(ti)供(gong)的(de)靶向真菌烯(xi)醇化(hua)酶(mei)1的(de)單克隆(long)抗體(ti)中，還可(ke)以具有這樣的(de)特征：其中，單克隆(long)抗體(ti)5c4的(de)重鏈(lian)可(ke)變區(qu)的(de)氨基酸序列(lie)如seq?id?no：5所(suo)示，單克隆(long)抗體(ti)5c的(de)輕鏈(lian)可(ke)變區(qu)的(de)氨基酸序列(lie)如seq?id?no：6所(suo)示。

9、在本發明(ming)提供的(de)(de)靶向真菌烯醇化(hua)酶1的(de)(de)單克隆抗(kang)體(ti)中，還可(ke)以具有(you)這樣(yang)的(de)(de)特征(zheng)：其中，單克隆抗(kang)體(ti)5c4的(de)(de)重(zhong)鏈可(ke)變(bian)(bian)區(qu)的(de)(de)基因(yin)序列(lie)(lie)如seq?id?no：7所示(shi)，單克隆抗(kang)體(ti)5c4的(de)(de)輕鏈可(ke)變(bian)(bian)區(qu)的(de)(de)基因(yin)序列(lie)(lie)如seq?id?no：8所示(shi)。

10、本發明還提供(gong)了靶(ba)向(xiang)真菌(jun)烯醇(chun)化酶1的(de)單(dan)克(ke)隆抗體(ti)的(de)制備(bei)方(fang)法，具有這(zhe)樣(yang)的(de)特征，包(bao)括以(yi)下步(bu)驟：步(bu)驟sl，構建白念(nian)珠(zhu)菌(jun)eno1蛋(dan)白重(zhong)組表達(da)質粒(li)，然后進行eno1蛋(dan)白誘導(dao)表達(da)及純化，得(de)到重(zhong)組念(nian)珠(zhu)菌(jun)enol蛋(dan)白；步(bu)驟s2，以(yi)重(zhong)組念(nian)珠(zhu)菌(jun)enol蛋(dan)白為(wei)抗原，對balb/c雌性小鼠進行免疫，得(de)到免疫小鼠并(bing)取免疫小鼠的(de)脾臟細胞(bao)，采(cai)用雜交瘤方(fang)法制備(bei)雜交瘤細胞(bao)株，再分別通過一次、二次亞克(ke)隆篩選，獲得(de)靶(ba)向(xiang)真菌(jun)烯醇(chun)化酶1的(de)enol單(dan)克(ke)隆抗體(ti)及其enol單(dan)克(ke)隆抗體(ti)細胞(bao)株。

11、本發(fa)明還提供了靶向真(zhen)(zhen)菌(jun)(jun)烯醇化(hua)酶1的單克隆(long)抗體在(zai)制備抗真(zhen)(zhen)菌(jun)(jun)感染藥物以及抗真(zhen)(zhen)菌(jun)(jun)感染藥物增效(xiao)劑中的應用。

12、在(zai)本(ben)發(fa)明(ming)提供的靶向(xiang)真菌(jun)(jun)(jun)(jun)烯醇化(hua)酶1的單(dan)克隆抗(kang)體(ti)在(zai)制備抗(kang)真菌(jun)(jun)(jun)(jun)感染(ran)藥(yao)物以(yi)及抗(kang)真菌(jun)(jun)(jun)(jun)感染(ran)藥(yao)物增效劑中的應(ying)用(yong)中，還可(ke)以(yi)具有這樣的特(te)征(zheng)：應(ying)用(yong)所針對的真菌(jun)(jun)(jun)(jun)包(bao)括白(bai)念(nian)(nian)珠菌(jun)(jun)(jun)(jun)、光滑(hua)念(nian)(nian)珠菌(jun)(jun)(jun)(jun)、克柔(rou)念(nian)(nian)珠菌(jun)(jun)(jun)(jun)、熱(re)帶念(nian)(nian)珠菌(jun)(jun)(jun)(jun)、耳念(nian)(nian)珠菌(jun)(jun)(jun)(jun)、近平滑(hua)念(nian)(nian)珠菌(jun)(jun)(jun)(jun)、新生(sheng)隱球菌(jun)(jun)(jun)(jun)和(he)煙曲(qu)霉菌(jun)(jun)(jun)(jun)。

13、發明的作用與效(xiao)果

14、根據本(ben)發明所涉及(ji)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)靶向(xiang)真(zhen)菌(jun)烯(xi)醇(chun)化(hua)(hua)酶(mei)(mei)1的(de)(de)(de)(de)(de)(de)單(dan)(dan)克(ke)(ke)(ke)(ke)隆(long)(long)(long)抗(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)及(ji)其制備應(ying)用，該(gai)靶向(xiang)真(zhen)菌(jun)烯(xi)醇(chun)化(hua)(hua)酶(mei)(mei)1的(de)(de)(de)(de)(de)(de)單(dan)(dan)克(ke)(ke)(ke)(ke)隆(long)(long)(long)抗(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)包括單(dan)(dan)克(ke)(ke)(ke)(ke)隆(long)(long)(long)抗(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)12g10和/或單(dan)(dan)克(ke)(ke)(ke)(ke)隆(long)(long)(long)抗(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)5c4，單(dan)(dan)克(ke)(ke)(ke)(ke)隆(long)(long)(long)抗(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)12g10的(de)(de)(de)(de)(de)(de)重鏈(lian)(lian)可(ke)變(bian)區的(de)(de)(de)(de)(de)(de)3個(ge)(ge)互(hu)補(bu)決(jue)定區(cdr)序列分別為(wei)cdr1：gftfssya，cdr2：issggsyt，cdr3：arisydlfdy，輕鏈(lian)(lian)可(ke)變(bian)區的(de)(de)(de)(de)(de)(de)3個(ge)(ge)互(hu)補(bu)決(jue)定區(cdr)序列分別為(wei)cdr1：ssvsy，cdr2：sts，cdr3：hqwsiyrt；單(dan)(dan)克(ke)(ke)(ke)(ke)隆(long)(long)(long)抗(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)5c4的(de)(de)(de)(de)(de)(de)重鏈(lian)(lian)可(ke)變(bian)區的(de)(de)(de)(de)(de)(de)3個(ge)(ge)互(hu)補(bu)決(jue)定區(cdr)序列分別為(wei)cdr1：gfsltsya，cdr2：iwgdgst，cdr3：akadyydyfdy，輕鏈(lian)(lian)可(ke)變(bian)區的(de)(de)(de)(de)(de)(de)3個(ge)(ge)互(hu)補(bu)決(jue)定區(cdr)序列分別為(wei)cdr1：qdinry，cdr2：ran，cdr3：lqydefplt。單(dan)(dan)克(ke)(ke)(ke)(ke)隆(long)(long)(long)抗(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)12g10和單(dan)(dan)克(ke)(ke)(ke)(ke)隆(long)(long)(long)抗(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)5c4均(jun)不僅(jin)能(neng)與(yu)真(zhen)菌(jun)eno1蛋白(bai)高親和力結合(he)，還能(neng)與(yu)真(zhen)菌(jun)細(xi)胞結合(he)，從而(er)抑(yi)制真(zhen)菌(jun)對宿主細(xi)胞的(de)(de)(de)(de)(de)(de)侵(qin)襲感染(ran)(ran)。單(dan)(dan)克(ke)(ke)(ke)(ke)隆(long)(long)(long)抗(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)12g10和單(dan)(dan)克(ke)(ke)(ke)(ke)隆(long)(long)(long)抗(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)5c4均(jun)與(yu)人的(de)(de)(de)(de)(de)(de)烯(xi)醇(chun)化(hua)(hua)酶(mei)(mei)不結合(he)，并均(jun)具(ju)有高度地選擇性。本(ben)發明提供的(de)(de)(de)(de)(de)(de)靶向(xiang)真(zhen)菌(jun)烯(xi)醇(chun)化(hua)(hua)酶(mei)(mei)1的(de)(de)(de)(de)(de)(de)單(dan)(dan)克(ke)(ke)(ke)(ke)隆(long)(long)(long)抗(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)在治(zhi)療侵(qin)襲性真(zhen)菌(jun)感染(ran)(ran)上效果(guo)顯(xian)著(zhu)。

15、因此，本發明(ming)提(ti)供的(de)靶向真菌烯醇化酶1的(de)單克隆(long)抗(kang)體具有(you)(you)選擇性高、特異性強和藥效(xiao)好的(de)特點，在侵襲性真菌感染的(de)診斷和治療中(zhong)具有(you)(you)巨大(da)的(de)應用價值。