一種從馬齒莧中提取的活性糖蛋白及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種從馬齒莧中提取的活性糖蛋白及其制備方法，所述方法包括以下步驟：首先利用NaCl溶液提取馬齒莧中的活性糖蛋白，獲得提取液，然后用超濾器對提取液進行濃縮和脫鹽，獲得濃縮液，再用無水乙醇沉淀，最后凍干，獲得所述活性糖蛋白。本發明的有益效果在于：所述方法獲得的活性糖蛋白的得率大，純度高，同時，所述活性糖蛋白與現有技術相比，其抑制氧自由基和清除羥自由基的活性有很大提高。
【專利說明】一種從馬齒莧中提取的活性糖蛋白及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及活性糖蛋白的提取，尤其涉及的是一種從馬齒莧中提取的活性糖蛋白及其制備方法。
【背景技術】
[0002]馬齒莧是一種野生植物，廣泛分布在我國大部分地區，其莖和葉可食用，每100g新鮮的馬齒莧中含有蛋白質約2.4g，脂肪0.5g，碳水化合物3g，纖維lg，同時還含有Vbl、Vb2、VC、VE、胡蘿卜素、黃酮類等有效成分，具有很高的營養價值和藥用價值。
[0003]實驗證明，馬齒莧多糖和糖蛋白都具有較強的抗氧化和清除氧自由基的能力，可用于治療腸炎、痢疾、闌尾炎、乳腺炎等多種嚴重疾病，外用可治療丹毒及毒蛇咬傷，素有“天然抗生素”的美稱，同時，馬齒莧多糖和糖蛋白還能預防各類腫瘤疾病的發生。現有技術中，對馬齒莧多糖的研究很多，但對活性糖蛋白及其提取方法的研究和報道很少，尤其是如何在提高得率和純度的情況下保證糖蛋白的活性，一直是現有技術中存在的不足之處。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種從馬齒莧中提取的活性糖蛋白及其制備方法，該方法提取的活性糖蛋白的得率和純度最佳。
[0005]本發明是通過以下技術方案實現的:
[0006]一種從馬齒莧中提取活性糖蛋白的方法，包括以下步驟:
[0007](I)取新鮮馬齒莧，洗凈后，每克馬齒莧中加入2ml的NaCl溶液，研磨至漿狀，然后在每克馬齒莧中再加入8ml的NaCl溶液，攪拌均勻，獲得研磨液，其中，所述NaCl溶液的質量百分比為O~6% ；
[0008](2)將上述研磨液攪拌，離心，獲得上清和沉淀；
[0009](3)取上述沉淀，每克沉淀中加5ml的NaCl溶液，重復步驟(2)；
[0010](4)重復步驟(3) I~3次，獲得上清，合并上清，得到提取液；
[0011](5)利用超濾器對上述提取液進行濃縮、脫鹽，當所述提取液的體積減小到原體積五分之一時，即為濃縮液；
[0012](6)將濃縮液中加入無水乙醇，沉淀4小時后離心，獲得沉淀，將所述沉淀凍干，得灰白色粉末，即為活性糖蛋白，其中，所述無水乙醇的終濃度的體積百分比為30%~90%，步驟(I)~(6)的整個提取過程的溫度在40°C以下。
[0013]優選地，所述步驟(1)中，NaCl溶液的質量百分比為4.5%，活性糖蛋白的得率和純度隨著NaCl溶液的質量百分比的增加而增加，當NaCl溶液的質量百分比為4.5%時，再增加NaCl溶液的濃度，活性糖蛋白的得率和純度增加不明顯，進一步地，當NaCl溶液的濃度的質量百分比超過12%時，活性糖蛋白的純度下降。
[0014]優選地，所述步驟(2)中，攪拌轉速為200rpm，攪拌時間為4小時。
[0015]優選地,所述步驟(2)或步驟(3)中，離心轉數為3000rpm,離心時間為20min。[0016]優選地，所述步驟(5)中，超濾器的截流分子量為5000道爾頓。
[0017]優選地,所述步驟(6)中，離心轉數為2000rpm,離心時間為20min。
[0018]優選地，所述步驟(6)中，無水乙醇為4~10°C預冷的無水乙醇；一般情況下，活性糖蛋白提取過程中的溫度不能超過40°C，若超過40°C，所述活性糖蛋白抑制氧自由基的活性會快速降低，而乙醇和水混合時會產生熱效應，因此，本發明中使用4~10°C預冷的無水乙醇沉淀濃縮液，可以保證活性糖蛋白的最大活性。
[0019]優選地，所述步驟(6)中，無水乙醇的終濃度的體積百分比為70% ;—般情況下，沉淀乙醇的濃度越高，則所述活性糖蛋白的得率越高，但純度卻越低，根據所得到的糖蛋白的凈量(得率X純度)計算可知，當無水乙醇的終濃度的體積百分比為70%時，所述的凈量最大，即提取的效果最佳。
[0020]一種從馬齒莧中提取的活性糖蛋白，其特征在于，所述活性糖蛋白是利用上述任一方法制備獲得。
[0021]本發明相比現有技術具有以下優點:本發明提供了一種從馬齒莧中提取的活性糖蛋白及其制備方法，該活性糖蛋白具有抑制氧自由基和清除羥自由基的活性，用該方法提取的活性糖蛋白的得率大，純度高，能最大限度保持所述活性；實驗證明，該活性糖蛋白的所述活性與現有技術相比提高了 100倍。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022]圖1是NaCl溶液的濃度對馬齒莧糖蛋白得率的影響的曲線圖；
[0023]圖2是NaCl溶液的濃度對馬齒莧糖蛋白純度的影響的曲線圖；
[0024]圖3是無水乙醇的終濃度對馬齒莧糖蛋白得率和純度的影響的曲線圖。
【具體實施方式】
[0025]下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。
[0026]實施例1
[0027]1、提取活性糖蛋白的步驟:
[0028](I)取Ig新鮮馬齒莧，洗凈后，加入NaCl溶液2ml，研磨至漿狀，再補加NaCl溶液8ml，攪拌均勻，獲得研磨液；
[0029](2)將上述研磨液于200rpm下攪拌4小時,然后在3000rpm下離心20min,獲得上
清和沉淀；
[0030](3)取上述沉淀，稱得沉淀質量為0.8g，加入4ml的NaCl溶液，3000rpm下離心20min,獲得上清和沉淀；
[0031](4)重復步驟(3)，獲得上清，合并上清，得到提取液；
[0032](5)利用超濾器對上述提取液進行濃縮、脫鹽，當所述提取液的體積減小到原體積五分之一時，即為濃縮液，其中，所述超濾器的截留分子量為5000道爾頓；
[0033](6)將濃縮液中加入25°C的無水乙醇，沉淀4小時，然后在2000rpm下離心20min，獲得沉淀，將所述沉淀凍干，得灰白色粉末，即為活性糖蛋白，所述無水乙醇的終濃度為80%。
[0034]本實施例中，步驟(1)和步驟(3)中NaCl溶液的質量百分比設置為七個梯度小組:0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%。
[0035]2、活性糖蛋白得率的測定:
[0036]稱取上述獲得的活性糖蛋白的質量，除以新鮮馬齒莧的質量，即為所述得率，結果如圖1所示，圖中可以看出，馬齒莧糖蛋白的得率隨著NaCl溶液的質量百分比的增加而增加，當NaCl溶液的質量百分比增大到4%時，所述得率的變化趨于平穩。
[0037]3、活性糖蛋白純度的測定:
[0038]將上述獲得的活性糖蛋白進行蛋白質電泳，得到糖蛋白純度，結果如圖2所示，圖中可以看出，馬齒莧糖蛋白的純度隨著NaCl溶液的質量百分比的增加而增加，當NaCl溶液的質量百分比增大到4%時，所述純度的變化趨于平穩。[0039]實施例2
[0040]1、提取活性糖蛋白的步驟:
[0041 ] (I)取2g新鮮馬齒莧，洗凈后，加入NaCl溶液4ml，研磨至漿狀，再補加NaCl溶液16ml，攪拌均勻，獲得研磨液，所述NaCl溶液的質量百分比為4.5% ；
[0042](2)將上述研磨液于200rpm下攪拌4小時,然后在3000rpm下離心20min,獲得上清和沉淀；
[0043](3)取上述沉淀，稱得沉淀的質量為1.6g，加入步驟(1)中所述的NaCl溶液8ml，3000rpm下離心20min,獲得上清和沉淀；
[0044](4)重復步驟(3) 3次，獲得上清，合并上清，得到提取液；
[0045](5)利用超濾器對上述提取液進行濃縮、脫鹽，當所述提取液的體積減小到原體積五分之一時，即為濃縮液，其中，所述超濾器的截留分子量為5000道爾頓；
[0046](6)將濃縮液中加入10°C預冷的上述無水乙醇，沉淀4小時，然后在2000rpm下離心20min，獲得沉淀，將所述沉淀凍干，得灰白色粉末，即為活性糖蛋白。
[0047]本實施例中，步驟(6)中無水乙醇的終濃度的體積百分比設置為七個梯度小組:30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%。
[0048]2、活性糖蛋白的得率的測定:
[0049]稱取獲得的活性糖蛋白的質量，除以新鮮馬齒莧的質量，即為所述得率，如圖3所示，圖中可以看出，馬齒莧糖蛋白的得率隨著無水乙醇的終濃度的增加而增加。
[0050]3、活性糖蛋白的純度的測定:
[0051]將上述獲得的活性糖蛋白進行蛋白質電泳，計算得到糖蛋白純度，如圖3所示，圖中可以看出，當無水乙醇的終濃度的體積百分比為70%時，所述馬齒莧糖蛋白的純度最大，過高或過低，純度都會降低。
[0052]實施例3
[0053]1、活性糖蛋白提取步驟:
[0054](I)取Ig新鮮馬齒莧，洗凈后，加入4ml的NaCl溶液，研磨至漿狀，再補加8ml的NaCl溶液，攪拌均勻，獲得研磨液，所述NaCl溶液的質量百分比為4.5% ；
[0055](2)將上述研磨液于200rpm下攪拌4小時,然后在3000rpm下離心20min,獲得上清和沉淀；[0056](3)取上述沉淀，稱得沉淀的重量為0.7g，加入步驟(1)中所述的NaCl溶液3.5ml,重復步驟(2)，獲得上清和沉淀；
[0057](4)重復步驟(3) 2次，獲得上清，合并上清，得到提取液；
[0058](5)利用超濾器對上述提取液進行濃縮、脫鹽，當所述提取液的體積減小到原體積五分之一時，即為濃縮液，其中，所述超濾器的截留分子量為5000道爾頓；
[0059](6)將濃縮液中加入4°C的無水乙醇，所述無水乙醇的終濃度的體積百分比為70%,沉淀4小時,然后在2000rpm下離心20min,獲得沉淀,將所述沉淀凍干,得灰白色粉末，即為活性糖蛋白。
[0060]2、活性糖蛋白與馬齒莧多糖抑制氧自由基的活性檢測:
[0061]檢測方法為鄰苯三酚法，檢測結果如表1所示。
[0062]3、活性糖蛋白與馬齒莧多糖清除羥自由基的活性檢測(水楊酸法):
[0063]將獲得的活性糖蛋白溶于蒸餾水中，配制成5種不同濃度的受試物溶液，分別為:
0.lmg/ml、0.2mg/ml、0.8mg/ml、lmg/ml、4mg/ml。取 Iml 的 9mmol/L 硫酸亞鐵溶液、ImL 的9mmol/L水楊酸-乙醇、Iml受試物溶液,再加入Iml的8.8mmol/L過氧化氫啟動整個反應，混勻，370°C水浴反應30min，在510nm下測定吸光度，記作Al ;用蒸餾水代替過氧化氫作為陽性對照，在510nm下測定吸光度，記作A2 ;用蒸餾水代替受試物作為陰性對照，加入過氧化氫啟動整個反應，在510nm下測定吸光度，記作A0。實驗重復三次，獲得不同濃度的受試物溶液對羥基自由基的清除率的標準曲線，根據標準曲線計算獲得活性糖蛋白的濃度為5Xl(T2mg/ml時的清除率:
[0064]清除率=[A0-(A1-A2) ]/A0*100%
[0065]同時，用上述方法測定馬齒莧多糖的清除率，檢測結果如表1所示。
[0066]將實施例3獲得的活性糖蛋白與馬齒莧多糖的抑制氧自由基和清除羥自由基清除的活性進行比較，結果如下:
[0067]表1:活性糖蛋白與馬齒莧多糖的活性比較
【權利要求】
1.一種從馬齒莧中提取活性糖蛋白的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)取新鮮馬齒莧，洗凈后，每克馬齒莧中加入2ml的NaCl溶液，研磨至漿狀，然后在每克馬齒莧中再加入8ml的NaCl溶液，攪拌均勻，獲得研磨液，其中，所述NaCl溶液的質量百分比為O~6% ； (2)將上述研磨液攪拌，離心，獲得上清和沉淀； (3)取上述沉淀，每克沉淀加5ml的NaCl溶液，重復步驟(2)； (4)重復步驟(3)I~3次，獲得上清，合并上清，得到提取液； (5)利用超濾器對上述提取液進行濃縮、脫鹽，當所述提取液的體積減小到原體積五分之一時，即為濃縮液； (6)將濃縮液中加入無水乙醇，沉淀4小時后離心，獲得沉淀，將所述沉淀凍干，得灰白色粉末，即為活性糖蛋白，其中，所述無水乙醇的終濃度的體積百分比為30%~90%，步驟(I)~(6)的整個提取過程的溫度在40°C以下。
2.如權利要求1所述的一種從馬齒莧中提取活性糖蛋白的方法，其特征在于，所述步驟(I)中，NaCl溶液的質量百分比為4.5%。
3.如權利要求1所述的一種從馬齒莧中提取活性糖蛋白的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，攪拌轉速為200rpm，攪拌時間為4小時。
4.如權利要求1所述的一種從馬齒莧中提取活性糖蛋白的方法，其特征在于，所述步驟(2)或步驟(3)中，離心轉數`為3000rpm,離心時間為20min。
5.如權利要求1所述的一種從馬齒莧中提取活性糖蛋白的方法，其特征在于，所述步驟(5)中，超濾器的截流分子量為5000道爾頓。
6.如權利要求1所述的一種從馬齒莧中提取活性糖蛋白的方法，其特征在于，所述步驟(6)中，離心轉數為2000rpm,離心時間為20min。
7.如權利要求1所述的一種從馬齒莧中提取活性糖蛋白的方法，其特征在于，所述步驟(6)中，無水乙醇為4~10°C預冷的無水乙醇。
8.如權利要求1所述的一種從馬齒莧中提取活性糖蛋白的方法，其特征在于，所述步驟(6 )中，無水乙醇的終濃度的體積百分比為70%。
9.一種從馬齒莧中提取的活性糖蛋白，其特征在于，所述活性糖蛋白是利用權利要求1~8任一方法制備獲得。
【文檔編號】C07K14/415GK103554237SQ201310477280
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月14日 優先權日:2013年10月14日
【發明者】孫鋒, 張寬朝, 阮飛 申請人:安徽農業大學