專利名稱：從樺褐孔菌中綜合提取甾體類化合物、多糖和多酚的方法
技術領域：
本發明涉及一種留體類化合物、多糖和多酚的提取方法，特別是涉及一種從樺褐孔菌中綜合提取留體類化合物、多糖和多酚的方法。
背景技術：
樺褐孔菌屬于真菌門，擔子菌亞門，層菌綱，非褐菌目，銹革孔菌科，褐臥孔菌屬， 學名Phaeoporousobliquus (per Fr. ) J. Schroet。目前樺褐孔菌的化學組成主要有羊毛脂烷型留體類化合物、多糖類、多酚類、木質素類、黑色素、生物堿類、單寧化合物、葉酸衍生物以及芳香的香草酸、丁香酸和Y-羥基苯甲酸等。目前，有關研究人員已對這些成分的生物活性展開了研究，并將其應用于惡性腫瘤、糖尿病、心血管疾病、肝病及艾滋病的預防和治療中。留體類物質是樺褐孔菌中一種主要的活性成分，其含量大，活性高，而樺褐孔菌醇則是其中一種主要的化合物，研究發現其具有很好的抗腫瘤活性，因此近年來受到廣泛的關注。樺褐孔菌多糖是樺褐孔菌中的又一種重要的天然活性成分，具有多種生理功能且對人體無毒，因此近年來也受到廣泛的關注。研究發現樺褐孔菌多糖具有良好的抗氧化、降血糖、抗腫瘤和免疫調節作用，尤其是顯著的降血糖效果和免疫活性使其有望成為預防糖尿病和心血管疾病、增強免疫力的天然藥物。樺褐孔菌多酚是從樺褐孔菌中提取的天然產物，由于樺褐孔菌多酚是一種高效低毒的天然抗氧化保鮮劑，因而在食品工業中主要用于油脂及其制品、油炸及烘烤食品、魚及肉制品的保鮮，并可代替現在食品工業中常用的人工合成抗氧化劑BHA、BHT。另外，樺褐孔菌多酚在醫藥方面具有抗病毒、抗菌、抑菌、防齲齒、改善腎功能、降血脂、降血壓、降血糖、 抗氧化、抗癌等作用，臨床研究發現樺褐孔菌多酚對緩解心血管系統病變具有良好作用。目前通常采用水提取乙醇沉淀或溶劑萃取的方法進行樺褐孔菌中多糖和多酚的提取及分離，由于常規的水提取乙醇沉淀提取方法收率較低，樺褐孔菌多糖收率只有2% 5%，樺褐孔菌多酚收率更低，而溶劑萃取法則會因使用了大量的有機溶劑而造成環境污染。而且到目前為止尚未見到一種能同時提取樺褐孔菌中的留體類化合物、多糖和多酚的方法的報道和實例。

發明內容
為了解決上述問題，本發明的目的在于提供一種產品收率高的從樺褐孔菌中綜合提取留體類化合物、多糖和多酚的方法。為了達到上述目的，本發明提供的從樺褐孔菌中綜合提取留體類化合物、多糖和多酚的方法包括按順序進行的下列步驟I)將樺褐孔菌在電磨中粉碎成粉末，然后在高壓滅菌鍋中高壓處理I 3小時，以對原料進行前處理；
2)將上述經過高壓處理的樺褐孔菌加入到80%濃度的乙醇中，所述樺褐孔菌與乙醇的質量比為I : 10 I : 20，然后在80°C 90°C的溫度下回流提取I 2小時，反復浸提3次，之后減壓過濾，將濾液合并而得到含有留體類化合物的樺褐孔菌供試液；3)在40°C 60°C的溫度和O. 06 O. IMPa的壓力下將上述含有甾體類化合物的樺褐孔菌供試液置于旋轉蒸發儀中減壓旋蒸至無乙醇，用體積為上述濃縮后樺褐孔菌供試液5 10倍量的水混懸洗滌，之后離心分離，收集沉淀物；4)將上述收集到的沉淀物干燥即得到留體類化合物產品；5)在步驟2)中提取后的殘渣中加入去離子水，所述樺褐孔菌殘渣與去離子水的質量比為I : 10 I : 30，然后在90°C 100°C的溫度下回流提取I 2小時，反復浸提 3次，之后減壓過濾，將濾液合并而得到含有樺褐孔菌多糖和多酚的樺褐孔菌供試液；6)在40°C 60°C的溫度和O. 06 O. IMPa的壓力下將上述含有樺褐孔菌多糖和多酚的樺褐孔菌供試液置于旋轉蒸發儀中減壓濃縮至原體積的1/10 1/4，然后在濃縮液中加入乙醇至乙醇質量濃度70%以上進行沉淀，之后離心分離，分別收集沉淀物和上清液； 然后用2 3倍體積的無水乙醇對上述沉淀物進行洗滌脫色3 5次，之后離心分離，收集二次沉淀物；7)將步驟6)中收集的二次沉淀物干燥即得到樺褐孔菌多糖產品；8)將步驟6)中得到的上清液濃縮至無醇味，然后采用動態上樣的方法，上樣到預處理好的大孔樹脂柱子上；上樣完成后用水和30% 50%質量濃度乙醇進行梯度洗脫；9)在30°C 40°C的溫度和O. 06 O. IMPa的壓力下將步驟8)中30% 50%質量濃度乙醇洗脫液置于旋轉蒸發儀中減壓濃縮無醇味，然后干燥即得到樺褐孔菌多酚產品。所述的步驟I)中高壓處理的壓力為100KPA，溫度為121°C。所述的步驟8)中大孔樹脂為D101，上樣流速為2 3倍柱體積/h ;每個梯度的洗脫量為3倍柱體積 4倍柱體積。所述的步驟4)、7)和9)中干燥所采用的裝置為冷凍干燥機、熱風干燥機或真空干燥機。本發明提供的從樺褐孔菌中提取留體類化合物、多糖和多酚的方法與現有提取方法的最大區別在于本發明先采用高壓滅菌鍋在適宜的時間條件下對原料進行高壓處理，以對原料進行前處理，然后利用乙醇提取法獲得含留體類的提取物，再用水洗和離心的方法純化留體類化合物，用水提法獲得多糖和多酚的提取物，然后醇沉分離多糖和多酚。由于高壓處理使得樺褐孔菌組織結構發生變化，因而留體類化合物、多糖和多酚的收率高，而且在高壓的作用下，樺褐孔菌中活性成分分子的結構會發生變化，可使其活性增強。另外，由于樺褐孔菌是珍惜資源，采用本方法可以促進資源的綜合利用。此外，本方法還具有工藝簡單的優點。


圖I為利用本發明提供的方法及現有提取方法從樺褐孔菌中提取留體類化合物、 多糖和多酚得率直方圖。圖2為利用本發明提供的方法及現有提取方法從樺褐孔菌中提取的留體類化合物、多糖和多酚抑制丙二醛(MDA)生成能力實驗結果直方圖。
圖3為利用本發明提供的方法及現有提取方法從樺褐孔菌中提取的留體類化合物、多糖和多酚還原力能力實驗結果直方圖。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例對本發明提供的從樺褐孔菌中提取留體類化合物、多糖和多酚方法進行詳細說明。實施例I :I)將樺褐孔菌在電磨中粉碎成粉末，然后在高壓滅菌鍋中(100ΚΡΑ，121 )高壓處理I小時，以對原料進行前處理；2)將上述經過高壓處理的樺褐孔菌加入到80%質量濃度的乙醇中，所述樺褐孔菌與乙醇的質量比為I : 20，然后在90°C的溫度下回流提取2小時，反復浸提3次，之后減壓過濾,將濾液合并而得到含有留體類化合物的樺褐孔菌供試液；3)在60°C的溫度和O. IMPa的壓力下將上述含有留體類化合物的樺褐孔菌供試液置于旋轉蒸發儀中減壓旋蒸至無乙醇，用體積為上述濃縮后樺褐孔菌供試液10倍量的水混懸洗滌，之后離心分離，收集沉淀物；4)將上述收集的沉淀物用冷凍干燥機、熱風干燥機或真空干燥機進行干燥即可得到留體類化合物類產品，其得率為O. 96%，用香草醛-冰醋酸法測得其留體含量為 78. 20% ；5)在步驟2)中提取后的殘渣中加入去離子水，所述樺褐孔菌殘渣與去離子水的質量比為I : 30，然后在100°C的溫度下回流提取2小時，反復浸提3次，之后減壓過濾，將濾液合并而得到含有樺褐孔菌多糖和多酚的樺褐孔菌供試液；6)在60°C的溫度和O. IMPa的壓力下將上述含有樺褐孔菌多糖和多酚的樺褐孔菌供試液置于旋轉蒸發儀中減壓濃縮至原體積的1/4，然后在濃縮液中加入乙醇至乙醇質量濃度70%以上進行沉淀，之后離心分離，分別收集沉淀物和上清液；然后用3倍體積的無水乙醇對上述沉淀物進行洗滌脫色5次，之后離心分離，收集二次沉淀物；7)將步驟6)中收集的二次沉淀物用冷凍干燥機、熱風干燥機或真空干燥機進行干燥即可得到樺褐孔菌多糖產品，其得率為7. 69%，用硫酸-苯酚法測得其多糖含量為 43. 73% ；8)將步驟6)中得到的上清液濃縮至無醇味，然后采用動態上樣的方法，上樣到預處理好的DlOl大孔樹脂柱子上，上樣流速為3倍柱體積/h ;上樣完成后用水和30%乙醇進行洗脫，每個梯度洗脫4倍柱體積；9)在40°C的溫度和O. IMPa的壓力下將步驟8)中30%質量濃度乙醇洗脫液置于旋轉蒸發儀中減壓濃縮無醇味，然后用冷凍干燥機、熱風干燥機或真空干燥機等干燥即可得到樺褐孔菌多酚產品。經Folin-Ciocalteu比色法測定多酚的含量為25. 40%，得率為 I. 65%。實施例2 I)將樺褐孔菌在電磨中研成粉末，然后在高壓滅菌鍋中(100ΚΡΑ，121 )高壓處理2小時，以對原料進行前處理；2)將上述經過高壓處理的樺褐孔菌加入到80%質量濃度的乙醇中，所述樺褐孔菌與乙醇的質量比為I : 15，然后在80°C的溫度下回流提取I. 5小時，反復浸提3次，之后減壓過濾，將濾液合并而得到含有留體類化合物的樺褐孔菌供試液；3)在50°C的溫度和O. 08MPa的壓力下將上述含有留體類化合物的樺褐孔菌供試液置于旋轉蒸發儀中減壓旋蒸至無乙醇，用體積為上述濃縮后樺褐孔菌供試液7倍量的水混懸洗滌，之后離心分離，收集沉淀物；4)將上述收集的沉淀物用冷凍干燥機、熱風干燥機或真空干燥機進行干燥即可得到留體類化合物類產品，其得率為I. 06%，用香草醛-冰醋酸法測得其留體含量為 83. 97% ；5)在步驟2)中提取后的殘渣中加入去離子水，所述樺褐孔菌殘渣與去離子水的質量比為I : 20，然后在80°C的溫度下回流提取I. 5小時，反復浸提3次，之后減壓過濾， 將濾液合并而得到含有樺褐孔菌多糖和多酚的樺褐孔菌供試液；6)在50°C的溫度和O. 08MPa的壓力下將上述含有樺褐孔菌多糖和多酚的樺褐孔菌供試液置于旋轉蒸發儀中減壓濃縮至原體積的1/8，然后在濃縮液中加入乙醇至乙醇質量濃度70%以上進行沉淀，之后離心分離，分別收集沉淀物和上清液；然后用2. 5倍體積的無水乙醇對上述沉淀物進行洗滌脫色4次，之后離心分離，收集二次沉淀物；7)將步驟6)中收集的二次沉淀物用冷凍干燥機、熱風干燥機或真空干燥機進行干燥即可得到樺褐孔菌多糖產品，其得率為9. 00%，用硫酸-苯酚法測得其多糖含量為 43. 59% ；8)將步驟6)中得到的上清液濃縮至無醇味，然后采用動態上樣的方法，上樣到預處理好的DlOl大孔樹脂柱子上，上樣流速為2. 5倍柱體積/h ;上樣完成后用水和50%質量濃度乙醇進行洗脫，每個梯度洗脫3. 5倍柱體積；9)在35°C的溫度和O. 08MPa的壓力下將步驟8)中50 %質量濃度乙醇洗脫液置于旋轉蒸發儀中減壓濃縮無醇味，然后用冷凍干燥機、熱風干燥機或真空干燥機進行干燥即可得到樺褐孔菌多酚產品。經Folin-Ciocalteu比色法測定多酚的含量為20. 27%，得率為 I. 22%。實施例3 I)將樺褐孔菌在電磨中研成粉末，然后在高壓滅菌鍋中(100ΚΡΑ，121 )高壓處理3h，以對原料進行前處理；2)將上述經過高壓處理的樺褐孔菌加入到80%質量濃度的乙醇中，所述樺褐孔菌與乙醇的質量比為I : 10，然后在80°C的溫度下回流提取I小時，反復浸提3次，之后減壓過濾,將濾液合并而得到含有留體類化合物的樺褐孔菌供試液；3)在40°C的溫度和O. 06MPa的壓力下將上述含有留體類化合物的樺褐孔菌供試液置于旋轉蒸發儀中減壓旋蒸至無乙醇，用體積為上述濃縮后樺褐孔菌供試液5倍量的水混懸洗滌，之后離心分離，收集沉淀物；4)將上述收集的沉淀物用冷凍干燥機、熱風干燥機或真空干燥機進行干燥即可得到留體類化合物類產品，其得率為O. 82%，用香草醛-冰醋酸法測得其留體含量為 81. 48% ；5)在步驟2)中提取后的殘渣中加入去離子水，所述樺褐孔菌殘渣與去離子水的質量比為I : 10，然后在90°C的溫度下回流提取I小時，反復浸提3次，之后減壓過濾，將濾液合并而得到含有樺褐孔菌多糖和多酚的樺褐孔菌供試液；6)在40°C的溫度和O. 06MPa的壓力下將上述含有樺褐孔菌多糖和多酚的樺褐孔菌供試液置于旋轉蒸發儀中減壓濃縮至原體積的1/10，然后在濃縮液中加入乙醇至乙醇質量濃度70%以上進行沉淀，之后離心分離，分別收集沉淀物和上清液；然后用3倍體積的無水乙醇對上述沉淀物進行洗滌脫色3次，之后離心分離，收集二次沉淀物；7)將步驟6)中收集的二次沉淀物用冷凍干燥機、熱風干燥機或真空干燥機進行干燥即可得到樺褐孔菌多糖產品，其得率為8. 03%，用硫酸-苯酚法測得其多糖含量為 42. 68% ；8)將步驟6)中得到的上清液濃縮至無醇味，然后采用動態上樣的方法，上樣到預處理好的DlOl大孔樹脂柱子上，上樣流速為2倍柱體積/h ;上樣完成后用水和40%質量濃度乙醇進行洗脫，每個梯度洗脫3倍柱體積；9)在30°C的溫度和O. 06MPa的壓力下將步驟8)中40%質量濃度乙醇洗脫液置于旋轉蒸發儀中減壓濃縮無醇味，然后用冷凍干燥機、熱風干燥機或真空干燥機進行干燥即可得到樺褐孔菌多酚產品。經Folin-Ciocalteu比色法測定多酚的含量為22. 85%，得率為 I. 24%。本發明人將利用上述本發明提供的方法及現有提取方法從樺褐孔菌中提取樺褐孔菌留體類化合物、多糖和多酚的得率繪制成圖，結果見圖I。另外，本發明人對利用上述實施例提供的從樺褐孔菌中提取樺褐孔菌留體類化合物、多糖和多酚方法所獲得的樺褐孔菌留體類化合物、多糖和多酚抑制丙二醛(MDA)生成能力和還原力能力進行了實驗。據報道，脂質過氧化能對細胞造成很大的損傷，它是一種主要的過氧自由基，MDA 是引起人體衰老、致病、致癌的重要因素之一。因此，測定MDA的含量不僅可以反映細胞脂質過氧化的程度，而且可以反映MDA對細胞的損害程度。顯然樣品的還原能力和起抗氧化能力之間有著直接的關系。樣品的還原能力的機制來自于打斷自由基的鏈，或者和自由基的前體物反應從而阻止過氧基的形成。抑制丙二醛(MDA)生成能力和還原力能力實驗所使用的樺褐孔菌甾體類化合物、 多糖和多酚均是采用高壓處理條件的方法獲得的，并與未處理的現有的方法所獲得的樺褐孔菌留體類化合物、多糖和多酚進行了對比。抑制丙二醛(MDA)生成能力實驗結果見圖2。結果顯示，與未處理的現有方法所獲得的樺褐孔菌甾體類化合物、多糖和多酚相比，利用本發明方法所獲得的樺褐孔菌甾體類化合物、多糖和多酚對小鼠MDA生成的抑制能力均得到不同程度的增強。還原力能力實驗結果見圖3。結果顯示，與未處理的現有方法所獲得的樺褐孔菌甾體類化合物、多糖和多酚相比，利用本發明方法所獲得的樺褐孔菌留體類化合物、多糖和多酚還原力能力均得到不同程度的增強。
權利要求
1.一種從樺褐孔菌中綜合提取留體類化合物、多糖和多酚的方法，其特征在于所述的從樺褐孔菌中提取留體類化合物、多糖和多酚的方法包括按順序進行的下列步驟1)將樺褐孔菌在電磨中粉碎成粉末，然后在高壓滅菌鍋中高壓處理I 3小時，以對原料進行前處理；2)將上述經過高壓處理的樺褐孔菌加入到80%質量濃度的乙醇中，所述樺褐孔菌與乙醇的質量比為I : 10 I : 20，然后在80°C 90°C的溫度下回流提取I 2小時，反復浸提3次，之后減壓過濾，將濾液合并而得到含有留體類化合物的樺褐孔菌供試液；3)在40°C 60°C的溫度和O.06 O. IMPa的壓力下將上述含有甾體類化合物的樺褐孔菌供試液置于旋轉蒸發儀中減壓旋蒸至無乙醇，用體積為上述濃縮后樺褐孔菌供試液 5 10倍體積的水混懸洗滌，之后離心分離，收集沉淀物；4)將上述收集到的沉淀物干燥即得到留體類化合物產品；5)在步驟2)中提取后的殘渣中加入去離子水，所述樺褐孔菌殘渣與去離子水的質量比為I : 10 I : 30，然后在90°C 100°C的溫度下回流提取I 2小時，反復浸提3次， 之后減壓過濾，將濾液合并而得到含有樺褐孔菌多糖和多酚的樺褐孔菌供試液；6)在40°C 60°C的溫度和O.06 O. IMPa的壓力下將上述含有樺褐孔菌多糖和多酚的樺褐孔菌供試液置于旋轉蒸發儀中減壓濃縮至原體積的1/10 1/4，然后在濃縮液中加入乙醇至乙醇質量濃度為70%以上進行沉淀，之后離心分離，分別收集沉淀物和上清液； 然后用2 3倍體積的無水乙醇對上述沉淀物進行洗滌脫色3 5次，之后離心分離，收集二次沉淀物；7)將步驟6)中收集的二次沉淀物干燥即得到樺褐孔菌多糖產品；8)將步驟6)中得到的上清液濃縮至無醇味，然后采用動態上樣的方法，上樣到預處理好的大孔樹脂柱子上；上樣完成后用水和質量濃度為30% 50%的乙醇進行梯度洗脫；9)在30°C 40°C的溫度和O.06 O. IMPa的壓力下將步驟8)中30% 50%乙醇洗脫液置于旋轉蒸發儀中減壓濃縮無醇味，然后干燥即得到樺褐孔菌多酚產品。
2.根據權利要求I所述的從樺褐孔菌中提取留體類化合物、多糖和多酚的方法，其特征在于所述的步驟I)中高壓處理的壓力為100KPA，溫度為121°C。
3.根據權利要求I所述的從樺褐孔菌中提取留體類化合物、多糖和多酚的方法，其特征在于所述的步驟8)中大孔樹脂為D101，上樣流速為2 3倍柱體積/h ;每個梯度的洗脫量為3倍柱體積 4倍柱體積。
4.根據權利要求I所述的從樺褐孔菌中提取留體類化合物、多糖和多酚的方法，其特征在于所述的步驟4)、7)和9)中干燥所采用的裝置為冷凍干燥機、熱風干燥機或真空干燥機。
全文摘要
一種從樺褐孔菌中綜合提取甾體類化合物、多糖和多酚的方法。其包括高壓處理、乙醇提取、濃縮、離心、去離子水提取、濃縮、乙醇沉淀、分離、純化、冷凍干燥等步驟。本發明提供的方法與現有提取方法的最大區別在于本發明先在適宜的時間條件下對原料進行高壓處理，以對原料進行前處理，然后利用乙醇提取法獲得含甾體類的提取物，再用水洗和離心的方法純化甾體類化合物，用水提法獲得多糖和多酚的提取物，然后醇沉分離多糖和多酚。由于高壓處理使得樺褐孔菌組織結構發生變化，因而甾體類化合物、多糖和多酚的收率高，而且在高壓的作用下，樺褐孔菌中活性成分分子的結構會發生變化，并通過本研究驗證可使其活性增強。
文檔編號C08B37/00GK102579511SQ20121006433
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月13日 優先權日2012年3月13日
發明者張寧, 章鈺, 陳海霞, 馬利帥 申請人:天津大學