本發明涉及組織工程生物技術領域，尤其是涉及一種組織模型的構建方法及應用。

背景技術：

現行去細胞基質的制備方法容易導致基質成分和三維結構容易被破壞，而且試劑殘留嚴重，植入組織中可能引起嚴重的免疫排異反應。

現行組織去細胞基質制備工藝，如cn201310376619.8所述的方法需要耗費大量的時間才能讓化學去垢劑滲透至組織內部，作用于細胞，除去組織中的細胞成分。

與此同時,現行新藥研發流程中大量的時間和費用都花費于藥物的檢測和篩選中,構建體外組織模型對于藥物的檢測和篩選,以及藥物的作用機理和治療效果的研究具有重要意義。

現行共培養組織模型，如cn201310008125.4中介紹的二維培養模型，不能準確模擬體內三維環境，限制了模型在藥物檢測和篩選中的應用。

現行三維共培養組織模型，如cn201610830529.5中介紹的模型不包含天然生物組織的微脈管系統和生物因子等微環境，限制了模型在藥物檢測篩選中的應用。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種組織模型的構建方法，該方法中用于與動物細胞體外共培養的天然軟組織去細胞基質中含有微脈管系統和生物因子等微環境，使得本發明方法得到的組織模型與其他共培養模型相比更接近人體組織。

本發明的另一個目的在于，提供通過本發明方法得到的組織模型的應用。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種組織模型的構建方法，包括將天然軟組織去細胞基質與動物細胞體外共培養得到所述組織模型。

優選地，所述天然軟組織去細胞基質通過預處理，消毒，脫脂，酶處理，去細胞，漂洗和滅菌步驟制得；制得的天然軟組織去細胞基質含有微脈管系統和生物因子微環境；

所述脫脂步驟為將所述天然軟組織置于脫脂劑中2-12h；所述脫脂劑選自三氯甲烷，二氯甲烷，丙酮、二氯乙烷和乙醇中的一種或多種；所述脫脂劑的用量為所述組織體積的1-30倍；

所述酶處理步驟為將所述天然軟組織置于含有生物酶的生理鹽水或磷酸鹽緩沖溶液中；所述天然軟組織置于含有生物酶的生理鹽水或磷酸鹽緩沖溶液中的時間為1-48h；所述生物酶選自胰蛋白酶、胃蛋白酶或磷脂酶；所述生物酶的濃度為0.1-10wt％；

所述去細胞步驟為將所述天然軟組織置于含有化學去垢劑的生理鹽水或磷酸鹽緩沖溶液中。

優選地，所述天然軟組織包括小腸組織，血管組織，肌肉組織，心臟組織，瓣膜組織，肺組織，脾臟組織，腎臟組織，肝臟組織，胃組織，膽囊組織，脂肪組織，軟骨組織，氣管組織，食道組織，膀胱組織，輸尿管組織，輸卵管組織或子宮組織；所述動物細胞包括全能干細胞，多能干細胞，專能干細胞，免疫細胞，軟骨細胞，骨來源細胞，平滑肌細胞，骨骼肌細胞，心肌細胞，肝細胞，肝來源的干細胞或祖細胞，肝巨噬細胞，星狀細胞，上皮細胞，腫瘤細胞，神經細胞，血管細胞，內皮細胞或成纖維細胞。

優選地，該方法具體包括：

a.取滅菌后的天然軟組織去細胞基質置于培養皿中；

b.將含有動物細胞的培養基懸濁液注入培養皿中；

c.將培養皿放置于培養箱中3-6小時后，繼續添加培養基；

d.將動物細胞與天然軟組織去細胞基質共培養3-30天得到所述細胞組織模型，培養期間每48小時將培養基完全更換一次。

優選地，步驟a中所述培養皿為24孔板；所述培養皿中預先涂覆纖維連接蛋白；所述天然軟組織去細胞基質的厚度為0.05-2mm。

優選地，所述步驟b中，所述動物細胞的培養基懸濁液中動物細胞的濃度為個/ml；注入培養皿中的所述動物細胞的培養基懸濁液的液面高度不小于所述天然軟組織去細胞基質的厚度。

優選地，注入培養皿中的所述動物細胞的培養基懸濁液的液面高度等于所述天然軟組織去細胞基質的厚度。

優選地，步驟c中繼續添加的培養基的體積為步驟b中所述動物細胞的培養基懸濁液體積的1-10倍。

上述的模型構建方法構建的組織模型為天然軟組織去細胞基質與動物細胞的體外共培養模型。

將上述的組織模型應用在檢測藥物的轉運，吸收，和代謝中或檢測藥物功效和篩選藥物中。

本發明的有益效果如下：

1.本發明中的天然軟組織去細胞基質作為細胞培養支架，含有微脈管系統和生物因子等微環境,有助于細胞培養支架在再細胞化過程中細胞獲取氧氣和營養物質，以及細胞的增殖、遷移和分化。

2.本發明方法中的細胞體外共培養模型與其他共培養模型相比，在組織微觀結構、細胞空間分布、特定細胞表型等方面更接近人體組織，因而可用于檢測藥物的轉運，吸收，和代謝或應用在檢測藥物功效和篩選藥物中。

附圖說明

圖1為實施例1中的去細胞心肌組織掃描電鏡圖；

圖2為實施例5中的共培養細胞掃電鏡圖；

圖3為實施例7中的間充質干細胞與去細胞豬小腸黏膜組織共培養模型的組織染色圖。

具體實施方式

下面將結合附圖對本發明的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。

本發明的發明人發現了一種對天然軟組織去細胞制備去細胞基質的方法，該方法制備出的去細胞基質可以保持去細胞基質的三維結構，而且通過該方法制備的去細胞基質中的試劑殘留小，殘留少，避免了植入組織中可能引起的免疫排異反應，而且，本方法制備去細胞基質的時間短，效率高。

將本發明人制備出的天然軟組織去細胞基質與動物細胞進行體外共培養構建出細胞體外共培養模型，在組織微觀結構、細胞空間分布、特定細胞表型等方面更接近人體組織。

將利用本發明方法構建的細胞體外共培養模型用于檢測藥物的轉運，吸收，和代謝或應用在檢測藥物功效和篩選藥物中，可得到更具代表性和可信度的試驗結果。

本發明的天然軟組織去細胞基質的制備方法，該方法包括：取材，預處理，消毒，脫脂，酶處理，去細胞，漂洗和滅菌步驟。

在一個優選的實施方式中，取材，預處理步驟為將準備脫細胞的天然軟組織用生理鹽水或磷酸鹽緩沖溶液進行清洗，待用。

在一個優選的實施方式中，消毒步驟為用過氧乙酸溶液、乙醇溶液、或新潔爾滅溶液中的一種或幾種溶液的混合液進行浸泡，再用生理鹽水或磷酸鹽緩沖溶液漂洗。

在一個優選的實施方式中，過氧乙酸溶液的濃度為0.01-0.3wt％；

在一個優選的實施方式中，乙醇溶液的濃度為1-10％；

在一個優選的實施方式中，新潔爾滅溶液的濃度為0.05-1wt％，

在一個優選的實施方式中，浸泡時間為0.5-3h；

在一個優選的實施方式中，生理鹽水的濃度為0.9wt％；

在一個優選的實施方式中，磷酸鹽緩沖溶液ph值為7.2-7.8，濃度為0.01m。

在一個優選的實施方式中，脫脂步驟為將選擇的天然軟組織置于脫脂劑中2-12h；

本發明中，作為典型但非限制性的天然軟組織在脫脂劑中的放置時間為：2，2.5，3，3.5，4，4.5，5，5.5，6，6.5，7，7.5，8，8.5，9，9.5，10，10.5，11，11.5，12h。

在一個優選的實施方式中，脫脂劑選自三氯甲烷，二氯甲烷，丙酮、二氯乙烷和乙醇中的一種或多種；

在一個優選的實施方式中，脫脂劑的用量為選擇的天然軟組織體積的1-30倍；

本發明中，作為典型但非限制性的脫脂劑的用量為選擇的天然軟組織體積的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30倍。

在一個優選的實施方式中，酶處理步驟為將脫脂后的天然軟組織置于含有生物酶的生理鹽水或磷酸鹽緩沖溶液中。

在一個優選的實施方式中，天然軟組織置于含有生物酶的生理鹽水或磷酸鹽緩沖溶液中的時間為1-48h；

本發明中，作為典型但非限制性的天然軟組織置于含有生物酶的生理鹽水或磷酸鹽緩沖溶液中的時間可以為，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40h。

在一個優選的實施方式中，生物酶選自胰蛋白酶、胃蛋白酶或磷脂酶；

在一個優選的實施方式中，生物酶的濃度為0.1-10wt％，

本發明中，作為典型但非限制性的生物酶的濃度，還可以為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10wt％。

在一個優選的實施方式中，去細胞為將天然軟組織置于含有化學去垢劑的生理鹽水或磷酸鹽緩沖溶液中。

在一個優選的實施方式中，化學去垢劑選自tritonx-100、tritonx-200、tween-20、tween-40、tween-60、脫氧膽酸鈉和十二烷基磺酸鈉中的一種或多種；化學去垢劑的濃度優選為0.1-5wt％。

本發明的天然軟組織包括小腸組織，血管組織，肌肉組織，心臟組織，瓣膜組織，肺組織，脾臟組織，腎臟組織，肝臟組織，胃組織，膽囊組織，脂肪組織，軟骨組織，氣管組織，食道組織，膀胱組織，輸尿管組織，輸卵管組織或子宮組織。

本發明將天然軟組織去細胞基質與動物細胞體外共培養得到所述組織模型的構建方法包括如下步驟：

a.取滅菌后的天然軟組織去細胞基質置于培養皿中；

在一個優選的實施方式中，上述步驟中的培養皿為24孔板；培養皿中預先涂覆纖維連接蛋白再放置天然軟組織去細胞基質；放置于培養皿中的天然軟組織去細胞基質的厚度優選為0.05-2mm；

b.將含有動物細胞的培養基懸濁液注入培養皿中；

在一個優選的實施方式中，上述步驟中的動物細胞的培養基懸濁液中動物細胞的濃度為個/ml；注入培養皿中的動物細胞的培養基懸濁液的液面高度不小于所述天然軟組織去細胞基質的厚度

在一個優選的實施方式中，上述步驟中注入培養皿中的動物細胞的培養基懸濁液的液面高度等于天然軟組織去細胞基質的厚度。

c.將培養皿放置于培養箱中3-6小時后，繼續添加培養基；

在一個優選的實施方式中，上述步驟中的繼續添加的培養基的體積為步驟b中的最初注入培養皿中的動物細胞的培養基懸濁液體積的1-10倍；

d.將動物細胞與天然軟組織去細胞基質共培養3-30天得到本發明的組織模型，優選在共培養期間每48小時將培養基完全更換一次。

本發明的動物細胞包括全能干細胞，多能干細胞，專能干細胞，免疫細胞，軟骨細胞，骨來源細胞，平滑肌細胞，骨骼肌細胞，心肌細胞，肝細胞，肝來源的干細胞或祖細胞，肝巨噬細胞，星狀細胞，上皮細胞，腫瘤細胞，神經細胞，血管細胞，內皮細胞或成纖維細胞。

實施例1

對天然軟組織進行去細胞處理得到去細胞基質，以小鼠心肌組織為例，包括如下步驟：

取材，預處理：取小鼠心肌組織，用濃度為0.9wt％的生理鹽水清洗干凈；

消毒：用含有0.02wt％過氧乙酸和5％乙醇的溶液浸泡清洗后的小鼠心肌組織1h，用濃度為0.9wt％生理鹽水漂洗；

脫脂：將消毒后的小鼠心肌組織置于脫脂試劑中2h，脫脂試劑選用三氯甲烷，二者的體積比為(1:2)，脫脂試劑總體積為小鼠心肌組織體積的30倍；

酶處理：將脫脂后的小鼠心肌組織置于含有胰蛋白酶的生理鹽水中12h，溶液濃度為0.25wt％，用濃度為0.9wt％生理鹽水漂洗；

去細胞：將酶處理后的小鼠心肌組織置于含有化學去垢劑十二烷基磺酸鈉的生理鹽水中24h，其中十二烷基磺酸鈉濃度為0.3wt％，用濃度為0.9wt％生理鹽水漂洗；

漂洗：用濃度為0.9wt％生理鹽水漂洗經過上述各步驟處理后得到的去細胞小鼠心肌組織48h；

滅菌：將漂洗干凈后的去細胞小鼠心肌組織用γ射線進行輻照，輻照劑量為25kgy。

所得到的去細胞小鼠心肌組織掃描電鏡顯微結構圖如圖1所示，從圖1可見組織中的血管結構得到了保留，此特征有助于去細胞心肌組織在再細胞化過程中細胞獲取氧氣和營養物質；亦有助于內皮細胞的附著生長或干細胞在血管處分化為內皮細胞，即實現血管的再內皮化。

將實施例1中的脫脂，酶處理，去細胞三個步驟中的酶處理步驟的時間及試劑進行優化，如下表1-3所示：

與實施例1的步驟和條件相同，不同的是脫脂步驟的時間，酶處理步驟的時間，去細胞步驟的時間和化學去垢劑濃度，具體情況如表1所示，

表1

與實施例1的步驟和條件相同，不同的是，脫脂步驟的時間，酶處理步驟的胰蛋白酶濃度和時間，去細胞步驟的時間，具體情況如表2所示，

表2

與實施例1的步驟和條件相同，不同的是，脫脂步驟的時間，酶處理步驟的時間，去細胞步驟的時間，化學去垢劑的選擇，具體情況如表3所示，

表3

實施例5

使用實施例1中的細胞小鼠心肌組織，構建去細胞小鼠心肌組織與心臟干細胞體外共培養模型

包括如下步驟：

a.取滅菌后的去細胞小鼠心肌組織置于預先在內壁涂覆纖維連接蛋白的24孔板中；置于24孔板的去細胞小鼠心肌組織的厚度為0.5mm；

b.將含有心臟干細胞，濃度為50000個/ml的培養基懸濁液注入24孔板中；注入24孔板中的心臟干細胞的培養基懸濁液體積為200μl，即懸濁液的液面高度等于1mm；

c.將24孔板放置于培養箱中4小時后，繼續添加培養基，新增加的培養基的量為最初注入24孔板中的含有心臟干細胞的培養基懸濁液體積的4倍，為800μl；

d.將心臟干細胞與去細胞小鼠心肌組織共培養7天得到本發明的組織模型，在共培養期間每48小時將培養基完全更換一次。

本實施例構建的心臟干細胞與去細胞小鼠心肌組織體外共培養模型的掃面電鏡顯微細胞圖如圖2所示，從圖2可見細胞呈扁平狀生長，為收縮性表型(contractilephenotype)，體現了在共培養模型中被誘導分化的趨勢。

實施例6

對天然軟組織進行去細胞處理得到去細胞基質，以豬小腸黏膜組織為例，包括如下步驟：

取材，預處理：取豬小腸黏膜組織，用濃度為0.9wt％的生理鹽水清洗干凈；

消毒：用含有0.02wt％過氧乙酸和5％乙醇的溶液浸泡清洗后的豬小腸黏膜組織1h，用濃度為0.9wt％生理鹽水漂洗；

脫脂：將消毒后的豬小腸黏膜組織置于脫脂試劑中12h，脫脂試劑選用三氯甲烷和乙醇的混合物，二者的體積比為(1:2)，脫脂試劑總體積為豬小腸黏膜組織體積的30倍；

酶處理：將脫脂后的豬小腸黏膜組織置于含有胃蛋白酶的生理鹽水中8h，溶液濃度為0.1wt％，用濃度為0.9wt％生理鹽水漂洗；

去細胞：將酶處理后的豬小腸黏膜組織置于含有化學去垢劑tritonx-100和十二烷基磺酸鈉的生理鹽水中24h，其中tritonx-100濃度為2wt％，十二烷基磺酸鈉濃度為0.5wt％，用濃度為0.9wt％生理鹽水漂洗；

漂洗：用濃度為0.9wt％生理鹽水漂洗經過上述各步驟處理后得到的去細胞豬小腸黏膜組織48h；

滅菌：將漂洗干凈后的去細胞豬小腸黏膜組織用γ射線進行輻照，輻照劑量為25kgy。

實施例7

使用實施例6中的去細胞豬小腸黏膜組織，構建間充質干細胞與去細胞豬小腸黏膜組織共培養模型

包括如下步驟：

a.取滅菌后的去細胞豬小腸黏膜組織置于預先在內壁涂覆纖維連接蛋白的24孔板中；置于24孔板中的去細胞豬小腸黏膜組織的厚度為0.2mm；

b.將含有間充質干細胞，濃度為300000個/ml的培養基懸濁液注入24孔板中；注入24孔板中的間充質干細胞的培養基體積為50μl，即懸濁液的液面高度等于0.25mm；

c.將24孔板放置于培養箱中4小時后，繼續添加培養基，新增加的培養基的量為最初注入24孔板中的含有間充質干細胞的培養基懸濁液體積的10倍，為500μl；

d.將間充質干細胞與去細胞豬小腸黏膜組織共培養7天得到本實施例的細胞培養模型，在培養期間每48小時將培養基完全更換一次。

本實施例構建的間充質干細胞與去細胞豬小腸黏膜組織體外共培養模型如圖3所示，從圖3可見細胞向去細胞組織內部的遷移，體現去細胞組織再細胞化進展良好。

最后應說明的是：以上各實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發明各實施例技術方案的范圍。