本發明涉及生物熒光探針領域，更具體地，涉及一種基于喹啉骨架的Cu²⁺和Fe³⁺雙靶點熒光探針及(ji)其(qi)制備方法和應(ying)用。

背景技術：

銅和鐵是人類生產生活中被廣泛使用的金屬，兩者作為過渡元素具有顯著的生物相關性。它們常常作為輔酶或其他輔助因子參與生物體的生長代謝。過量的Cu²⁺和Fe³⁺會引起機體代謝障礙及其他嚴重疫病。Cu²⁺和Fe³⁺引起(qi)的代謝障礙疾病主(zhu)要包括器官功(gong)能(neng)紊(wen)亂或者神經退(tui)行性疾病。因此對于過渡金(jin)屬的檢測十分重(zhong)要。

熒光檢測具有高靈敏度、高選擇性、操作簡易、快速響應等優勢。細胞熒光成像作為生物和藥物科學領域里一種高效的探測手段備受關注。而用于細胞成像的熒光物質，應當有良好的水溶性、高亮度、光穩定性和低毒性。熒光小分子由于其良好的生物相容性、優越的光物理特性被應用于細胞內成像檢測。喹啉是一個大的共軛體系，可以很容易地產生π到π*的電子躍遷，喹啉基衍生物不僅具有較強的熒光，而且其雜環氮原子能參與配位，即同時具有識別和熒光功能。近年來基于喹啉骨架特異性識別Zn²⁺，Ag⁺，Fe³⁺，Cu²⁺等(deng)離子的(de)(de)小分子熒(ying)(ying)(ying)光探(tan)針(zhen)被廣泛報道。然而，同時(shi)識別雙靶(ba)(ba)點或多(duo)靶(ba)(ba)點的(de)(de)熒(ying)(ying)(ying)光探(tan)針(zhen)被較少報道。雙靶(ba)(ba)點熒(ying)(ying)(ying)光探(tan)針(zhen)具有高效、低成本(ben)、操作簡(jian)易(yi)的(de)(de)優勢，因此，設計一種能(neng)夠同時(shi)識別雙靶(ba)(ba)點、生(sheng)物相容(rong)性好的(de)(de)熒(ying)(ying)(ying)光探(tan)針(zhen)顯(xian)得日益(yi)重要。

技術實現要素：

本發明的目的提供一種基于喹啉骨架的Cu²⁺和Fe³⁺雙靶點(dian)熒(ying)光探(tan)針(zhen)，以(yi)及提供該雙靶點(dian)熒(ying)光探(tan)針(zhen)的制(zhi)備方(fang)法和其在細胞(bao)成(cheng)像(xiang)中的應(ying)用。

本發明的第一方面是提供一種基于喹啉骨架的Cu²⁺和Fe³⁺雙靶點(dian)熒(ying)光(guang)(guang)探針(以下簡稱QLBM)，該雙靶點(dian)熒(ying)光(guang)(guang)探針具有(you)式I所(suo)示的結(jie)構(gou)：

本發明的(de)第二方(fang)面是提供該雙靶點(dian)熒光探針的(de)制備方(fang)法(fa)，該方(fang)法(fa)包括(kuo)：

(i)在(zai)第一有機(ji)溶劑存在(zai)下，使喹哪啶酸與草酰(xian)氯反應，得到式II所示化合物；

(ii)在第二有機溶劑存在下(xia)，使式II所(suo)示(shi)化合(he)物與2-氨基苯并(bing)咪唑(zuo)反應，得到式I所(suo)示(shi)化合(he)物。

本發明的第(di)三方面是提供(gong)該雙(shuang)靶點(dian)熒光探針在細胞成像(xiang)中(zhong)的應用。

本發明的效果表現在：

(1)QLBM對Cu²⁺和Fe³⁺的(de)識別具有(you)高靈(ling)敏度和高選擇性。

(2)該探針的(de)反(fan)應體系為純水(shui)相。

(3)首次提出利用抗壞血酸對Cu²⁺和Fe³⁺進行區分。

(4)利用質譜、DFT分析了其作用機制，并將其作為Cu²⁺和Fe³⁺雙靶(ba)點探針(zhen)應用(yong)于細胞成(cheng)像。

本發明(ming)(ming)的其它特征和優點將在隨后具體實施方式(shi)部分予(yu)以(yi)詳細說明(ming)(ming)。

附圖說明

通過結合(he)附圖對本發明(ming)示例性實施方式(shi)進行更(geng)詳細的描述，本發明(ming)的上(shang)述以及其(qi)它目(mu)的、特征(zheng)和優勢(shi)將變得更(geng)加明(ming)顯。

圖1為本(ben)發明(ming)雙靶點熒光探針(zhen)的氫譜。

圖2為本發(fa)明雙靶點熒光探針的碳譜。

圖3為(wei)本發(fa)明雙靶點(dian)熒光探針的(de)紫外吸收(shou)譜(pu)圖。

圖4(a)示出了將200μM的不同金屬離子加入QLBM(20μM)的Tris-HCl(50mM，pH 7.2)溶液后的熒光發射譜圖；圖4(b)示出了將200μM的不同金屬離子加入QLBM(20μM)的Tris-HCl(50mM，pH 7.2)溶液后紫外光下的顏色圖。圖4(c)和圖4(d)分別示出了QLBM(20μM)在Tris-HCl(50mM，pH 7.2)溶液中與Cu²⁺(200μM)，Fe³⁺(200μM)和其他金屬離子(500μM)的熒光發射譜圖。黑條代表其他競爭金屬離子。紅條代表在加入競爭金屬離子后加入Cu²⁺(200μM)和Fe³⁺(200μM)。

圖5(a)示出了在QLBM(20μM)的Tris-HCl(50mM，pH 7.2)溶液中不斷滴加Cu²⁺的熒光發射譜圖。圖5(b)示出了在QLBM(20μM)在Tris-HCl(50mM，pH 7.2)溶液中不斷滴加Cu²⁺在508nm處的熒光值與Cu²⁺滴加濃度的滴定曲線。內部曲線為QLBM熒光值與Cu²⁺離子濃度的線性區間曲線。圖5(c)示出了在QLBM(20μM)的Tris-HCl(50mM，pH 7.2)溶液中不斷滴加Fe³⁺的熒光發射譜圖。圖5(d)示出了在QLBM(20μM)在Tris-HCl(50mM，pH 7.2)溶液中不斷滴加Fe³⁺在508nm處的熒光值與Fe³⁺滴加濃度的滴定曲線。內部曲線為QLBM熒光值與Fe³⁺離子(zi)濃度的線(xian)性區間曲(qu)線(xian)。

圖6(a)示出了在QLBM(20μM)的Tris-HCl(50mM，pH 7.2)溶液中加入Fe³⁺(200μM)離子后，又加入抗壞血酸(500μM)后的熒光發射譜圖變化。圖6(b)示出了在QLBM(20μM)的Tris-HCl(50mM，pH 7.2)溶液中加入Cu²⁺(200μM)離子后，又加入抗壞血酸(500μM)后的熒光發射譜圖變化。圖6(c)示出了在包含Cu²⁺(200μM)和Fe³⁺(200μM)的QLBM(20μM)的Tris-HCl(50mM，pH 7.2)溶液中加入抗壞血酸(500μM)后最大發射波長處(508nm)時間梯度的熒光值變化。圖6(d)示出了在QLBM(20μM)的Tris-HCl(50mM，pH 7.2)溶液中加入Cu²⁺(200μM)和Fe³⁺(200μM)后(hou)加入抗壞血(xue)酸(500μM)紫外燈(deng)照射(she)下的顏色變化。

圖7示出了QLBM-CuCl₂與2當量QLBM-FeCl₃的質譜結果。

圖8(a)、圖8(b)、圖8(c)分別示出了DFT計算分析的QLBM、QLBM-Cu²⁺和QLBM-Fe³⁺的最優化結構。

圖9示出了不(bu)同(tong)濃度QLBM的細胞毒性。

圖10(a)為HeLa細胞與20μM QLBM共孵育6h后的共聚焦顯微鏡成像。圖10(b)為HeLa細胞與20μM QLBM共孵育6h后，加入200μM Cu²⁺孵育30min的共聚焦顯微鏡成像。圖10(c)為HeLa細胞與20μM QLBM共孵育6h后，加入200μM Fe³⁺孵育30min的共聚焦顯微鏡成(cheng)像。標尺：50μm。

具體實施方式

下(xia)面將參照附圖更詳細地描述(shu)本發(fa)明。

本發明提供一種基于喹啉骨架的Cu²⁺和Fe³⁺雙(shuang)靶點(dian)熒(ying)光探針(zhen)，該雙(shuang)靶點(dian)熒(ying)光探針(zhen)具(ju)有式I所(suo)示的(de)結構：

本(ben)發明提(ti)供上(shang)述雙靶點熒(ying)光探針的(de)制備方法(fa)，該方法(fa)包括：

(i)在第一有機溶劑存(cun)在下(xia)，使喹哪啶(ding)酸(suan)與草酰氯反應，得到式II所示化合物；

(ii)在第二有機溶劑存在下，使式II所示(shi)化(hua)(hua)合物與2-氨基苯并咪唑反應(ying)，得到式I所示(shi)化(hua)(hua)合物。

根(gen)據(ju)本發明，優選地(di)，步驟(zou)(i)中(zhong)，喹哪啶(ding)酸與草酰(xian)氯的摩爾比為1：5-20。

步驟(i)中的(de)所(suo)述(shu)第一(yi)有(you)機溶劑(ji)可(ke)以(yi)為本領域(yu)常(chang)規的(de)非質子有(you)機溶劑(ji)，優(you)選為二氯甲烷、甲苯和正己烷中的(de)至少一(yi)種。進一(yi)步優(you)選地(di)，上(shang)述(shu)有(you)機溶劑(ji)為干(gan)燥(zao)處理后的(de)有(you)機溶劑(ji)。

具體地，步驟(i)可包括：

將溶解(jie)在第一(yi)有機溶劑中的草酰(xian)氯(lv)滴加到喹哪啶酸溶液中，混合均勻后，在惰性氣體(ti)存在下(xia)，蒸餾攪拌反應。

其中(zhong)，所述喹哪啶(ding)(ding)酸(suan)溶(rong)(rong)液(ye)(ye)優選為(wei)喹哪啶(ding)(ding)酸(suan)溶(rong)(rong)解于第一有機溶(rong)(rong)劑中(zhong)形(xing)成(cheng)的溶(rong)(rong)液(ye)(ye)，喹哪啶(ding)(ding)酸(suan)溶(rong)(rong)液(ye)(ye)的濃度(du)可以(yi)根據需要(yao)確定(ding)。

所述滴加(jia)優選在(zai)低溫(wen)下(xia)進行，例如冰(bing)浴條件。

所述惰(duo)性氣體例(li)如可(ke)以為氮氣。

步(bu)驟(i)還可以包括常規的后處(chu)理(li)步(bu)驟，例(li)如(ru)冷卻、旋蒸溶劑等。

根(gen)據本發(fa)明，步(bu)驟(ii)中，式(shi)II所(suo)示化合(he)物與2-氨基苯并咪唑的摩爾比優選為1：1-2。

步驟(ii)中的(de)所述第二有(you)(you)機溶(rong)劑(ji)可以為(wei)本領域常規的(de)非質子有(you)(you)機溶(rong)劑(ji)，優選為(wei)二氯甲烷(wan)、甲苯和正己烷(wan)中的(de)至少一種。進一步優選地，上述有(you)(you)機溶(rong)劑(ji)為(wei)干燥處(chu)理后(hou)的(de)有(you)(you)機溶(rong)劑(ji)。

優(you)選地，步驟(ii)包括：向反應體系(xi)中加入縛酸劑。所述縛酸劑例如可以為三甲胺(an)或三乙胺(an)。

根據(ju)本發明，步驟(ii)的反應(ying)條件(jian)優選包括：溫度為-4至5℃，時間為2-10h。

步驟(zou)(ii)還可以包括(kuo)常規(gui)的后處理步驟(zou)，例如冷卻(que)、旋(xuan)蒸(zheng)溶劑、柱層析等(deng)。

本(ben)發明還提供(gong)上述的雙靶點熒(ying)光探針在細胞成(cheng)像中(zhong)的應用(yong)。

根據本發明(ming)一種(zhong)優選(xuan)實施方(fang)式，通過兩(liang)步反(fan)應(ying)設(she)計合成了熒光探針QLBM，合成過程如(ru)下式所(suo)示：

合(he)成方法：將(jiang)(jiang)喹(kui)哪(na)(na)啶(ding)酸溶于(yu)干(gan)燥的(de)二(er)(er)氯(lv)甲(jia)烷(wan)中，然(ran)后將(jiang)(jiang)草(cao)酰(xian)(xian)氯(lv)溶解在(zai)干(gan)燥二(er)(er)氯(lv)甲(jia)烷(wan)中，在(zai)冰浴條件和(he)磁力攪拌下，將(jiang)(jiang)草(cao)酰(xian)(xian)氯(lv)溶液滴(di)加于(yu)喹(kui)哪(na)(na)啶(ding)酸溶液中，之(zhi)后在(zai)氮氣環境下蒸餾(liu)反(fan)(fan)應(ying)。隨后，將(jiang)(jiang)反(fan)(fan)應(ying)液冷卻(que)至室溫，旋(xuan)蒸除去溶劑，得到(dao)粗(cu)產(chan)物喹(kui)哪(na)(na)啶(ding)酰(xian)(xian)氯(lv)(簡稱為C2)。然(ran)后將(jiang)(jiang)得到(dao)的(de)產(chan)物C2與2-氨基苯并咪唑加入(ru)到(dao)干(gan)燥的(de)二(er)(er)氯(lv)甲(jia)烷(wan)與三甲(jia)胺的(de)混合(he)溶液中，攪拌反(fan)(fan)應(ying)，旋(xuan)蒸除去溶劑，并通過硅膠柱層(ceng)析(xi)分離純化，得到(dao)QLBM。

通過以下實(shi)施例對本發明(ming)進行進一步說明(ming)。

實施例1

將(jiang)喹哪(na)啶酸(C1，0.38g，2mM)溶(rong)(rong)于(yu)干燥(zao)的(de)(de)二(er)氯(lv)甲烷(20mL)加(jia)入(ru)到(dao)(dao)100mL的(de)(de)兩口瓶中(zhong)，放入(ru)磁(ci)力轉子。然后將(jiang)草(cao)酰氯(lv)(2.60g，20mM)溶(rong)(rong)解在(zai)10mL的(de)(de)干燥(zao)二(er)氯(lv)甲烷中(zhong)，在(zai)冰(bing)浴條件下滴加(jia)于(yu)喹哪(na)啶酸溶(rong)(rong)液(ye)中(zhong)，攪(jiao)拌(ban)30分(fen)鐘(zhong)，之后在(zai)氮氣(qi)環境下蒸餾攪(jiao)拌(ban)5個小時(shi)。隨(sui)后，將(jiang)反應液(ye)冷卻至室溫(wen)，旋蒸除去溶(rong)(rong)劑(ji)，得(de)到(dao)(dao)粗(cu)產(chan)物(wu)喹哪(na)啶酰氯(lv)(簡(jian)稱為C2)。然后將(jiang)得(de)到(dao)(dao)的(de)(de)產(chan)物(wu)C2與(yu)2-氨基苯并咪(mi)唑(0.27g，2mM)加(jia)入(ru)到(dao)(dao)30mL干燥(zao)的(de)(de)二(er)氯(lv)甲烷中(zhong)與(yu)0.1mL的(de)(de)三甲胺的(de)(de)混合溶(rong)(rong)液(ye)中(zhong)，0℃條件下攪(jiao)拌(ban)反應5個小時(shi)，旋蒸除去溶(rong)(rong)劑(ji)，并通過(guo)硅膠柱層析分(fen)離純(chun)化，得(de)到(dao)(dao)QLBM黃色(se)固體0.42g，產(chan)率為73％。

圖1和圖2分別(bie)為(wei)QLBM的氫(qing)譜及碳譜。

測試例1

1QLBM的光(guang)物理表征

1.1測試(shi)QLBM的吸(xi)收(shou)譜(pu)圖。配置20μM的QLBM的Tris-HCl(50mM，pH 7.2)溶液，取2mL加入石英(ying)比色皿中(zhong)，使用紫外-可見分光光度計(ji)測試(shi)其吸(xi)收(shou)譜(pu)圖。

1.2測試QLBM的(de)熒(ying)光(guang)發(fa)(fa)射譜(pu)圖。配置20μM的(de)QLBM溶液于50mM Tris-HCl(pH 7.2)，取1mL加入比(bi)色(se)皿中，在熒(ying)光(guang)分光(guang)光(guang)度計(ji)上測試QLBM的(de)熒(ying)光(guang)發(fa)(fa)射譜(pu)圖。激(ji)發(fa)(fa)波長為(wei)(wei)370nm，發(fa)(fa)射區間(jian)為(wei)(wei)400-700nm。

測試例2

2QLBM對不同(tong)金屬離子的(de)選擇性研究

2.1配置QLBM(20μM)的Tris-HCl(50mM，pH 7.2)的水溶液，向每個比色皿中加入1mL的溶液，每個比色皿中依次加入Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Zn²⁺，Ca²⁺，Fe²⁺，Mn²⁺，Hg²⁺，Cd²⁺，Co²⁺，Al³⁺，Pd²⁺，Cu²⁺，Fe³⁺鹽溶液。加入后混合均勻，各皿中金屬離子濃度為Na⁺(500μM)，K⁺(500μM)，Mg²⁺(500μM)，Zn²⁺(500μM)，Ca²⁺(500μM)，Fe²⁺(500μM)，Mn²⁺(500μM)，Hg²⁺(500μM)，Cd²⁺(500μM)，Co²⁺(500μM)，Al³⁺(500μM)，Pd²⁺(500μM)離子鹽溶液。

2.2在(zai)熒(ying)光分光光度計上進行熒(ying)光強度的檢測(激發波長為370nm)。

2.3采集并處理數據。

測試例3

3Cu²⁺和Fe³⁺對QLBM的滴定實(shi)驗

3.1配置20μM QLBM溶液，溶劑(ji)為50mM Tris-HCl(pH 7.2)，取1mL加(jia)入比色皿(min)中。

3.2配置10mM的CuCl₂和FeCl₃水溶液。

3.3向比色皿中分別滴加Cu²⁺，Cu²⁺的(de)濃度范圍為0～300μM，在熒光(guang)分光(guang)光(guang)度計上依(yi)次(ci)測(ce)試熒光(guang)發射譜圖。

3.4同法，測試逐滴加入Fe³⁺的熒光發射譜圖。

3.5采集并(bing)處理(li)數(shu)據。

測試例4

4抗壞血酸對Cu²⁺和Fe³⁺的區分

4.1配置20μM QLBM溶(rong)液，溶(rong)劑為(wei)50mM Tris-HCl(pH 7.2)，取1mL分別加入(ru)兩個比(bi)色皿中(zhong)。

4.2分別加入200μM的Cu²⁺和Fe³⁺鹽溶液，測(ce)試(shi)熒光(guang)發射(she)譜圖。

4.3繼而分別加入500μM抗壞(huai)血酸溶液，混合均勻，記(ji)錄1h內的熒光發射圖譜(pu)，每10分鐘(zhong)測試一次。

4.4采集并處(chu)理(li)數據。

測試例5

5QLBM與Cu²⁺和Fe³⁺的作用機制分析

5.1配置QLBM和兩當量的CuCl₂和FeCl₃的溶(rong)液，進(jin)行質譜分析(xi)。

5.2質譜分析得到QLBM與Cu²⁺/Fe³⁺結合比例。

5.3在計算(suan)機上利用高斯09軟件進行(xing)密(mi)度(du)泛(fan)函理論(DFT)計算(suan)分析(xi)。

測試例6

6細胞培養方法

將HeLa細胞(bao)放置(zhi)于(yu)37℃，二(er)氧化(hua)碳含量(liang)為5％的培養(yang)箱中。培養(yang)基為含10％FBS的RPMI-1640。在細胞(bao)密度(du)約為90％時(shi)使用胰酶細胞(bao)消化(hua)液進行傳代(dai)，平均2天傳代(dai)一次。

測試例7

7細胞毒性檢測

收集對數期HeLa細胞，調整細胞溶液濃度至50000個/mL，在96孔板中每孔加入100μL。在5％CO₂，37℃的(de)(de)(de)培(pei)養(yang)箱培(pei)養(yang)過夜后(hou)，加入不(bu)同濃度(du)梯(ti)(ti)度(du)的(de)(de)(de)QLBM 100μL，使各(ge)梯(ti)(ti)度(du)濃度(du)為(0，2μM，5μM，10μM，20μM，50μM，100μM)。每(mei)個梯(ti)(ti)度(du)五個復孔(kong)。培(pei)養(yang)24h后(hou)，每(mei)孔(kong)加入20μL的(de)(de)(de)3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯(ben)基四氮唑溴(xiu)鹽(MTT)的(de)(de)(de)PBS溶液(5mg/mL)，共孵育4h。吸去上(shang)清，每(mei)孔(kong)加入150μL的(de)(de)(de)DMSO，置搖床上(shang)低速震蕩10分鐘，使結(jie)晶物充分溶解。在酶(mei)聯免(mian)疫檢測(ce)儀OD 490nm處測(ce)量各(ge)孔(kong)的(de)(de)(de)吸光值(zhi)。

測試例8

8細胞成像

8.1QLBM與HeLa細胞作用成像實驗。將HeLa細胞傳代至直徑為20mm的共聚焦玻底培養皿，在5％CO₂，37℃的培(pei)(pei)(pei)養(yang)箱培(pei)(pei)(pei)養(yang)24h后。將QLBM加入培(pei)(pei)(pei)養(yang)基中，QLBM的濃度為20μM，孵育6h后，移去(qu)培(pei)(pei)(pei)養(yang)液，用(yong)1×PBS清洗細胞(bao)六次(ci)。在共聚焦顯微鏡(jing)(Olympus FV1000-IX81confocal laser scanning microscope)下觀測。激發光選用(yong)汞激光器(72.0％405nm)。

8.2細胞內檢測QLBM與Cu²⁺和Fe³⁺細胞成像實驗。將HeLa細胞傳代至直徑為20mm的共聚焦玻底培養皿，在5％CO₂，37℃的培養箱培養24h后。將QLBM加入培養基中，QLBM的濃度為20μM，孵育6h后，加入200μM Cu²⁺和Fe³⁺共孵育30min后移去培養液，用1×PBS清洗細(xi)胞(bao)六次。在共聚焦(jiao)顯微鏡(Olympus FV1000-IX81confocal laser scanning microscope)下觀測。激(ji)(ji)發(fa)光選用汞(gong)激(ji)(ji)光器(72.0％405nm)。

9數據與分析

9.1QLBM在(zai)Tris-HCl(50mM,pH 7.2)溶液體系中的紫外吸收和熒光發射譜圖(tu)

如(ru)圖3所示，QLBM擁有300～400nm的吸(xi)收(shou)范圍(wei)。508nm處為其最大發(fa)射(she)波長。

9.2QLBM在Tris-HCl(50mM,pH 7.2)溶液體系中(zhong)的紫外(wai)吸收和熒光發射譜(pu)圖

如圖3所示，QLBM擁(yong)有(you)300～400nm的吸收范圍(wei)。508nm處為其(qi)最(zui)大(da)發(fa)射波長。

9.3QLBM與不同金屬離子的選擇性研究(jiu)

QLBM基于喹啉骨架設計而成，其雜環氮原子的喹啉衍生物可以作為金屬離子的螯合位點，所以進行QLBM與不同金屬離子之間的選擇性研究，本發明共選取了14種常見金屬離子(Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Zn²⁺，Ca²⁺，Fe²⁺，Mn²⁺，Hg²⁺，Cd²⁺，Co²⁺，Al³⁺，Pd²⁺，Cu²⁺，Fe³⁺)。

如圖4(a)-4(d)所示，加入了不同的金屬離子后，Cu²⁺和Fe³⁺對QLBM的熒光顯示出了顯著的淬滅，而對其他離子并沒有明顯的變化。與之對應，紫外燈照射下QLBM-Cu²⁺和QLBM-Fe³⁺的熒光有顯著淬滅，而加入其他離子的QLBM溶液并未明顯的顏色變化。在其他離子的QLBM溶液中繼而分別加入Cu²⁺和Fe³⁺，其他離子的QLBM溶液熒光顯示了明顯的淬滅。以上結果說明QLBM對Cu²⁺和Fe³⁺有特異響應，且在其他離子存在的條件下，不會干擾QLBM對Cu²⁺和Fe³⁺的特異響應。

9.4Cu²⁺和Fe³⁺對QLBM的滴定實驗

如圖5(a)-5(d)所示，在QLBM(20μM)的Tris-HCl(50mM，pH 7.2)溶液體系中，隨著Cu²⁺和Fe³⁺的滴加濃度不斷增加，QLBM的最大發射波長(508nm)處的熒光值不斷下降，當Cu²⁺和Fe³⁺的滴加濃度達到200μM時，QLBM的熒光值淬滅效率達到約90％。當Cu²⁺和Fe³⁺的滴加濃度在0～50μM時，QLBM的最大發射波長(508nm)和Cu²⁺/Fe³⁺的滴加濃度呈現較好的線性。通過LOD＝3*Sb/S計算其檢測線，QLBM對Cu²⁺的檢測限為1.35×10^-7M，對Fe³⁺的檢測限為1.24×10^-7M。在QLBM(20μM)的Tris-HCl(50mM，pH 7.2)溶液體系中，隨著Cu²⁺和Fe³⁺的滴加濃度不斷增加，QLBM的最大發射波長(508nm)處的熒光值不斷下降，當Cu²⁺和Fe³⁺的滴加濃度達到200μM時，QLBM的熒光值淬滅效率達到約90％。當Cu²⁺和Fe³⁺的滴加濃度在0～50μM時，QLBM的最大發射波長(508nm)和Cu²⁺/Fe³⁺的滴加濃度呈現較好的線性。通過LOD＝3*Sb/S計算其檢測線，QLBM對Cu²⁺的檢測限為1.35×10^-7M，對Fe³⁺的檢測限為1.24×10^-7M。

9.5抗壞血酸(AA)對Cu²⁺和Fe³⁺的區分

如圖6(a)-6(d)所示，Cu²⁺和Fe³⁺對QLBM均顯示出較好的的淬滅效果(淬滅率～90％)，繼而加入過量的抗壞血酸(500μM)后，QLBM-Fe³⁺溶液顯示了明顯的熒光回復，而QLBM-Cu²⁺的熒光并無顯著變化。這主要是由于抗壞血酸具有較強的還原性，能夠快速將Fe³⁺還原為Fe²⁺。根據圖4結果顯示，QLBM對Fe²⁺沒有明顯響應。而抗壞血酸對Cu²⁺的還原需要更嚴苛的條件，因而QLBM-Cu²⁺的熒光并無顯著變化。紫外燈照射下的溶液顏色變化也與上述結果相一致。抗壞血酸與Fe³⁺的反應屬于氧化還原反應，該反應需要一定的時間，又考察了抗壞血酸與Fe³⁺的(de)作用時(shi)間，發現當(dang)達到1h后，熒光回復(fu)到最大值。

9.6QLBM與Cu²⁺和Fe³⁺的作用機制研究

圖7(a)-7(b)的質譜結果顯示，m/z＝289.1106(計算值＝289.1084)對應于[QLBM+H]⁺,m/z＝350.0238(計算值＝350.0218)對應于[QLBM+Cu²⁺+H]+，m/z＝385.9989(計算值＝385.9990)對應于[QLBM+Cu²⁺+Cl^-]⁺，m/z＝378.0009(計算值＝378.0410)對應于[QLBM+Fe³⁺+Cl^-+OH^-]⁺，m/z＝396.0105(計算值＝396.0071)對應于[QLBM+Fe³⁺+2OH^-]⁺，m/z＝413.9745(計算值＝413.9732)對應于[QLBM+Fe³⁺+2Cl^-]⁺。結果顯示QLBM與Cu²⁺及Fe³⁺的(de)結合比例為1:1。

通過DFT計算分析，QLBM、QLBM與Cu²⁺及QLBM與Fe³⁺的結合位點如圖8(a)、8(b)和圖8(c)所示。Cu²⁺和QLBM結構上的N(1)，N(2)，Cl(3)，Cl(4)原子的距離分別為和Fe³⁺和QLBM結構上的N(1)，N(2)，Cl(3)，Cl(4)原子的距離分別為和圖中結構為QLBM，QLBM-Cu²⁺復合物和QLBM-Fe³⁺復合物(wu)的(de)最優化結構(gou)。

9.7細胞成像

9.7.1細胞毒性

通(tong)過MTT法研究(jiu)QLBM的細胞毒性，如圖(tu)9所示，當QLBM濃度達到20μM時孵育24h后，細胞存活率達90％以(yi)上(shang)。

9.7.2QLBM的細胞內成像(xiang)

圖10(a)-10(c)中的結果顯示，當HeLa細胞共孵育后6h后進行共聚焦顯微成像，HeLa細胞顯示明亮的綠色熒光。孵育6h后，分別加入200μM Cu²⁺離子和200μM Fe³⁺離子后進行共聚焦顯微成像，HeLa細胞與圖10(a)相比熒光呈現明顯的淬滅。結果顯示QLBM能夠用作細胞內成像檢測Cu²⁺和Fe³⁺。