本發明(ming)屬于醫藥技術領域(yu)，具體(ti)涉(she)及吡啶酮(tong)類衍生物及其制備方(fang)法與制藥用(yong)途。

背景技術：

乙型病(bing)(bing)毒(du)性(xing)(xing)(xing)肝(gan)(gan)(gan)(gan)炎(yan)(viral hepatitis type B)，簡稱乙肝(gan)(gan)(gan)(gan)(Hepatitis B)，是由乙型肝(gan)(gan)(gan)(gan)炎(yan)病(bing)(bing)毒(du)(HBV)所致的(de)重(zhong)大傳染(ran)(ran)(ran)性(xing)(xing)(xing)疾病(bing)(bing)，長期發(fa)展可(ke)導致急慢(man)(man)性(xing)(xing)(xing)病(bing)(bing)毒(du)性(xing)(xing)(xing)肝(gan)(gan)(gan)(gan)炎(yan)、重(zhong)型肝(gan)(gan)(gan)(gan)炎(yan)、肝(gan)(gan)(gan)(gan)硬化和(he)原發(fa)性(xing)(xing)(xing)肝(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)胞癌(ai)(hepatocellular carcinoma,HCC)。據(ju)世界衛生組織(WHO)報(bao)道，全球(qiu)近20億(yi)人曾(ceng)感染(ran)(ran)(ran)過(guo)HBV，其(qi)中約2.4億(yi)人為慢(man)(man)性(xing)(xing)(xing)HBV感染(ran)(ran)(ran)者(zhe)，平均每年約有(you)78萬人死(si)于HBV感染(ran)(ran)(ran)所致的(de)急、慢(man)(man)性(xing)(xing)(xing)肝(gan)(gan)(gan)(gan)炎(yan)及(ji)相關并(bing)發(fa)癥。目(mu)前用(yong)于預防和(he)治療(liao)慢(man)(man)性(xing)(xing)(xing)乙型肝(gan)(gan)(gan)(gan)炎(yan)(CHB)的(de)藥(yao)物主要有(you)疫苗、干擾素、免疫調節藥(yao)以及(ji)DNA聚合酶抑(yi)制(zhi)劑。但是由于它們存在耐藥(yao)性(xing)(xing)(xing)、副作用(yong)、停藥(yao)后(hou)反彈(dan)和(he)不能徹底的(de)清除乙肝(gan)(gan)(gan)(gan)病(bing)(bing)毒(du)等缺(que)點，因(yin)此發(fa)現和(he)研(yan)究新的(de)安全、高效、低毒(du)和(he)抗耐藥(yao)性(xing)(xing)(xing)的(de)非核(he)苷類乙肝(gan)(gan)(gan)(gan)病(bing)(bing)毒(du)抑(yi)制(zhi)劑顯得至關重(zhong)要。

雜環化合物(wu)是發現藥物(wu)活性(xing)(xing)(xing)先導物(wu)的(de)(de)(de)重要源泉。取代吡(bi)啶(ding)酮作(zuo)為結(jie)構獨特的(de)(de)(de)一(yi)類雜環“優勢結(jie)構”，具(ju)有廣泛的(de)(de)(de)生物(wu)活性(xing)(xing)(xing)。它可以作(zuo)為構成(cheng)藥效(xiao)團的(de)(de)(de)基本結(jie)構母核(he)，以適合藥物(wu)特殊作(zuo)用靶(ba)點的(de)(de)(de)空(kong)間要求；還可以作(zuo)為活性(xing)(xing)(xing)取代基或環系的(de)(de)(de)組成(cheng)部(bu)分而產生相(xiang)應的(de)(de)(de)生物(wu)活性(xing)(xing)(xing)；另外雜環具(ju)有較好的(de)(de)(de)體內代謝穩定性(xing)(xing)(xing)及生物(wu)相(xiang)容性(xing)(xing)(xing)，對(dui)發現高效(xiao)廣譜、生物(wu)利用度好的(de)(de)(de)新型抗HBV藥物(wu)具(ju)有重要意義。

本發明基于2-吡(bi)啶酮類乙肝病毒(du)抑制劑藥效團(tuan)模型和活性(xing)構象，采用分子雜合(he)和電子等排(pai)藥物(wu)設計策(ce)略，設計合(he)成了一系列吡(bi)啶酮類化合(he)物(wu)，此類化合(he)物(wu)在現有技(ji)術(shu)中未見相關(guan)報道(dao)。

技術實現要素：

針(zhen)對現有(you)技(ji)術的(de)不足，本發(fa)明提(ti)(ti)供了(le)(le)吡啶酮(tong)類(lei)衍生物(wu)(wu)及(ji)其(qi)制備方法，本發(fa)明還提(ti)(ti)供了(le)(le)上述化(hua)合物(wu)(wu)作為非核苷類(lei)HBV抑(yi)制劑的(de)活性篩選結(jie)果(guo)及(ji)其(qi)應用。

本發明的技術(shu)方案(an)如下：

一.吡啶酮類衍生物

本發明涉及的(de)吡啶(ding)酮類衍生物(wu)，具有如下(xia)通(tong)式(shi)I或II所示(shi)的(de)結構(gou)：

其中，

R¹為含取代基的苯環；

R²為含取代基的苯環；

R³為羥基或者鹵原子；

R⁴為硝基或者氨基。

根據本發明優選的，通式I或II中，R¹為含3-甲基、4-甲氧基、4-乙氧基、2,5-二甲基、3,4-二甲基、3,5-二甲基取代、3-氟-4-甲氧基、3,4-甲氧基取代的苯環；R²為含2-羥基、2-羥基-4-甲氧基、2-羥基-3-甲氧基、2-羥基-5甲氧基、2-羥基-4-氟、2-羥基-4-氯、2-羥基-4-三氟甲基、2-羥基-3-甲基取代的苯環、R³為羥基或者氯原子；R⁴為硝基或者氨基。

進(jin)一步優選的，吡啶酮類衍生(sheng)物(wu)是具(ju)有(you)下(xia)列結構的化合物(wu)之(zhi)一：

表1.化合物的結構式

二(er).吡啶酮(tong)類(lei)衍生物的制備方法

本發明吡啶酮類(lei)衍生物的制(zhi)備(bei)方法為(wei)下列之一：

1.吡啶(ding)酮類衍(yan)生物(wu)的制(zhi)備方法，以5-硝(xiao)基(ji)-2-吡啶(ding)酮為原料，經過溴代、鈴木反應(ying)(ying)、還原反應(ying)(ying)得(de)到中間體(ti)化合(he)物(wu)4，在1-(3-二甲氨基(ji)丙基(ji))-3-乙基(ji)碳二亞胺鹽(yan)酸鹽(yan)、1-羥基(ji)苯并(bing)三唑的作用下，以N,N-二甲基(ji)甲酰胺為溶劑反應(ying)(ying)得(de)到目(mu)標(biao)產物(wu)5：

合成路線一如下：

試劑及條件(jian):(i)N-溴代丁(ding)二(er)酰(xian)亞(ya)胺，水(shui)，25℃；(ii)四三苯基膦鈀，碳(tan)酸(suan)鉀，水(shui)，1,4-二(er)氧(yang)六環，氮氣(qi)，不(bu)同取代的(de)苯硼酸(suan)，100℃；(iii)10％鈀碳(tan)，氫氣(qi)，甲(jia)醇(chun)，25℃；(iv)N,N-二(er)甲(jia)基甲(jia)酰(xian)胺，1-(3-二(er)甲(jia)氨(an)基丙基)-3-乙基碳(tan)二(er)亞(ya)胺鹽(yan)酸(suan)鹽(yan)，1-羥(qian)基苯并三唑，不(bu)同取代的(de)苯甲(jia)酸(suan)，70℃；

其中，R¹、R²同上述通式I或II中所(suo)述。

本發(fa)明(ming)所(suo)述的吡啶(ding)酮類衍(yan)生物的制(zhi)備方法(fa)，具體制(zhi)備步驟如下：

(1)將5-硝基吡啶-2-醇35.7mmol溶于500mL水(shui)中，緩慢(man)加入N-溴代(dai)丁二(er)酰(xian)亞胺35.7mmol，25℃下攪拌(ban)3-4小時，薄層色(se)譜(pu)檢測(ce)反(fan)應完全，減壓抽濾，固(gu)體產物(wu)水(shui)洗，石油醚(mi)洗，干(gan)燥，得化合物(wu)2；

(2)將(jiang)2.28mmol的中(zhong)(zhong)間(jian)體化合(he)物2和(he)不同取(qu)代基(ji)的苯(ben)硼(peng)酸(suan)(suan)(suan)2.51mmol溶(rong)于4mL水、16mL 1,4-二(er)氧六環的混(hun)合(he)溶(rong)劑中(zhong)(zhong)，緩慢加入碳酸(suan)(suan)(suan)鉀(jia)6.84mmol，充入氮氣，加入四三苯(ben)基(ji)膦(lin)鈀(ba)137μmol，氮氣置換后25℃攪拌20min，在100℃條件下(xia)加熱回(hui)流，過夜(ye)反應；薄層色譜檢(jian)測(ce)反應完全(quan)，減壓蒸(zheng)餾除去部分(fen)1,4-二(er)氧六環，加水和(he)乙酸(suan)(suan)(suan)乙酯萃取(qu)3次(ci)，合(he)并有機相，用飽和(he)食(shi)鹽水洗(xi)1次(ci)，用無水硫酸(suan)(suan)(suan)鈉進行(xing)干燥，旋蒸(zheng)除去乙酸(suan)(suan)(suan)乙酯，甲醇重結(jie)晶得到中(zhong)(zhong)間(jian)體3；

(3)將中間體化合物3 2.46mmol與10％鈀碳123μmol溶于20mL無水甲醇中，置換H₂，25℃下過夜(ye)反(fan)應(ying)；薄(bo)層色(se)譜檢測(ce)反(fan)應(ying)完全，加入10mL無(wu)水甲醇，用硅藻土熱抽(chou)濾，用甲醇洗固體(ti)殘(can)渣3次，濃縮(suo)得到(dao)中間體(ti)4；

(4)將(jiang)不同取(qu)代基(ji)的苯甲(jia)酸347μmol溶于6mL無水N,N-二(er)甲(jia)基(ji)甲(jia)酰胺中，25℃下(xia)(xia)攪拌10min，緩(huan)慢加(jia)入(ru)1-(3-二(er)甲(jia)氨基(ji)丙基(ji))-3-乙(yi)(yi)基(ji)碳二(er)亞胺鹽酸鹽452μmol，1-羥基(ji)苯并三(san)唑452μmol，25℃下(xia)(xia)攪拌10min，加(jia)入(ru)中間體化(hua)合物4 347μmol，置換氮氣，25℃下(xia)(xia)攪拌10min之后(hou)70℃回流過(guo)夜(ye)反(fan)應；薄(bo)層色譜檢測反(fan)應完全(quan)，將(jiang)反(fan)應液冷卻到25℃，加(jia)水和乙(yi)(yi)酸乙(yi)(yi)酯萃取(qu)3次，合并有機相，大量水洗有機相3次，飽和食(shi)鹽水洗1次，無水硫酸鈉干燥(zao)，硅膠柱純(chun)化(hua)處理得(de)到目(mu)標化(hua)合物5。

2.吡(bi)啶酮(tong)類衍生物的(de)(de)制備方法，以(yi)3-溴-5-硝(xiao)基(ji)-2-吡(bi)啶酮(tong)為原料，經過鈴(ling)木反應、三(san)(san)氯氧磷的(de)(de)氯代、還原反應得(de)到中間(jian)體7，在1-(3-二甲氨基(ji)丙基(ji))-3-乙基(ji)碳(tan)二亞胺(an)鹽酸鹽、1-羥(qian)基(ji)苯并(bing)三(san)(san)唑(zuo)的(de)(de)作(zuo)用下，以(yi)N,N-二甲基(ji)甲酰胺(an)為溶(rong)劑反應得(de)到目(mu)標產物8；

合成路線二如下：

試劑(ji)及條件(jian):(ii)四(si)三苯(ben)(ben)基(ji)膦(lin)鈀，碳(tan)酸(suan)鉀，水，1,4-二氧六環，氮(dan)氣，不同取代的苯(ben)(ben)硼酸(suan)，100℃；(v)三氯氧磷，90℃；(vi)鐵粉(fen)，氯化銨，水，甲(jia)(jia)醇，78℃；(vi)N,N-二甲(jia)(jia)基(ji)甲(jia)(jia)酰胺(an)，1-(3-二甲(jia)(jia)氨基(ji)丙基(ji))-3-乙基(ji)碳(tan)二亞胺(an)鹽酸(suan)鹽，1-羥(qian)基(ji)苯(ben)(ben)并三唑，不同取代的苯(ben)(ben)甲(jia)(jia)酸(suan)；

其中，R¹、R²同上述通(tong)式(shi)I或II中(zhong)所(suo)述。

本發明所述的吡(bi)啶酮類(lei)衍生(sheng)物的制(zhi)(zhi)備(bei)方法(fa)，具體制(zhi)(zhi)備(bei)步(bu)驟如下：

(1)將2.28mmol的起始(shi)原料3-溴(xiu)-5-硝基-2-吡啶(ding)酮2和不同取代基的苯(ben)硼酸(suan)2.51mmol溶于4mL水(shui)(shui)、16mL 1,4-二氧六(liu)環的混合溶劑中，加(jia)入(ru)碳酸(suan)鉀6.84mmol，充入(ru)氮氣，加(jia)入(ru)四三苯(ben)基膦靶137μmol，氮氣置(zhi)換后25℃攪拌20min，在100℃條件下(xia)加(jia)熱回(hui)流，過夜反應(ying)；薄層色譜檢測反應(ying)完全，減壓蒸餾除(chu)去(qu)部分1,4-二氧六(liu)環，加(jia)水(shui)(shui)和乙(yi)酸(suan)乙(yi)酯(zhi)萃取3次(ci)(ci)，合并(bing)有機相，用(yong)飽和食鹽水(shui)(shui)洗1次(ci)(ci)，用(yong)無水(shui)(shui)硫(liu)酸(suan)鈉進行(xing)干(gan)燥，旋(xuan)蒸除(chu)乙(yi)酸(suan)乙(yi)酯(zhi)，甲醇重結晶得到中間體3；

(2)將中間(jian)體化合物3 1.22mmol加(jia)入(ru)(ru)6mL三氯氧磷中，90℃反應(ying)5小(xiao)時；薄層色譜(pu)檢測(ce)反應(ying)完全(quan)，倒入(ru)(ru)50mL冰水(shui)中，用碳酸氫鈉(na)水(shui)溶(rong)液中和，乙(yi)酸乙(yi)酯萃取，無水(shui)硫酸鈉(na)干燥(zao)，層析柱分(fen)離，重結(jie)晶得(de)到中間(jian)體6；

(3)將(jiang)鐵粉2.64mmol加入(ru)到3mL甲醇(chun)和3mL水(shui)的(de)氯化(hua)銨2.64mmol混合(he)液中(zhong)，緩(huan)慢(man)加入(ru)中(zhong)間(jian)體(ti)化(hua)合(he)物6，在78℃下(xia)反應；薄層色(se)譜(pu)檢測反應完全，布氏漏(lou)斗熱抽濾，乙(yi)(yi)醇(chun)洗(xi)，加入(ru)水(shui)和乙(yi)(yi)酸乙(yi)(yi)酯萃取3次(ci)，合(he)并有機相，用(yong)飽和食鹽(yan)水(shui)洗(xi)1次(ci)，用(yong)無水(shui)硫酸鈉進(jin)行干燥，旋(xuan)蒸除乙(yi)(yi)酸乙(yi)(yi)酯，重結晶得(de)到中(zhong)間(jian)體(ti)化(hua)合(he)物7；

(4)將不同取代基(ji)(ji)的苯甲(jia)酸(suan)341μmol溶于(yu)6mL無水N,N-二(er)(er)甲(jia)基(ji)(ji)甲(jia)酰胺(an)中，25℃下攪(jiao)拌(ban)10min，緩(huan)慢加入(ru)1-(3-二(er)(er)甲(jia)氨基(ji)(ji)丙基(ji)(ji))-3-乙(yi)基(ji)(ji)碳二(er)(er)亞胺(an)鹽酸(suan)鹽443μmol，1-羥基(ji)(ji)苯并三唑443μmol，25℃下攪(jiao)拌(ban)10min，加入(ru)中間體化合(he)物7 341μmol，置換氮氣，25℃下攪(jiao)拌(ban)10min之后(hou)70℃回流過(guo)夜反(fan)應；薄(bo)層色譜檢測(ce)反(fan)應完全(quan)，將反(fan)應液冷卻到(dao)(dao)25℃，加水和乙(yi)酸(suan)乙(yi)酯萃取3次，合(he)并有機相，大量(liang)水洗有機相3次，飽和食鹽水洗1次，無水硫(liu)酸(suan)鈉干燥，硅膠柱純(chun)化處理得到(dao)(dao)目(mu)標化合(he)物8。

三.吡(bi)啶(ding)酮(tong)類衍生(sheng)物(wu)的應用(yong)

本發(fa)明公開(kai)了吡(bi)(bi)啶(ding)酮類衍(yan)生(sheng)物抗HBV活性篩選結果及(ji)其(qi)作為抗HBV抑(yi)(yi)制劑的應(ying)用。通過(guo)實驗證明本發(fa)明的吡(bi)(bi)啶(ding)酮類衍(yan)生(sheng)物可作為經典的HBV非核苷類抑(yi)(yi)制劑應(ying)用。

對上述新合成的化合物(化合物的結構式見表1)運用酶聯免疫法(ELISA)檢測樣品藥物達到抑制病毒HBeAg和HBsAg分泌的50％時的濃度數值為IC₅₀；運用CCK-8法檢測樣品藥物導致50％細胞毒性死亡的數值濃度為CC₅₀值；用聚合酶鏈反應(PCR)檢測藥物抑制HBV DNA復制量的50％時的濃度數值IC₅₀，以拉米夫定(ding)作為陽性(xing)(xing)對(dui)照藥。它們的(de)抗HBV活(huo)性(xing)(xing)和毒(du)(du)性(xing)(xing)數據列于表2中。由(you)表2看(kan)出新合成的(de)化(hua)合物部分呈現出較好抑制病毒(du)(du)HBeAg和HBsAg分泌活(huo)性(xing)(xing)，但有一定(ding)的(de)細胞毒(du)(du)性(xing)(xing)。

本發明的吡(bi)啶(ding)酮(tong)類衍生物是一類結構新(xin)穎的非(fei)核苷類HBV抑制(zhi)劑，可作為(wei)抗HBV的先導(dao)化合(he)物。

本發明的吡(bi)啶酮類衍生物可作為非核苷類HBV抑制劑應(ying)用。具體(ti)地說，作為HBV抑制劑用來制備(bei)抗乙(yi)肝藥物。

一種抗HBV藥物(wu)組合物(wu)，包括本發明的吡啶酮類(lei)衍生(sheng)物(wu)和一種或(huo)多種藥學上(shang)可接(jie)受載體或(huo)賦形劑。

本發明(ming)公開了(le)吡啶酮(tong)類衍生(sheng)物(wu)、其(qi)(qi)制(zhi)備(bei)方法、抗(kang)HBV活性篩選(xuan)結果及其(qi)(qi)作為抗(kang)HBV抑制(zhi)劑(ji)的首次應用。實驗證明(ming)本發明(ming)的吡啶酮(tong)類衍生(sheng)物(wu)可作為HBV抑制(zhi)劑(ji)用于(yu)制(zhi)備(bei)抗(kang)乙肝藥(yao)物(wu)。

具體實施方式

通過下述實(shi)例(li)有助于理解本發明，但是不能限制本發明的內容(rong)，在下列(lie)實(shi)例(li)中，所有目標化合物的編號與表(biao)1相同(tong)。

合成路線：

試劑(ji)及條件(jian):(i)N-溴代丁(ding)二(er)酰亞(ya)胺，水，25℃；(ii)四三(san)苯(ben)基(ji)膦鈀(ba)，碳(tan)酸(suan)(suan)鉀，水，1,4-二(er)氧六環，氮(dan)氣(qi)(qi)，不(bu)同(tong)取代的苯(ben)硼酸(suan)(suan)，100℃；(iii)10％鈀(ba)碳(tan)，氫氣(qi)(qi)，甲(jia)醇，25℃；(iv)N,N-二(er)甲(jia)基(ji)甲(jia)酰胺，1-(3-二(er)甲(jia)氨基(ji)丙基(ji))-3-乙(yi)基(ji)碳(tan)二(er)亞(ya)胺鹽酸(suan)(suan)鹽，1-羥基(ji)苯(ben)并三(san)唑(zuo)，不(bu)同(tong)取代的苯(ben)甲(jia)酸(suan)(suan)。

實施例1.化(hua)合物2的(de)制備

取1L單口(kou)瓶(ping)，將5-硝(xiao)基吡啶(ding)-2-醇(5g,35.7mmol)溶于500mL水(shui)中，緩慢加入N-溴代(dai)丁二酰亞(ya)胺(3g,35.7mmol)，25℃下攪拌3小時；薄層色譜檢測反應完全，抽(chou)濾，水(shui)洗(100mL)，石油(you)醚(mi)洗(50mL)，干燥，稱重(zhong)，得(de)到淡黃色固體7.09g，產率90％。

化合物2波譜數據：¹H-NMR(400MHz,CD₃OD)δppm:8.68(d,2H,J＝2.8Hz),8.66(d,2H,J＝2.8Hz).

實施例2.化(hua)合物(wu)3a的制備

取(qu)100mL無氧(yang)反應瓶(ping)，將化合(he)物(wu)2(2g,9.13mmol)和對甲氧(yang)基苯硼酸(1.53g,10.05mmol)溶于水(shui)(shui)(15mL)和1,4二氧(yang)六環(45mL)的混合(he)溶液中，加入碳酸鉀(3.79g,27.4mmol)，置換(huan)(huan)氮氣(qi)，迅速(su)加入四三苯基膦鈀(ba)(0.63g,0.55mmol)；再次置換(huan)(huan)氮氣(qi)，100℃回流反應。反應結束(shu)后，旋蒸部分1,4二氧(yang)六環，加入水(shui)(shui)(60mL)，乙酸乙酯萃取(qu)(25mL x 3)，合(he)并有機相，飽和食鹽水(shui)(shui)洗(50mL x 3)，無水(shui)(shui)硫酸鈉干(gan)燥，濃縮，甲醇洗，獲(huo)取(qu)黃色固體(ti)3a1.2g，收率(lv)為53％，熔點：212-215℃。

化合物1的波譜數據：¹H-NMR(400MHz,DMSO)δppm:12.80(s,1H),8.62(d,J＝3.1Hz,1H),8.15(d,J＝3.0Hz,1H),7.72(d,J＝8.8Hz,2H),6.99(d,J＝8.8Hz,2H),3.80(s,3H)；¹³C-NMR(75MHz,DMSO):161.21,159.39,136.30,130.37,129.59,129.56,128.64,126.97,113.57,55.15；ESI-MS:247.3[M+H]⁺,269.4[M+Na]⁺.

實施例(li)3.化合物4a的制備

將(jiang)化合物(wu)3a(300mg,1.22mmol)溶(rong)于12mL甲醇(chun)，加入10％鈀碳(tan)(65mg,10％)，置(zhi)換氫氣，25℃攪拌過夜。反應(ying)結束后，加入甲醇(chun)(20mL)，硅藻土(tu)抽(chou)濾(lv)，甲醇(chun)(15mL x2)洗，收集濾(lv)液，濃縮，得到黃褐(he)色(se)固體化合物(wu)4a 220mg，收率為(wei)83％。

化合物4a波譜分析數據：ESI-MS:217.5[M+H]⁺,433.6[2M+H]⁺.

實施例4.化合物5a1的制備

取25mL圓底燒瓶(ping)，將(jiang)化合物鄰羥基(ji)(ji)苯(ben)甲(jia)酸(141mg,1.02mmol)溶于10mL N,N-二(er)(er)甲(jia)基(ji)(ji)甲(jia)酰胺(an)中(zhong)，然后(hou)(hou)低溫下緩慢加(jia)入1-(3-二(er)(er)甲(jia)氨基(ji)(ji)丙基(ji)(ji))-3-乙基(ji)(ji)碳二(er)(er)亞胺(an)鹽(yan)酸鹽(yan)(254mg,1.32mmol)和1-羥基(ji)(ji)苯(ben)并(bing)三唑(179mg,1.32mmol)，攪拌(ban)10分(fen)鐘；加(jia)入4a(220mg,1.02mmol)，滴(di)加(jia)三乙胺(an)(514mg,5.09mmol)，80℃反應過夜。反應結束后(hou)(hou)加(jia)入60mL水，乙酸乙酯萃取三次(40mL x 3)，合并(bing)有(you)機相，40mL飽和食(shi)鹽(yan)水洗一次，無水硫酸鈉干燥；濃縮，干法上樣，快速制備色譜硅膠柱(二(er)(er)氯甲(jia)烷：甲(jia)醇＝10：1)分(fen)離獲取淡黃色固體化合物5a1 120mg，收(shou)率為36％，熔點：249-252℃。

化合物5a1波譜數據：¹H NMR(400MHz,DMSO)δppm:11.71(s,2H),10.19(s,1H),7.93(dd,J＝7.9,1.1Hz,1H),7.87(d,J＝2.8Hz,1H),7.82(d,J＝2.8Hz,1H),7.73(t,J＝5.8Hz,2H),7.50–7.39(m,1H),7.03–6.91(m,4H),3.79(s,3H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO):167.44,160.11,159.48,159.30,134.68,134.28,129.80,129.43,129.04,128.98,126.63,119.38,119.23,117.80,116.96,113.89,55.59；ESI-MS:337.5[M+H]⁺.

實(shi)施例5.化(hua)合物5a2的制備

操作(zuo)同(tong)實(shi)施例4，所不(bu)同(tong)的是將鄰(lin)羥基(ji)苯甲(jia)酸(suan)換成2-羥基(ji)-4-甲(jia)氧(yang)基(ji)苯甲(jia)酸(suan)。黃色(se)固體(ti)，收率12％，熔(rong)點：252-256℃。

化合物5a2波譜數據：¹H NMR(400MHz,DMSO)δppm:12.43(s,1H),11.68(s,1H),10.01(s,1H),7.93(d,J＝8.9Hz,1H),7.81(d,J＝3.4Hz,2H),7.74(d,J＝8.8Hz,2H),6.98(d,J＝8.8Hz,2H),6.56(dd,J＝8.9,2.5Hz,1H),6.49(d,J＝2.5Hz,1H),3.80(d,J＝3.7Hz,6H)；¹³C NMR(75MHz,DMSO):165.77,159.59,159.40,158.80,137.54,134.03,130.32,129.29,128.95,128.51,126.12,119.15,118.62,116.86,116.10,113.39,55.09；ESI-MS:367.3[M+H]⁺.

實施例6.化合物5a3的制備

操作同實施例4，所不同的是(shi)將鄰羥(qian)(qian)基(ji)苯甲(jia)酸換成2-羥(qian)(qian)基(ji)-3-甲(jia)氧基(ji)苯甲(jia)酸。黃色固(gu)體，收率16％。

化合物5a3波譜數據¹H NMR(400MHz,DMSO)δppm:11.65(s,1H),11.34(s,1H),10.11(s,1H),7.79(d,J＝2.8Hz,1H),7.73(d,J＝2.8Hz,1H),7.70–7.62(m,1H),7.41(d,J＝3.1Hz,1H),7.01(dd,J＝8.9,3.1Hz,1H),6.91(d,J＝8.9Hz,1H),6.85(d,J＝8.9Hz,1H),3.72(s,1H),3.69(s,1H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO):166.95,160.12,159.29,153.28,152.19,134.74,129.83,129.45,129.01,126.69,121.21,119.17,118.68,116.94,113.88,112.65,56.19,55.59；ESI-MS:367.3[M+H]⁺.

實(shi)施例7.化合物5a4的制備

操作同(tong)實施例4，所不同(tong)的是將鄰羥基苯(ben)甲(jia)酸換成2-羥基-4-氯苯(ben)甲(jia)酸。黃色固(gu)體(ti)，收率31％，熔點(dian)：262-266℃。

化合物5a4波譜數據：¹H NMR(400MHz,DMSO)δppm:12.16(s,2H),10.16(s,1H),7.93(d,J＝9.0Hz,1H),7.86(d,J＝2.7Hz,1H),7.80(d,J＝2.8Hz,1H),7.73(d,J＝8.8Hz,2H),7.06(s,1H),7.03(d,J＝1.9Hz,1H),6.98(d,J＝8.8Hz,2H),3.79(s,3H)；ESI-MS:371.4[M+H]⁺.

實(shi)施例8.化合物5a5的制備

操(cao)作同實(shi)施(shi)例4，所不同的是(shi)將鄰羥基(ji)苯甲酸(suan)換成2-羥基(ji)-4-甲基(ji)苯甲酸(suan)。黃色固(gu)體(ti)，收率25％，熔(rong)點：250-254℃。

化合物5a5波譜數據：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ11.98(s,1H),11.68(s,1H),10.09(s,1H),7.91–7.79(m,3H),7.74(d,J＝8.8Hz,2H),6.98(d,J＝8.8Hz,2H),6.79(t,J＝3.2Hz,2H),3.79(s,3H),2.30(s,3H)；¹³C NMR(75MHz,DMSO)δ167.25,159.59,159.46,158.79,144.48,134.23,129.29,128.88,128.55,128.14,126.17,119.91,118.68,117.52,113.39,113.20,55.09,21.07；ESI-MS:351.5[M+H]⁺.

實施(shi)例9.化合物(wu)5a6的制備

操作同實施(shi)例(li)4，所不同的(de)是(shi)將鄰羥基苯甲(jia)(jia)酸(suan)換成2-羥基-4-三氟甲(jia)(jia)基苯甲(jia)(jia)酸(suan)。黃色固體，收率16％。

化合物5a6波譜數據：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ11.96(s,1H),11.69(s,1H),10.27(s,1H),8.03(d,J＝8.0Hz,1H),7.92(d,J＝2.7Hz,1H),7.80(d,J＝2.8Hz,1H),7.73(d,J＝8.8Hz,2H),7.30(d,J＝9.2Hz,2H),6.98(d,J＝8.8Hz,2H),3.79(s,3H)；¹³C NMR(75MHz,DMSO)δ164.87,159.58,158.62,157.79,133.73,132.74(d,²J_F-C＝32Hz),130.29,129.29,129.03,128.50,123.94(d,¹J_F-C＝280Hz),125.29,122.07,121.68,118.82,115.26(q,³J_F-C＝4Hz),113.58(t,³J_F-C＝4Hz),113.40,55.10；ESI-MS:405.5[M+H]⁺.

實施例10.化合(he)物5a7的制備

操(cao)作(zuo)同(tong)實施例4，所不(bu)同(tong)的是將鄰(lin)羥基苯(ben)甲酸(suan)換成(cheng)2-羥基-3-甲氧基苯(ben)甲酸(suan)。黃色固體，收(shou)率16％。

化合物5a7波譜數據：¹H NMR(400MHz,DMSO)δppm:11.86(s,1H),11.71(s,1H),10.15(s,1H),7.83(dd,J＝8.8,2.8Hz,2H),7.73(d,J＝8.8Hz,2H),7.51(dd,J＝8.1,1.1Hz,1H),7.16(dd,J＝8.0,0.9Hz,1H),6.98(d,J＝8.9Hz,2H),6.90(t,J＝8.1Hz,1H),3.82(s,3H),3.79(s,3H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO):168.10,160.11,159.31,150.24,148.93,134.69,129.78,129.41,129.03,126.80,119.73,119.08,118.70,116.66,116.04,113.91,56.38,55.60；ESI-MS:367.3[M+H]⁺.

實(shi)施例11.化合物3b的制備

取100mL無氧(yang)反(fan)應(ying)(ying)瓶，將化合(he)物(wu)2(2g,9.13mmol)和3-甲基(ji)苯硼酸(suan)(1.37g,10.05mmol)溶于水(shui)(shui)(15mL)和1,4二氧(yang)六環(45mL)的混合(he)溶液中，加入碳(tan)酸(suan)鉀(3.79g,27.4mmol)，置換(huan)氮(dan)氣(qi)，迅(xun)速(su)加入四三苯基(ji)膦鈀(ba)(0.63g,0.55mmol)；再次(ci)置換(huan)氮(dan)氣(qi)，100℃回流反(fan)應(ying)(ying)。反(fan)應(ying)(ying)結(jie)束后，旋蒸(zheng)部(bu)分(fen)1,4二氧(yang)六環，加入水(shui)(shui)(60mL)，乙(yi)酸(suan)乙(yi)酯(zhi)萃取(25mL x 3)，合(he)并有機相，飽和食(shi)鹽水(shui)(shui)洗(xi)(xi)(50mL x 3)，無水(shui)(shui)硫(liu)酸(suan)鈉干燥；濃縮(suo)，甲醇洗(xi)(xi)，得取黃色固體3b1.4g，收(shou)率為77％。

實施例12.化合物4b的制備

將化合(he)物(wu)3b(2.1mg,9.12mmol)溶于84mL甲(jia)醇(chun)，加入(ru)10％鈀碳(490mg,10％)，置(zhi)換氫氣，25℃攪拌(ban)過夜。反(fan)應結束后，加入(ru)甲(jia)醇(chun)(80mL)，硅藻土抽濾(lv)，甲(jia)醇(chun)洗(50mL x 2)，收集濾(lv)液，濃縮，得到(dao)黃(huang)褐(he)色固體化合(he)物(wu)4b。

實(shi)施例13.化合(he)物5b1的制(zhi)備

取25mL圓底燒瓶，將化(hua)合(he)物鄰羥(qian)基苯甲酸(138mg,1.02mmol)溶于10mL N,N-二甲基甲酰胺中，然后低溫下緩慢加(jia)(jia)入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(249mg,1.3mmol)和(he)1-羥(qian)基苯并(bing)三(san)唑(175mg,1.3mmol)，攪拌(ban)10分鐘；加(jia)(jia)入5a(200mg,1.0mmol)，滴加(jia)(jia)三(san)乙胺(505mg,5.0mmol)，80℃反應(ying)過夜。反應(ying)結束后加(jia)(jia)入60mL水(shui)，乙酸乙酯萃(cui)取三(san)次(40mL x 3)，合(he)并(bing)有機相(xiang)，40mL飽(bao)和(he)食鹽水(shui)洗一(yi)次，無水(shui)硫酸鈉(na)干(gan)燥；濃縮，干(gan)法(fa)上樣，快速制備色(se)譜硅膠柱(石(shi)油醚：乙酸乙酯：醋(cu)酸＝60:30:1)分離，石(shi)油醚-乙酸乙酯重結晶得紅棕色(se)固體(ti)化(hua)合(he)物5b1 58mg，收(shou)率為18％。

化合物5b1波譜數據：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ11.88(s,1H),11.77(s,1H),10.19(s,1H),7.94(dd,J＝7.9,1.4Hz,1H),7.91(d,J＝2.8Hz,1H),7.85(d,J＝2.8Hz,1H),7.55(d,J＝7.1Hz,1H),7.49–7.39(m,1H),7.30(t,J＝8.0Hz,1H),7.16(d,J＝7.7Hz,1H),6.96(dd,J＝12.4,4.6Hz,1H),2.35(s,1H)；¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ167.45,160.02,159.45,137.43,136.72,135.78,134.32,129.89,129.14,128.99,128.68,128.36,127.30,125.81,119.41,119.21,117.80,116.94,40.59,40.39,40.18,39.97,39.76,39.55,39.34,21.60；ESI-MS:321.4[M+H]⁺.

實施例14.化(hua)合物5b2的制備

操作同(tong)實(shi)施例(li)13，所不同(tong)的是將鄰羥基(ji)苯(ben)甲酸(suan)換成2-羥基(ji)-4-甲氧基(ji)苯(ben)甲酸(suan)。淺黃色固體(ti)，收(shou)率11％，熔點：254-257℃。

化合物5b2波譜數據：¹H NMR(300MHz,DMSO)δ12.41(s,1H),11.84(s,1H),10.01(s,1H),7.93(d,J＝8.7Hz,1H),7.84(s,2H),7.55(d,J＝6.0Hz,1H),7.29(t,J＝7.8Hz,1H),7.15(d,J＝7.5Hz,1H),6.57(dd,J＝8.7Hz,2.4Hz,1H),6.49(d,J＝2.4Hz,1H),3.80(s,3H),2.35(s,3H)；¹³C NMR(75MHz,DMSO):167.53,163.84,162.06,159.49,136.90,136.24,135.46,129.47,129.30,128.61,128.14,127.82,126.98,125.28,118.61,108.19,106.33,101.26,55.41,21.07；ESI-MS:351.5[M+H]⁺.

實施例15.化(hua)合物5b3的(de)制備

操作同(tong)實施例13，所不同(tong)的是將(jiang)鄰羥(qian)基(ji)苯甲酸(suan)(suan)換(huan)成(cheng)2-羥(qian)基(ji)-4-氯苯甲酸(suan)(suan)。淺黃色固體，收率25％，熔(rong)點：246-249℃。

化合物5b3光譜數據：¹H NMR(300MHz,DMSO)δppm:12.13(s,1H),11.86(s,1H),10.16(s,1H),7.93(dd,J＝6.6Hz,2.7Hz,1H),7.89(d,J＝2.7Hz,1H),7.83(d,J＝3.0Hz,1H),7.54(d,J＝6.6Hz,2H),7.29(t,J＝7.5Hz,1H),7.15(d,J＝7.5Hz,1H),7.05-7.03(m,2H),2.35(s,3H)；¹³C NMR(75MHz,DMSO):165.79,159.50,159.42,137.55,136.91,136.20,135.12,130.31,129.40,128.62,128.17,127.83,126.82,125.29,119.14,118.60,116.87,116.09,21.07；ESI-MS:355.4[M+H]⁺.

實施(shi)例16.化合物5b4的制備(bei)

操作同實施(shi)例13，所不同的是(shi)將鄰羥基苯甲酸(suan)換(huan)成2-羥基-4-氟(fu)苯甲酸(suan)。黃色固(gu)體，收率(lv)7.4％，熔點：236-239℃。

化合物5b4波譜數據：¹H NMR(300MHz,DMSO)δppm:12.33(s,1H),11.83(s,1H),10.16(s,1H),8.01(dd,J＝8.7Hz,6.6Hz,1H),7.87(d,J＝2.7Hz,1H),7.83(d,J＝3.0Hz,1H),7.54(d,J＝6.3Hz,2H),7.30(t,J＝7.5Hz,1H),7.15(d,J＝7.5Hz,1H),6.87-6.78(m,2H),2.35(s,3H)；¹³C NMR(75MHz,DMSO):165.03(d,¹J_CF＝248Hz),166.28,161.17(d,³J_CF＝12.7Hz),159.52,136.91,136.20,135.28,130.84(d,³J_CF＝11.3Hz),129.38,128.62,128.16,127.83,126.98,125.28,118.53,113.40(d,⁴J_CF＝3Hz),106.40(d,²J_CF＝22.5Hz),103.90(d,²J_CF＝24Hz),21.07；ESI-MS:339.4[M+H]⁺.

實施例17.化合物5b5的制備

操(cao)作(zuo)同實施例(li)13，所不同的是將鄰羥基(ji)苯(ben)甲(jia)酸換(huan)成2-羥基(ji)-4-甲(jia)基(ji)苯(ben)甲(jia)酸。白色固體，收率(lv)12％，熔點：248-252℃。

化合物5b5波譜數據：¹H NMR(300MHz,DMSO)δppm:11.87(s,2H),10.10(s,1H),7.88-7.84(m,3H),7.55(d,J＝6.3Hz,2H),7.29(dt,J＝7.8Hz,2.1Hz,1H),7.15(d,J＝7.5Hz,1H),6.80-6.78(m,2H),2.35(s,3H),2.30(s,3H)；¹³C NMR(75MHz,DMSO):167.26,159.49,159.46,144.51,136.90,136.23,135.31,129.32,128.62,128.14,127.83,126.86,125.29,119.91,118.65,117.53,113.18,21.08；ESI-MS:335.5[M+H]⁺.

實施例18.化(hua)合物5b6的制備

操(cao)作(zuo)同(tong)(tong)實施例(li)13，所不(bu)同(tong)(tong)的(de)是將(jiang)鄰羥基苯(ben)甲(jia)酸換成2-羥基-4-三氟甲(jia)基苯(ben)甲(jia)酸。黃色固體(ti)，收率26％，熔(rong)點(dian)：140-144℃。

化合物5b6波譜數據：¹H NMR(300MHz,DMSO)δppm:11.93(s,1H),11.85(s,1H),10.26(s,1H),8.04(d,J＝7.8Hz,1H),7.95(d,J＝2.7Hz,1H),7.84(d,J＝3.0Hz,1H),7.54(d,J＝6.9Hz,2H),7.32-7.27(m,3H),7.16(d,J＝7.5Hz,1H),2.35(s,3H)；¹³C NMR(75MHz,DMSO):164.89,159.49,157.80,136.91,136.19,134.82,132.77(d,²J_CF＝32.3Hz),128.40(d,¹J_CF＝283Hz),129.48,128.63,128.18,127.84,125.29,122.03,121.67,118.80,115.26(d,³J_CF＝3.8Hz),113.63(t,³J_CF＝3.8Hz),113.53,21.07；ESI-MS:389.4[M+H]⁺.

實(shi)施例(li)19.化合物5b7的制備

操作同實施例(li)13，所(suo)不同的是將鄰羥基(ji)苯(ben)(ben)甲(jia)(jia)酸換成2-羥基(ji)-3-甲(jia)(jia)氧基(ji)苯(ben)(ben)甲(jia)(jia)酸。棕(zong)色固體，收(shou)率23％，熔點：236-238℃。

化合物4b7波譜數據：¹H NMR(300MHz,DMSO)δppm:11.84(s,1H),11.77(s,1H),10.16(s,1H),7.87(dd,J＝9.0Hz,3.0Hz,2H),7.56-7.50(m,3H),7.30(t,J＝7.8Hz,1H),7.16(d,J＝7.5Hz,2H),6.90(t,J＝7.8Hz,1H),3.81(s,3H),2.35(s,3H)；¹³C NMR(75MHz,DMSO):167.62,159.51,149.76,148.44,136.91,136.22,135.25,129.36,128.60,128.17,127.84,126.99,125.27,119.23,118.57,118.19,116.15,115.58,55.89,21.08；ESI-MS:351.4[M+H]⁺.

實(shi)施例20.化合物5b8的制備

操作同實施例(li)13，所(suo)不(bu)同的是將(jiang)鄰羥基苯(ben)甲酸換成2-羥基-5-甲氧基苯(ben)甲酸。黃色固(gu)體(ti)，收(shou)率23％，熔點：125-128℃。

化合物5b8波譜數據：¹H NMR(300MHz,DMSO)δppm:11.78(s,2H),10.17(s,1H),7.89(dd,J＝19.8Hz,3.0Hz,2H),7.55(d,J＝6.9Hz,2H),7.48(d,J＝3.0Hz,1H),7.30(t,J＝7.8Hz,1H),7.15(d,J＝7.5Hz,1H),7.08(dd,J＝9.0Hz,3.0Hz,1H),6.92(d,J＝9.0Hz,1H),3.76(s,3H),2.35(s,3H)；¹³C NMR(75MHz,DMSO):166.50,159.51,152.82,151.70,136.90,136.21,135.29,129.39,128.64,128.16,127.82,126.90,125.31,120.72,118.65,118.17,116.40,112.19,55.71,21.07.

實(shi)施例21.化合物3c的制備

取100mL無(wu)氧反(fan)應(ying)瓶，將化合(he)物2(1g,4.6mmol)和4-乙氧基(ji)苯(ben)硼酸(suan)(0.83g,5.0mmol)溶(rong)于(yu)水(7mL)和1,4二氧六(liu)環(huan)(30mL)的混合(he)溶(rong)液(ye)中，加入碳酸(suan)鉀(1.89g,13.7mmol)，置換氮氣，迅速加入四(si)三苯(ben)基(ji)膦(lin)鈀(0.26g,0.23mmol)；再(zai)次置換氮氣，100℃回流反(fan)應(ying)。反(fan)應(ying)結束后(hou)，旋蒸部(bu)分(fen)1,4二氧六(liu)環(huan)，加入水(30mL)，乙酸(suan)乙酯萃取(15mL x 3)，合(he)并有機相，飽和食(shi)鹽水洗(25mL x 3)，無(wu)水硫(liu)酸(suan)鈉干燥；濃縮，甲醇洗，獲(huo)取黃色固體3c0.49g，熔點297℃～298℃，收率為41％。

化合物3c波譜數據：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ12.80(s,1H),8.62(d,J＝3.1Hz,1H),8.14(d,J＝3.0Hz,1H),7.70(d,J＝8.7Hz,2H),6.97(d,J＝8.8Hz,2H),4.07(q,J＝7.0Hz,2H),1.35(t,J＝7.0Hz,3H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ161.71,159.17,136.77,130.87,130.10,130.02,129.16,127.31,114.51,63.57,15.08；ESI-MS:261.2[M+H]⁺.

實施(shi)例22.化合物4c的制備

將化合物3c(1g,3.84mmol)溶于30mL甲醇(chun)(chun)，加(jia)入10％鈀碳(205mg,10％)，置換(huan)氫(qing)氣(qi)，25℃攪拌過夜。反應結束后，加(jia)入甲醇(chun)(chun)(40mL)，硅(gui)藻土(tu)抽濾(lv)，甲醇(chun)(chun)(25mL x 2)洗，收(shou)集濾(lv)液(ye)，濃縮，得到黃(huang)褐(he)色固體化合物4c 710mg，收(shou)率為80％。

實施例23.化(hua)合(he)物5c1的(de)制備(bei)

取25mL圓底燒瓶，將化(hua)(hua)合物鄰羥基(ji)(ji)苯甲(jia)酸(suan)(suan)(120mg,0.87mmol)溶于(yu)10mL N,N-二甲(jia)基(ji)(ji)甲(jia)酰胺(an)中，然后(hou)低溫下緩慢加(jia)入1-(3-二甲(jia)氨基(ji)(ji)丙(bing)基(ji)(ji))-3-乙(yi)(yi)基(ji)(ji)碳二亞胺(an)鹽酸(suan)(suan)鹽(217mg,1.13mmol)和(he)1-羥基(ji)(ji)苯并三(san)唑(153mg,1.13mmol)，攪拌10分鐘；加(jia)入5a(200mg,0.87mmol)，80℃反應(ying)過夜。反應(ying)結束后(hou)加(jia)入60mL水(shui)，乙(yi)(yi)酸(suan)(suan)乙(yi)(yi)酯(zhi)萃取三(san)次(40mL x 3)，合并有(you)機相(xiang)，40mL飽和(he)食鹽水(shui)洗一次，無水(shui)硫(liu)酸(suan)(suan)鈉干燥；濃縮，干法上樣，快速(su)制備(bei)色譜硅膠柱(zhu)(石油(you)醚：乙(yi)(yi)酸(suan)(suan)乙(yi)(yi)酯(zhi)：醋酸(suan)(suan)＝60:30:1)分離，石油(you)醚乙(yi)(yi)酸(suan)(suan)乙(yi)(yi)酯(zhi)重結晶獲取黃色固(gu)體化(hua)(hua)合物5b1 72mg，熔點218～221℃，收率為24％。

化合物5c1波譜數據：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ11.88(s,1H),11.69(s,1H),10.17(s,1H),7.94(dd,J＝7.8,1.3Hz,1H),7.87(d,J＝2.8Hz,1H),7.82(d,J＝2.8Hz,1H),7.77–7.68(m,2H),7.50–7.41(m,1H),7.03–6.92(m,4H),4.06(q,J＝7.0Hz,2H),1.34(t,J＝7.0Hz,3H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ167.44,160.11,159.49,158.57,134.63,134.29,129.80,129.44,128.97,128.91,126.57,119.39,119.24,117.81,116.95,114.35,63.49,15.12；ESI-MS:351.6[M+H]⁺.

實施例24.化合(he)物5c2的(de)制備(bei)

操(cao)作(zuo)同實施(shi)例23，所不同的是將鄰羥(qian)基(ji)苯甲(jia)酸換成2-羥(qian)基(ji)-4-甲(jia)氧(yang)基(ji)苯甲(jia)酸。黃色固體，收率19％，熔點：188-192℃。

化合物5c2波譜數據：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ12.44(s,1H),11.68(s,1H),10.03(s,1H),7.92(d,J＝8.9Hz,1H),7.81(s,2H),7.72(d,J＝8.8Hz,2H),6.96(d,J＝8.8Hz,2H),6.56(dd,J＝8.9,2.4Hz,1H),6.49(d,J＝2.4Hz,1H),4.06(q,J＝7.0Hz,2H),3.80(s,3H),1.34(t,J＝7.0Hz,3H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ168.00,164.32,162.59,160.09,158.55,134.85,129.99,129.79,129.36,128.91,126.72,119.13,114.34,108.71,106.81,101.77,63.48,55.92,15.12；ESI-MS:381.5[M+H]⁺.

實施例25.化合物(wu)5c3的制備

操作(zuo)同實施例23，所不同的是將鄰羥基(ji)(ji)苯甲(jia)酸換成2-羥基(ji)(ji)-5-甲(jia)氧基(ji)(ji)苯甲(jia)酸。黃色固體，收率16％，熔點：248-250℃。

化合物5c3波譜數據：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ11.78(s,1H),11.40(s,1H),10.16(s,1H),7.86(d,J＝2.7Hz,1H),7.80(d,J＝2.8Hz,1H),7.72(d,J＝8.8Hz,1H),7.48(d,J＝3.0Hz,1H),7.08(dd,J＝8.9,3.0Hz,1H),6.96(d,J＝8.8Hz,1H),6.92(d,J＝9.0Hz,1H),4.06(q,J＝6.9Hz,1H),3.76(s,1H),1.34(t,J＝7.0Hz,1H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ166.96,160.12,158.56,153.31,152.20,134.67,129.81,129.46,128.88,126.64,121.21,119.18,118.67,116.91,114.34,112.66,63.48,56.20,15.11；ESI-MS:381.5[M+H]⁺.

實施例26.化合物5c4的制備

操作同(tong)實施例23，所不同(tong)的是將鄰羥基苯(ben)(ben)甲(jia)酸(suan)換成2-羥基-4-氯苯(ben)(ben)甲(jia)酸(suan)。棕黃色固體，收率45％。

化合物5c4波譜數據：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ12.18(s,1H),11.70(s,1H),10.21(s,1H),7.93(d,J＝8.3Hz,1H),7.87(d,J＝2.8Hz,1H),7.80(d,J＝2.8Hz,1H),7.71(d,J＝8.8Hz,2H),7.09-7.00(m,2H),6.96(d,J＝8.8Hz,2H),4.06(q,J＝7.0Hz,2H),1.34(t,J＝7.0Hz,3H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ166.24,160.10,160.03,158.57,138.02,134.48,130.84,129.80,129.47,128.87,126.51,119.55,119.17,117.40,116.63,114.34,63.49,15.12；ESI-MS:385.3,387.4[M+H]⁺.

實施例27.化(hua)合物5c5的制備

操作同(tong)(tong)實施例23，所不同(tong)(tong)的是將鄰羥(qian)基(ji)苯(ben)甲酸(suan)換(huan)成2-羥(qian)基(ji)-4-氟苯(ben)甲酸(suan)。棕黃色固(gu)體，收(shou)率48％，熔點：278-280℃。

化合物5c5波譜數據：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ12.38(s,1H),11.71(s,1H),10.14(s,1H),8.01(dd,J＝8.8,6.8Hz,1H),7.82(dd,J＝12.8,2.8Hz,2H),7.72(d,J＝8.8Hz,2H),6.96(d,J＝8.8Hz,2H),6.83(ddd,J＝13.2,9.9,2.5Hz,2H),4.06(q,J＝6.9Hz,2H),1.34(t,J＝7.0Hz,3H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ166.76,164.28,161.63(d,J＝13.1Hz),160.12,158.57,134.67,131.34(d,J＝11.3Hz),129.79,129.45,128.87,126.75,119.04,114.35,113.92,107.06,106.84,104.52,104.28,63.49,15.12；ESI-MS:369.3[M+H]⁺.

實施(shi)例28.化合物5c6的制備

操(cao)作同實施(shi)例23，所(suo)不同的是(shi)將鄰羥(qian)基苯甲酸換成2-羥(qian)基-3-甲氧基苯甲酸。棕(zong)黃色固體，收率34％，熔點：258-261℃。

化合物5c6波譜數據：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ11.87(s,1H),11.71(s,1H),10.17(s,1H),7.83(dd,J＝8.7,2.8Hz,2H),7.72(d,J＝8.8Hz,2H),7.51(d,J＝7.3Hz,1H),7.16(d,J＝7.5Hz,1H),6.96(d,J＝8.8Hz,2H),6.90(t,J＝8.1Hz,1H),4.06(q,J＝6.9Hz,2H),3.81(s,3H),1.34(t,J＝7.0Hz,3H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ168.10,160.11,158.57,150.26,148.93,134.64,129.77,129.43,128.88,126.73,119.72,119.09,118.68,116.64,116.01,114.36,63.49,56.37,15.12；ESI-MS:381.5[M+H]⁺.

實施例(li)29.化合物(wu)5c7的制備

操(cao)作同(tong)實施例23，所不同(tong)的是將鄰羥基苯甲酸(suan)(suan)換成2-羥基-4-甲基苯甲酸(suan)(suan)。黃(huang)色固體，收率19％，熔點：254-256℃。

化合物5c7波譜數據：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ11.99(s,1H),11.69(s,1H),10.10(s,1H),7.83(dd,J＝14.6,5.8Hz,3H),7.72(d,J＝8.8Hz,2H),6.96(d,J＝8.8Hz,2H),6.79(t,J＝3.3Hz,2H),4.06(q,J＝7.0Hz,2H),2.30(s,3H),1.34(t,J＝7.0Hz,3H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ167.74,160.10,159.96,158.56,145.00,134.69,129.79,129.40,128.91,128.65,126.61,120.42,119.19,118.03,114.35,113.70,63.49,21.58,15.12；ESI-MS:365.5[M+H]⁺.

實施例30.化合物5c8的(de)制備

操作同實施(shi)例23，所不同的是將鄰羥基苯甲(jia)酸換成2-羥基-4-三(san)氟甲(jia)基苯甲(jia)酸。棕色固體，收率23％，熔點：270-273℃。

化合物5c8波譜數據：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ11.97(s,1H),11.71(s,1H),10.26(s,1H),8.04(d,J＝8.0Hz,1H),7.92(d,J＝2.8Hz,1H),7.81(d,J＝2.8Hz,1H),7.71(d,J＝8.8Hz,2H),7.29(s,2H),6.96(d,J＝8.8Hz,2H),4.06(q,J＝7.0Hz,2H),1.34(t,J＝7.0Hz,3H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ165.35,160.09,158.58,158.31,134.18,133.24(d,²J_CF＝32Hz),130.80,129.80,129.56,128.86,126.22,124.00(d,¹J_CF＝271Hz),122.58,119.35,115.74,114.35,114.13,63.49,15.11；ESI-MS:419.4[M+H]⁺.

實施(shi)例31.化合物3d的制(zhi)備(bei)

取100mL無氧反應瓶，將(jiang)化(hua)合物(wu)2(0.5g,2.28mmol)和(he)3,5-二(er)甲基(ji)苯(ben)硼酸(0.37g,2.51mmol)溶(rong)于(yu)水(shui)(4mL)和(he)1,4二(er)氧六(liu)環(huan)(16mL)的混合溶(rong)液中(zhong)，加入碳酸鉀(jia)(0.95g,6.85mmol)，置換氮氣，迅速加入四(si)三苯(ben)基(ji)膦鈀(0.16g,0.14mmol)；再次置換氮氣，100℃回流(liu)反應。反應結束后，旋蒸(zheng)部(bu)分(fen)1,4二(er)氧六(liu)環(huan)，加入水(shui)(15mL)，乙酸乙酯萃取(6mL x 3)，合并有(you)機相，飽和(he)食鹽水(shui)洗(10mL x 3)，無水(shui)硫酸鈉干(gan)燥；濃縮，甲醇洗，獲取黃色固體3a 0.22g，收率為(wei)39％。

化合物3d波譜數據：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ12.77(s,1H),8.64(d,J＝3.1Hz,1H),8.14(d,J＝3.1Hz,1H),7.32(s,2H),7.02(s,1H),2.31(s,6H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ161.63,137.58,137.41,135.18,131.12,130.74,130.25,129.71,126.49,21.40；ESI-MS:245.4[M+H]⁺,243.3[M-H]^-.

實施(shi)例32.化合物4d的制備

將化合物3d(0.18g,0.74mmol)溶(rong)于6mL甲醇，加入10％鈀(ba)碳(39.2mg,10％)，置換氫氣，25℃攪拌(ban)過夜。反應結束后，加入甲醇(10mL)，硅藻土(tu)抽濾，甲醇(5mL x 2)洗(xi)，收集濾液，濃縮，得到黃褐(he)色(se)固體化合物4d 115mg，收率為73％。

化合物4d波譜數據：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.97(s,1H),7.28(s,2H),7.26(d,J＝2.6Hz,1H),6.92(s,1H),6.69(d,J＝2.5Hz,1H),4.28(s,2H),2.28(s,6H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ158.32,137.60,137.01,133.08,130.57,129.40,128.94,126.45,117.16,21.49；ESI-MS:215.4[M+H]⁺.

實施例33.化合(he)物5d的(de)制備

操作(zuo)同實施例23，所不同的是原料4a換成4d。棕黃(huang)色固體，收率27％，熔(rong)點：286-290℃。

化合物5d波譜數據：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ11.89(s,1H),11.72(s,1H),10.20(s,1H),7.94(dd,J＝7.8,1.1Hz,1H),7.90(d,J＝2.7Hz,1H),7.83(d,J＝2.8Hz,1H),7.49–7.40(m,1H),7.36(s,2H),6.97(dd,J＝10.5,6.8Hz,3H),2.30(s,6H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ167.46,160.02,159.55,137.25,136.69,135.63,134.30,130.00,129.45,128.96,127.13,126.38,119.35,119.21,117.82,116.91,21.49；ESI-MS:335.6[M+H]⁺.

實施(shi)例34.化(hua)合物3e的制備(bei)

操作同實施例32，所(suo)不同的(de)是(shi)原(yuan)料3,5-二甲(jia)基苯硼酸換成3,4-亞(ya)甲(jia)基苯硼酸。黃色固體，收率(lv)59％。

實施(shi)例35.化合物4e的制(zhi)備

操作同實(shi)施例32，所不同的(de)是原料(liao)3d換成(cheng)3e。黃色固體，收率14％。

化合物4e波譜分析數據：ESI-MS:231.3[M+H]⁺.

實施例36.化合物5e的制備

操作同(tong)實施例(li)23，所(suo)不同(tong)的是原料4a換成4e。黃色固體(ti)，收(shou)率16％，熔點(dian)：267-270℃。

化合物5e波譜數據：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ12.41(s,1H),11.79(s,1H),10.00(s,1H),7.92(d,J＝8.9Hz,1H),7.82(s,2H),7.38(d,J＝1.4Hz,1H),7.27(dd,J＝8.1,1.5Hz,1H),6.96(d,J＝8.1Hz,1H),6.56(dd,J＝8.9,2.4Hz,1H),6.49(d,J＝2.4Hz,1H),6.05(s,2H),3.80(s,3H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ167.97,164.33,162.53,159.98,147.36,147.19,135.33,130.67,130.00,129.18,127.03,122.26,119.09,109.02,108.71,108.43,106.83,101.76,101.48,55.92；ESI-MS:381.4[M+H]⁺.

實施(shi)例37.化合物3f的制備

操(cao)作同實施例31，所不同的是原(yuan)料3,5-二甲基(ji)苯硼酸換(huan)成(cheng)3,4-二甲基(ji)苯硼酸。黃色固體，收率54％。

實施例38.化合物4f的(de)制備

操作同(tong)實施例(li)32，所(suo)不同(tong)的是原料(liao)3d換成3f。白色固體(ti)，收率82％。

化合物4f波譜數據：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.95(s,1H),7.47(s,1H),7.42(dd,J＝7.8,1.6Hz,1H),7.26(d,J＝2.9Hz,1H),7.12(d,J＝7.9Hz,1H),6.69(d,J＝2.9Hz,1H),4.27(s,2H),2.23(s,3H),2.23(s,3H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ158.38,135.75,135.47,135.15,132.70,130.56,129.65,129.40,129.26,126.07,116.94,19.97,19.56；ESI-MS:215.4[M+H]⁺.

實施例39.化合物5f的(de)制(zhi)備

操作同實施(shi)例23，所不同的是原料4a換(huan)成4f。黃色(se)固體，收率(lv)32％，熔點：288-292℃。

化合物5f波譜數據：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ12.44(s,1H),11.69(s,1H),10.01(s,1H),7.93(d,J＝8.9Hz,1H),7.82(s,2H),7.53(s,1H),7.50(d,J＝7.8Hz,1H),7.16(d,J＝7.9Hz,1H),6.56(dd,J＝8.9,2.4Hz,1H),6.49(d,J＝2.4Hz,1H),3.80(s,3H),2.26(s,3H),2.25(s,3H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ168.04,164.33,162.59,160.05,136.08,136.02,135.40,134.27,129.96,129.78,129.53,127.12,126.04,119.10,108.67,106.83,101.76,55.92,19.97,19.62；ESI-MS:365.5[M+H]⁺.

實施例40.化合(he)物(wu)3g的制備(bei)

操作(zuo)同實(shi)施例31，所不同的是原料3,5-二(er)甲基(ji)苯硼酸換(huan)成3-氟-4-甲氧(yang)基(ji)苯硼酸。黃色固體，收率44％，熔點：235-238℃。

化合物3g波譜分析數據：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ12.85(s,1H),8.65(d,J＝3.1Hz,1H),8.24(d,J＝3.1Hz,1H),7.70(dd,J＝13.3,2.2Hz,1H),7.62–7.56(m,1H),7.22(t,J＝8.9Hz,1H),3.89(s,3H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ161.57,152.51,150.10,147.72(d,J＝10.7Hz),137.31,130.82,127.87(d,J＝7.3Hz),127.70,125.25(d,J＝3.3Hz),116.28(d,J＝19.7Hz),113.90,56.52；ESI-MS:265.3[M+H]⁺.

實施例41.化合物4g的制(zhi)備

操作同實施例31，所不同的是原料(liao)3d換(huan)成3g。黃色固(gu)體，收率100％。

化合物4g波譜數據：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ11.09(s,1H),7.72(dd,J＝13.7,2.1Hz,1H),7.54–7.46(m,1H),7.35(d,J＝2.9Hz,1H),7.17(t,J＝9.0Hz,1H),6.71(d,J＝2.9Hz,1H),4.34(s,2H),3.86(s,3H)；ESI-MS:235.4[M+H]⁺.

實施例42.化合物5g的(de)制備

操(cao)作同(tong)實(shi)施(shi)例22，所不同(tong)的是原料4a換(huan)成4g。黃(huang)色固體，收率32％，熔點：270-272℃。

化合物5g波譜數據：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ12.41(s,1H),11.79(s,1H),10.02(s,1H),7.92(d,J＝8.9Hz,1H),7.90(d,J＝2.8Hz,1H),7.84(d,J＝2.8Hz,1H),7.75(dd,J＝13.6,2.1Hz,1H),7.59(d,J＝8.6Hz,1H),7.21(t,J＝9.0Hz,1H),6.56(dd,J＝8.9,2.5Hz,1H),6.49(d,J＝2.4Hz,1H),3.88(s,3H),3.80(s,3H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ167.98,164.34,162.50,159.91,151.30(d,J＝241Hz),147.05(d,J＝10.6Hz),135.46,130.02,129.50(d,J＝7.2Hz),127.61(d,J＝32.6Hz),124.67(d,J＝3.1Hz),119.10,115.95(d,J＝19.5Hz),113.82,108.72,106.85,101.76,56.48,55.92；ESI-MS:385.4[M+H]⁺.

實施例43.化(hua)合物3h的制備

操作同實(shi)施(shi)例31，所(suo)不同的是原料3,5-二(er)甲(jia)(jia)基苯(ben)硼酸換成2,5-二(er)甲(jia)(jia)基苯(ben)硼酸。黃色固體，收率34％，熔點(dian)：252-256℃。

化合物3h波譜數據：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ12.78(s,1H),8.71(d,J＝3.2Hz,1H),7.95(d,J＝3.1Hz,1H),7.17–7.08(m,2H),7.00(s,1H),2.29(s,3H),2.10(s,3H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ161.29,138.05,135.66,135.05,133.84,132.87,131.98,130.78,130.35,130.17,129.32,20.89,19.44；ESI-MS:245.5[M+H]⁺.

實施(shi)例44.化合物4h的制備

操作(zuo)同實(shi)施(shi)例32，所不同的是原料(liao)3d換成(cheng)3h。白(bai)色(se)固(gu)體，收率100％。

化合物4h波譜數據：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.89(s,1H),7.07(d,J＝7.7Hz,1H),7.05–6.99(m,1H),6.97(d,J＝3.0Hz,1H),6.89(s,1H),6.75(d,J＝3.0Hz,1H),4.19(s,2H),2.26(s,3H),2.09(s,3H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ157.78,138.16,134.53,134.31,133.72,131.62,130.78,130.40,129.82,128.24,117.60,20.94,19.64；ESI-MS:215.4[M+H]⁺.

實施(shi)例45.化(hua)合物5h的制備

操作(zuo)同實施(shi)例23，所不同的是原料4a換成4h。淡黃色固(gu)體，收(shou)率57％，熔點：288-290℃。

化合物5h波譜數據：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ12.40(s,1H),11.66(s,1H),10.01(s,1H),7.90(d,J＝8.9Hz,1H),7.87(d,J＝2.8Hz,1H),7.55(d,J＝2.9Hz,1H),7.17–7.02(m,2H),6.97(s,1H),6.54(dd,J＝8.9,2.5Hz,1H),6.48(d,J＝2.5Hz,1H),3.79(s,3H),2.28(s,3H),2.14(s,3H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ167.93,164.30,162.53,159.61,137.29,137.23,134.72,133.78,132.32,130.83,130.00,128.64,127.68,118.71,108.78,106.78,101.77,55.90,20.92,19.62；ESI-MS:365.4[M+H]⁺.

實(shi)施例46.化合物6a的制備

將化(hua)合物3a(300mg,1.22mmol)加入到6mL三氯氧磷(lin)中，90℃反應5小時。薄層色譜檢測反應完全，倒入50mL冰水中，用碳酸氫(qing)鈉水溶液(ye)中和，乙(yi)酸乙(yi)酯(zhi)萃取，無水硫酸鈉干燥，層析柱分(fen)離，重結晶得到白色固(gu)體6a 160mg，收率為44％。

實施例47.化合物6c的制備

操作(zuo)同(tong)實(shi)施例(li)46，所不(bu)同(tong)的是原料3a換成3c。白色固體，收率(lv)為44％。

化合物6c波譜數據：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.21(d,J＝2.7Hz,1H),8.52(d,J＝2.7Hz,1H),7.52(d,J＝8.8Hz,2H),7.08(d,J＝8.8Hz,2H),4.11(d,J＝7.0Hz,2H),1.37(t,J＝7.0Hz,3H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ159.65,154.06,144.25,143.58,137.04,134.98,131.26,127.50,114.93,63.74,15.08；ESI-MS:279.4[M+H]⁺.

實(shi)施例(li)48.化合物7a的制備

將鐵粉(148mg,2.64mmol)加(jia)入(ru)到(dao)(dao)3mL甲醇和3mL水(shui)的氯(lv)化銨(142mg,2.64mmol)混合(he)液中(zhong)，緩(huan)慢(man)加(jia)入(ru)化合(he)物6a(140mg,0.53mmol)，在78℃下反應(ying)(ying)。薄層色(se)譜檢測反應(ying)(ying)完全(quan)，布氏(shi)漏斗熱抽濾，乙醇洗(3mL)，加(jia)入(ru)水(shui)15mL，乙酸(suan)乙酯萃取(10mL x 3)，合(he)并(bing)有(you)機相，用飽和食鹽水(shui)洗1次(20mL)，用無水(shui)硫酸(suan)鈉進行干燥，旋蒸除乙酸(suan)乙酯，重結晶得到(dao)(dao)白(bai)色(se)固體7a 90mg，收(shou)率為73％。

化合物7a波譜數據：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.21(d,J＝2.7Hz,1H),8.53(d,J＝2.7Hz,1H),7.54(d,J＝8.8Hz,2H),7.10(d,J＝8.8Hz,2H),3.84(s,3H).

實(shi)施例49.化合物7c的制備(bei)

將鐵粉(301mg,5.48mmol)加(jia)入到(dao)7mL甲醇和7mL水(shui)的(de)氯化銨(288mg,5.48mmol)混合液中，緩(huan)慢加(jia)入化合物6c(300mg,1.08mmol)，在78℃下(xia)反應。薄層色譜(pu)檢測反應完全，布氏漏(lou)斗熱抽濾，乙(yi)醇洗(xi)(6mL)，加(jia)入水(shui)30mL，乙(yi)酸乙(yi)酯(zhi)萃取(20mL x 3)，合并有機相，用(yong)飽和食鹽水(shui)洗(xi)(40mL)，用(yong)無水(shui)硫酸鈉進行干(gan)燥(zao)，旋蒸(zheng)除(chu)乙(yi)酸乙(yi)酯(zhi)，重結晶得到(dao)白色固體(ti)7a 250mg，收率為94％。

化合物7c波譜數據：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ7.70(d,J＝2.8Hz,1H),7.33(d,J＝8.7Hz,2H),6.99(d,J＝8.7Hz,2H),6.95(d,J＝2.8Hz,1H),5.55(s,2H),4.07(q,J＝7.0Hz,2H),1.35(t,J＝7.0Hz,3H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ158.73,145.20,135.89,134.82,134.25,130.72,130.33,124.42,114.56,63.55,15.13；ESI-MS:249.2[M+H]⁺.

實施例50.化合(he)物8a的制備

將2-羥基苯甲(jia)酸(suan)(suan)(47mg，341μmol)溶于6mL無(wu)水(shui)N,N-二(er)(er)甲(jia)基甲(jia)酰(xian)胺(an)中(zhong)，25℃下(xia)攪拌(ban)10min，緩慢加(jia)入1-(3-二(er)(er)甲(jia)氨(an)基丙基)-3-乙(yi)基碳二(er)(er)亞胺(an)鹽酸(suan)(suan)鹽(85mg，452μmol)，1-羥基苯并(bing)三唑(zuo)(60mg，452μmol)，25℃下(xia)攪拌(ban)10min，加(jia)入化(hua)合物7a(80mg，341μmol)，置(zhi)換(huan)氮氣(qi)，25℃下(xia)攪拌(ban)10min之后(hou)70℃回流過夜反(fan)應。薄層(ceng)色(se)譜檢(jian)測(ce)反(fan)應完全，將反(fan)應液冷卻到(dao)25℃，加(jia)水(shui)50mL，乙(yi)酸(suan)(suan)乙(yi)酯萃取(20mL x 3)，合并(bing)有機相，大量(liang)水(shui)洗(xi)有機相(40mL x 3)，飽和食鹽水(shui)洗(xi)(20mL)，無(wu)水(shui)硫酸(suan)(suan)鈉干燥，硅膠柱純化(hua)處(chu)理得到(dao)白色(se)化(hua)合物8 52mg，收率為43％。

化合物8a波譜數據：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.89(d,J＝2.5Hz,1H),8.77(d,J＝2.5Hz,1H),8.19(d,J＝8.5Hz,1H),7.90(dd,J＝9.4,2.5Hz,3H),7.73–7.64(m,1H),7.59–7.52(m,1H),7.19(d,J＝8.9Hz,2H),3.86(s,3H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ161.43,160.72,143.87,143.27,142.28,136.31,131.49,129.78,128.96,125.88,124.32,124.02,120.41,114.92,110.09,55.85.

實(shi)施例51.目標(biao)化合物的體(ti)外抗(kang)HBV細胞活(huo)性篩選試(shi)驗

測試原理

HBV轉染的肝癌細胞HepG2.2.15細胞株，在進行細胞培養時能夠分泌HBV病毒顆粒(包含HBsAg、HBeAg和DNA)。在抗HBV目標化合物的干預下，細胞分泌HBsAg的和HBeAg的含量和產生的DNA會有所變化，因此檢測細胞分泌到培養上清中的HBsAg的和HBeAg的含量以及產生的HBV DNA，參照未加藥對照組的含量，可以反映樣品藥物的抗病毒活性作用。以拉米夫定為陽性對照藥，用酶聯免疫法(ELISA)檢測樣品藥物達到抑制病毒HBsAg的和HBeAg分泌的50％時的濃度數值為IC₅₀；用聚合酶鏈反應(PCR)檢測藥物抑制HBV DNA復制量的50％時的濃度數值IC₅₀；運用CCK-8檢測樣品藥物導致50％細胞毒性死亡的數值濃度為CC₅₀值；并計算出待測化合物的“選擇系數”(selectivity index)，計算公式：SI＝CC₅₀/IC₅₀。

測試方法

(1)細胞毒性實驗

配成(cheng)實驗(yan)所需樣品儲(chu)備濃(nong)(nong)度(du)(du)(100μmol/L)，每(mei)個(ge)(ge)樣品用HepG2.2.15細(xi)胞培(pei)養(yang)液(ye)配置成(cheng)做5個(ge)(ge)稀釋濃(nong)(nong)度(du)(du)(100μmol/L、10μmol/L、1μmol/L、0.1μmol/L、0.01μmol/L)，設立空白對(dui)照(zhao)(zhao)并(bing)以拉(la)米夫定作(zuo)為的陽(yang)性對(dui)照(zhao)(zhao)藥(yao)。加入96孔板(ban)細(xi)胞培(pei)養(yang)板(ban)，每(mei)濃(nong)(nong)度(du)(du)3復孔，每(mei)4天換同(tong)濃(nong)(nong)度(du)(du)藥(yao)液(ye)并(bing)設無藥(yao)細(xi)胞對(dui)照(zhao)(zhao)組，共(gong)培(pei)養(yang)9天。用CCK-8法檢(jian)測(ce)細(xi)胞存(cun)活率(lv)，確定藥(yao)物對(dui)HepG2.2.15細(xi)胞的毒性。

(2)抑(yi)制HBeAg和HBsAg抗原分(fen)泌實驗

HepG2 2.2.15細胞在96孔細胞培養(yang)板中培養(yang)24小時后(hou)，加入所(suo)配不同(tong)濃(nong)度含(han)藥培養(yang)液(ye)(ye)，繼續(xu)培養(yang)8天(每4天換液(ye)(ye)一次)，收集上清液(ye)(ye)，用HBsAg和(he)HBeAg診(zhen)斷試劑盒(ELISA)檢測HBsAg和(he)HBeAg。

(3)抑制HBV DNA合成實(shi)驗(PCR方(fang)法)

HepG2 2.2.15細胞在96孔細胞培養板中培養24小時后，加入所配20μM含藥培養液，繼續(xu)培養8天(每4天換液一次)，收(shou)集上清液，用探針(zhen)法進行PCR檢測。

化合物(wu)的活(huo)(huo)性(xing)(xing)列于表2和3中。由表2可(ke)以看(kan)出(chu)(chu)，大部(bu)分化合物(wu)有一(yi)定的細胞(bao)毒性(xing)(xing)，并顯示(shi)較(jiao)弱(ruo)的抑制HBV抗(kang)原分泌(mi)的活(huo)(huo)性(xing)(xing)。由表3可(ke)以看(kan)出(chu)(chu)，化合物(wu)5a2、5a5、5b2和5c8顯示(shi)一(yi)定的抗(kang)HBV復制活(huo)(huo)性(xing)(xing)，其中化合物(wu)5c8的活(huo)(huo)性(xing)(xing)最好，具有進一(yi)步(bu)優化的價值。

表2.吡啶(ding)酮類衍(yan)生(sheng)物抗HBV的毒性(xing)(xing)(HepG2 2.2.15細胞)、活性(xing)(xing)和選擇系數

注：^aIC₅₀:保護50％感染HBV的HepG2 2.2.15細胞免于細胞病變的化合物濃度；^bCC₅₀:使50％未感染HBV的細胞發生病變的化合物濃度；^cSI選擇性系數:CC₅₀/IC₅₀的比值。

表3.吡啶酮類(lei)衍生物抗HBV DNA復(fu)制(zhi)活性