專利名稱：一種制備伐普肽的方法
技術領域：
本發明涉及一種制備伐普肽(V即reotide)的合成工藝。
背景技術：
本品所含伐普肽，其分子結構式為D-苯丙酰-L-半胱酰-L-酪氨酰-D-色氨 酰-L-賴氨酰-L-纈氨酰-L-半胱酰-L-色氨酰胺(2-7 二硫鍵)，是一個高效的生長激素 釋放抑制因子14肽的8肽同系物。體外實驗表明，本品能明顯抑制胰腺的分泌，其作用強 度比天然的生長激素釋放抑制因子更強，持續時間也更長。用實驗犬進行的研究表明，本品 對胰腺的作用與人工制備的生長激素釋放抑制因子14肽(SS14)和阿托品相似，但抑制碳 酸氫根(HC03_)分泌的作用是SS14的2 4倍，在較低劑量下即可抑制蛋白酶的分泌，作 用持續的時間也比SS14長。伐普肽是第一種表現出治療急性靜脈曲張破裂出血作用的生 長抑素類似物，能產生特異性的器官血管收縮作用，這種作用能有效地用于急性胃腸道出 血的止血，目前還在進行包括治療前列腺癌、肢端肥大癥等疾病的三期臨床實驗。
目前國內還沒有關于伐普肽合成工藝方法的報道；國外雖然有關于伐普肽合成工 藝的報道，也多是液相合成工藝，操作復雜，不利于工業生產、應用價值不高。
發明內容
本發明提出了一條較適當的路線，使用固相法合成線性伐普肽，且通過固相氧化 得到伐普肽，且操作方便、收率較高。 為實現上述目的，本發明采取以下技術方案一種制備伐普肽的方法，包括以下步 驟 1)由Fmoc—Trp (Boc)—0H禾口 Rink Amide Resin出發，f尋至lj Fmoc—Trp (Boc)—Rink Amide Resin ; 2)將Fmoc-Trp (Boc) -Rink Amide Resin采用固相合成法按肽序偶聯得到線性伐 普肽-Rink Amide Resin ; 3)采用固相氧化伐普肽-Rink Amide Resin ;4)裂解伐普肽-Rink Amide Resin，純化、凍干得到伐普肽。 其中，Rink Amide Resin即為Rink Amide樹脂，其替代度優選為0. 3mmo1/ g-0. 8mmol/g。所述固相合成法采用的偶聯劑包括DIC/H0Bt、PyB0P/H0Bt或TBTU/H0Bt，優 選DIC/H0Bt，其中"/"表示"和"的含義。 實驗發現，本發明的偶聯劑能夠明顯提高反應速率，同時DIC/H0Bt偶聯體系極大 的降低生產成本。 所述氧化伐普肽-Rink Amide Resin是由線性伐普肽-Rink AmideResin經過碘 固相氧化得到。碘的用量是伐普肽摩爾量的10-80倍，優選20倍。 傳統的線性肽氧化采用液相氧化，本發明采用了碘的固相氧化。本發明直接簡化 了生產工藝，提高了工藝的可操作性。碘的用量尤其重要，用量過少使氧化反應不能完全徹底，用量過多造成多聚物的產生，直接影響反應收率并給純化帶來困難，本發明碘的用量是 伐普肽摩爾量的10-80倍克服了以上困難，尤其采用20倍投料量可大幅度的提高了氧化收率。 固相氧化采用碘為氧化劑，反應溶劑為N， N- 二甲基甲酰胺或二氯甲烷，優選N， N-二甲基甲酰胺。 固相氧化采用碘為氧化劑，反應時間在8-12小時，優選10小時。 實驗發現，在氧化時間小于8小時，線性肽還有大量未氧化成環肽，而氧化時間大
于12小時，則發現部分線性肽之間成環，形成聚合物。本發明的氧化時間選擇10小時，粗
肽純度大于85%。 固相氧化采用碘為氧化劑，反應溫度在10°C _40°C 。優選35°C 。 實驗發現反應溫度低于1(TC時，氧化反應收率不及50^，而反應溫度大于4(TC
時，發現氨基酸極易發生消旋，產生難以分離的雜質肽。本發明的氧化反應溫度為35t:時，
在減少了氨基酸消旋的情況下，提高了氧化收率及反應速率。 裂解伐普肽-Rink Amide Resin，裂解液為TFA/H20的體積比為95/5， TFA/H20/ TIS的體積比為95/2. 5/. 25，TFA/thioanisole/anisole/EDT的體積比為90/5/3/2，或TFA/ thioanisole/H20/phenol/EDT的體積比為82. 5/5/5/5/2. 5，優選TFA/thioanisole/H20/ phenol/EDT的體積比為82. 5/5/5/5/2. 5。其中TFA為三氟乙酸，TIS為三異丙基硅烷， thioanisole為甲基苯基硫醚，anisole為苯甲醚，EDT為1，2_乙二硫醇，phenol為苯酚。 其中'7"表示"和"的含義。 對伐普肽-Rink Amide Resin進行裂解，沉淀得到的粗肽，其沉淀液包括乙醚、環
己烷、石油醚、乙醚/石油醚、乙醚/環己烷，優選乙醚/石油醚的體積比為i : 1，其中'7"
表示"和"的含義。 所述伐普肽是通過對伐普肽-Rink Amide Resin進行裂解，得到的粗肽經過高壓
液相純化、凍干得到。
DIC
Fmoc-Trp(R6)-OH+ RinkAmideResin-Fmoc-Trp(R6)-RinkAmide樹脂$^1:*Fm0C，
HOBt
步驟2:偶聯
Fmoc-Cys(R5)-OH 重復步驟l
H-Trp(R6)-RinkAmideResin - Fmoc-Cys(R5)-Trp(R6)-RinkAmideResin-
D認OBt
Fmoc-D-Phe-Cys(Rl)-Tyr(R2)-D-Trp(3)-Lys(R4)-Val-Cys(R5)-Trp(R6)-RinkAmideResin
-H-D-Phe-Cys(Rl)-Tyr(R2)-D-Trp(3)-Lys(R4)-Val-Cys(R5)-Trp(R6)-RinkAmideResin
鵬 裂解 H-D-Phe-Cys(Rl )-Tyr(R2)-D-Trp(3)-Lys(R4)-Val-Cys(R5)-Trp(R6)-RinkAmideResin-
I_I
純化
H-D-Phe-Cys(Rl)-Tyr(R2)-D-Trp(3)-Lys(R4)-Val-Cys(R5)-T卬(R6)-NH2 ~:~~ Vapreotide I_ 1 其中Fmoc-Trp (R6) _0H代表與Rink Amide Resin相連的氨基酸 Fmoc-Cys (R5) _0H代表C端第二位氨基酸 DIC代表二異丙基碳二亞胺 H0Bt代表1-羥基苯并三唑 Rl為Trt R2為tBu R3為Boc R4為Boc R5為Trt R6為Boc 如反應方程式所描述的工藝將C端第一個氨基酸聯上Rink AmideResin，采用低 用量的投料比逐步耦聯合成線性伐普肽樹脂，再將線性伐普肽樹脂利用碘進行氧化得到伐 普肽環肽樹脂，最后裂解得到了純度高的粗肽，最后純化得到伐普肽。 本發明采用了在固相中碘氧化線性伐普肽樹脂，避免了傳統的液相氧化帶來操作 上的麻煩，并提高10% -20%的氧化收率。本發明工藝具有反應操作簡單、原料投入少、成 本低、收率較高等特點，反應的總產出率可達68%，粗肽純度85%。具有可觀的經濟實用價 值，同時在多肽藥物設計合成領域具有廣泛的應用前景。
具體實施例方式
實施例1 、 Fmoc-Trp (Boc) -RinkAmide樹脂制備 1、將50g Rink Amide Resin (Sub = 0. 8翻l/g)于反應瓶中，加入DMF洗滌兩次，再用DMF溶脹30分鐘。 2、用20 % DBLK脫除Rink Amide Resin的Fmoc保護基，脫除完畢用DMF洗滌4 次，DCM洗滌2次，并用茚三酮檢測法進行檢測，樹脂呈紅褐色。 3、稱取63. 2g Fmoc-Trp (Boc) -OH和19. 5g H0BT，加入500mlDMF和24. 4ml DIC，
溶解，加入反應瓶中，開始反應。 4、反應2h，結束反應，DMF洗滌三次，量取56. 4ml乙酸酐、48. 4ml吡啶混于400ml DMF中，加入反應瓶中封閉兩小時，再用DMF進行洗滌3次、DCM洗滌2次，甲醇洗滌2次，直 接用于下一步氨基酸偶聯。 實施例2、 Fmoc-Cys (Trt) -Trp (Boc) -Rink Amide Resin的制備 1、將Fmoc-Trp (Boc)-Rink Amide Resin用DMF洗滌干凈后，用20 % DBLK脫除
Fmoc，然后用DMF洗滌4次，DCM洗滌2次，并用茚三酮檢測法進行檢測，樹脂為黃色。 2、稱取70. 2g Fmoc-Cys (Trt) _0H， 19. 5g H0BT，加入500mlDMF和24. 4ml DIC，溶
解，加入反應瓶中，開始反應。 3、反應1. 5h，用茚三酮檢測法檢測，樹脂透明，結束反應。 4、反應結束，DMF洗滌3次，按伐普肽的肽序逐個偶聯氨基酸，直至最后一個氨基 酸。 實施例3、伐普肽的氧化 1、稱取203. 2g碘，溶解在500ml N， N_ 二甲基甲酰胺，溶解完畢后加入反應瓶，開 始氧化反應，反應體系溫度為35°C 。
2、氧化20h，氧化結束。 3、DMF洗滌5次，DCM洗滌4次，最后加入甲醇洗滌3次，抽干，得166g伐普肽-Rink Amide Resin。 實施例4、伐普肽-Rink Amide Resin的裂解 1、配制裂解液按TFA/thioanisole/H20/phenol/EDT體積比為82. 5/5/5/5/2. 5。
2、稱取166g伐普肽-Rink Amide Resin至2L圓底燒瓶中，加入1. 7L裂解液，冰 浴反應15分鐘，撤掉冰浴，攪拌反應2h。 3、反應結束，過濾，濾餅用少量三氟乙酸洗滌3次，合并濾液，將濾液倒入5L冰乙 醚中，靜置2h。 4、離心分離出粗肽，沉淀液洗滌3次，置于真空干燥器干燥至恒重，得白色粗肽
48. 8g，純度85 % ，合成收率68 % 。 在上述實施例中h為時間單位小時。
權利要求
一種制備伐普肽的方法，包括以下步驟1)由Fmoc-Trp(Boc)-OH和Rink Amide樹脂出發，得到Fmoc-Trp(Boc)-Rink Amide樹脂；2)將Fmoc-Trp(Boc)-Rink Amide樹脂采用固相合成法按肽序偶聯得到線性伐普肽-Rink Amide樹脂；3)采用固相氧化伐普肽-Rink Amide樹脂；4)裂解伐普肽-Rink Amide樹脂，純化、凍干得到伐普肽。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于Rink Amide樹脂替代度為0. 3mmo1/ g_0. 8mmol/g。
3. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述固相合成法采用的偶聯劑包括DIC/ H0Bt、 PyB0P/H0Bt或TBTU/H0Bt。
4. 根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述固相合成法采用的偶聯劑包括DIC/ H0Bt、 PyB0P/H0Bt或TBTU/H0Bt。
5. 根據權利要求1至4任意一項所述的方法，其特征在于固相氧化采用碘為氧化劑， 碘的用量是伐普肽摩爾量的10-80倍。
6. 根據權利要求1至4任意一項所述的方法，其特征在于固相氧化采用碘為氧化劑， 反應時間在8h-12h。
7. 根據權利要求5所述的方法，其特征在于固相氧化采用碘為氧化劑，反應時間在 8h-12h。
8. 根據權利要求1至4任意一項所述的方法，其特征在于固相氧化采用碘為氧化劑， 反應溫度在10°C _40°C。
9. 根據權利要求7所述的方法，其特征在于固相氧化采用碘為氧化劑，反應溫度在 10°C -40°C。
10. 根據權利要求9所述的方法，其特征在于裂解伐普肽-RinkAmide樹脂，裂解液 為TFA/H20的體積比為95/5， TFA/H20/TIS的體積比為95/2. 5/. 25， TFA/thioanisole/ anisole/EDT的體積比為90/5/3/2，或TFA/thioanisole/H20/phenol/EDT的體積比為 82. 5/5/5/5/2. 5。
全文摘要
本發明公開了一種制備伐普肽的方法，包括以下步驟1)由Fmoc-Trp(Boc)-OH和Rink Amide樹脂出發，得到Fmoc-Trp(Boc)-RinkAmide樹脂；2)將Fmoc-Trp(Boc)-Rink Amide樹脂采用固相合成法按肽序偶聯得到線性伐普肽-Rink Amide樹脂；3)采用固相氧化伐普肽-Rink Amide樹脂；4)裂解伐普肽-Rink Amide樹脂，純化、凍干得到伐普肽。本發明采用了在固相中碘氧化線性伐普肽樹脂，避免了傳統的液相氧化帶來操作上的麻煩，并提高10％-20％的氧化收率。本發明工藝具有反應操作簡單、原料投入少、成本低、收率較高等特點，反應的總產出率可達68％，粗肽純度85％。具有可觀的經濟實用價值。
文檔編號C07K7/06GK101712716SQ20091018908
公開日2010年5月26日 申請日期2009年12月18日 優先權日2009年12月18日
發明者李紅玲, 肖慶, 袁建成, 馬亞平 申請人:深圳市翰宇藥業有限公司