專利名稱：：一種多肽固相合成比法盧定粗品的制備方法
技術領域：
：本發明涉及多肽固相合成領域，尤其涉及比法盧定(Bivalirudin)粗品的固相合成方法。
背景技術：
：在肽合成的技術方面取得了突破性進展的是R.BruceMerrifield，他設計了一種肽的合成途徑并定名為固相合成途徑。首先將一個氨基被封閉基團保護的氨基酸共價連接在固相載體上；在去保護劑的作用下，脫掉氨基的保護基，這樣第一個氨基酸就接到了固相載體上了。然后氨基被封閉的第二個氨基酸的羧基通過試劑活化，羧基被DCC活化的第二個氨基酸再與已接在固相載體的第一個氨基酸的氨基反應形成肽鍵，這樣在固相載體上就生成了一個帶有保護基的二肽。重復上述肽鍵形成反應，使肽鏈從C端向N端生長，直至達到所需要的肽鏈長度。最后脫去保護基，用HF水解肽鏈和固相載體之間的酯鍵，就得到了合成好的肽。多肽合成是一個重復添加氨基酸的過程，固相合成順序一般從C端(羧基端)向N端(氨基端)合成。凝血酶抑制劑被認為是很有前途的抗血栓藥通過凝血酶進行的蛋白水解過程是血液凝結控制的關鍵所在。抗凝血肽比伐盧定(bivalirudin)，即所謂的"二價水蛭素(himlog)"。水蛭素是一種獲自吸血水蛭一醫用水蛭///n^ome^"'"fl/"的有效治療性凝血酶肽抑制劑，其包含20個氨基酸。US20070093423A公開了一種多肽固相合成比法盧定的方法，其采用固液相合成方法，其操作繁瑣，使用的切割劑中含有酸性物質、乙二硫醇等物質。該方法的成本較高，產生的雜質多，產品純度有限。因此，本領域迫切需要提供一種多肽固相合成比法盧定的新方法，其成本低廉、得到的比法盧定純度高，尤其可以去除HPLC主峰前雜質。
發明內容本發明旨在提供一種多肽固相合成比法盧定(Bivalirudin)的制備方法。本發明的另一個目的是提供一種多肽固相合成中的去保護劑。本發明的再一個目的是提供一種去保護劑在多肽固相合成中的應用。本發明的第四個目的是提供一種五氟苯酚的用途。在本發明的第一方面，提供了一種多肽固相合成比法盧定(Bivalirudin)的制備方法，所述的方法包括步驟(1)將Fmoc-氨基酸樹脂或Fmoc-多肽樹脂和去保護劑混合，除去Fmoc保護基；(2)在縮合劑的存在下，使帶有Fmoc或Boc的氨基酸和樹脂上的氨基酸或多肽進行縮合；(3)重復步驟(i)—(2)，得到如式n所示的多肽樹脂；和(4)在切割劑的存在下，使多肽樹脂上的多肽和樹脂分離，得到如式I所示的比法盧定；所述去保護劑以其總體積計，其中含有3—20%哌啶和0.5—10%二環脒(DBU);優選，所述的去保護劑中還含有選自下述的一種或多種物質0一20%1—羥基苯并三唑(H0Bt)、0—8%3-羥基-1,2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮(H00BT)D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-GIu-Tyr-Leu式IBoc陽D-Phe'-Pro2陽Arg(Pbf)3-Pro4-Gly5-Gly6-Gly7-Gly8-Asn(Trt)9-Gly"-Asp(OtBu)11.Phel2-Glu(OtBu)13-Glu(OtBu)"-Ile15-Pro16-GIu(OtBu)'7-Glu(OtBu)18-Tyr(tBu)19丄6112°曙樹脂式II在另一優選例中，所述的方法包括步驟(1)將樹脂或連接有氨基酸或多肽的樹脂和保護氨基酸混合，形成Fraoc-氨基酸樹脂或Fmoc-多肽樹脂；優選，所述的樹脂是Wang樹脂；(2)Fmoc-氨基酸樹脂或Fmoc-多肽樹脂和去保護劑混合，除去Fmoc保護基；(3)在縮合劑的存在下，使帶有Fmoc或Boc的氨基酸和樹脂上的氨基酸或多肽進行縮合；(4)重復步驟(2)—(3)，得到如式II所示的多肽樹脂；和(5)在切割劑的存在下，使多肽樹脂上的多肽和樹脂分離，得到如式I所示的比法盧定；所述去保護劑以其總體積計，其中含有3—20%哌啶和0.5—10%二環脒(DBU);優選，所述的去保護劑中還含有選自下述的一種或多種物質0一20%1—羥基苯并三唑(H0Bt)、0—8%3-羥基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)_酮(H00BT)D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu式IBoc-D-Phe'-ProZ隱Arg(Pbf)3-Pro4-GlyS-Gly6-Gly7-Gly8-Asn(Trt)9-Gly'0-Asp(O迅u)11.Phe'2-GIu(OtBu)"-Glu(OtBu)'4-Ile'5-Pro'6-Glu(OtBu)'乙Glu(OtBu)"-Tyr(tBu)'9-Leu2。-樹脂式II在另一優選例中，所述的去保護劑含有5—15%哌啶和1一7%二環脒(DBU);更佳地，所述去保護劑還含有選自下述的一種或多種物質0.5—10%1—羥基苯并三唑(H0Bt)、2—5%3-羥基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮3-羥基-1,2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮(H00BT)。在另一優選例中，步驟(1)和步驟(2)中所述的樹脂上的氨基酸是亮氨酸；步驟(2)中所述帶有Boc的氨基酸是Boc-D-Phe-0H。在另一優選例中，步驟(2)中將Fmoc-Arg(Pbf)-OH和五氟苯酚以及縮合劑混合，使Fmoc-Arg(Pbf)-0H和樹脂上的多肽進行縮合。在另一優選例中，步驟(2)中所述的縮合劑選自下述的一種或多種N，N，-二異丙基碳二亞胺(DIC)、0-(7-氮雜苯并三唑-;i-基)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸(HATU)、0-(苯并三唑-1-基)-N,N,N，N-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)/N-甲基嗎啉(麗M)、(苯并三唑-l-基-氧)三吡咯垸轔六氟磷酸(PyB0P)、l一羥基苯并三唑(H0Bt)。在另一優選例中，步驟(4)中所述的切割劑中的各物質配比為95—60三氟乙酸(TFA):5—10三異丙基硅烷(TIS):5—30水。在另一優選例中，所述切割液用冰水浴或其它致冷劑冷卻至0±2°C。在另一優選例中，所述的步驟(2)重復1一3次。在本發明的第二方面，提供了一種多肽固相合成中的去保護劑，所述去保護劑以其總體積計，其中含有3—20%哌啶和0.5—10%二環脒(DBU);更佳地，所述的去保護劑中還含有選自下述的一種或多種物質0_20%1—羥基苯并三唑(H0Bt)、0—10%3-羥基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮3-羥基-1,2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮(HOOBT)。在另一優選例中，所述的去保護劑中含有5—15%哌啶和1一7%二環脒(DBU);更佳地，所述去保護劑還含有選自下述的一種或多種物質0.5—10%1—羥基苯并三唑(HOBt)、0.2—5%3-羥基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮3-羥基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮(H00BT)。在本發明的第三方面，提供了一種去保護劑在多肽固相合成中的應用，所述去保護劑以其總體積計，其中含有3—20%哌啶和0.5—10%二環脒(DBU)，所述的多肽中含有-Asn-Gly-結構；更佳地，所述的去保護劑中還含有選自下述的一種或多種物質0—20%l—羥基苯并三唑(H0Bt)、0—10%3-羥基-1,2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮3-羥基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮(H00BT)。在本發明的第四方面，提供了一種五氟苯酚的用途，用于多肽固相合成中，將保護氨基酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH和樹脂上的氨基酸或多肽縮合的步驟。在另一優選例中，所述步驟是將1.5—6.0當量保護氨基酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH和五氟苯酚，以及1.5—6.0當量的縮合劑，和連接有氨基酸或多肽的樹脂混合12—36小時；所述的縮合劑選自下述的一種或多種N，N，-二異丙基碳二亞胺(DIC)、0-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸(HATU)、0-(苯并三唑-l-基)-N，N，N,N-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)、(苯并三唑-1-基-氧)三吡咯烷鱗六氟磷酸(PyB0P)、l一羥基苯并三唑(H0Bt)、N-甲基嗎啉(麗M)。據此，本發明提供了一種多肽固相合成比法盧定的新方法，其成本低廉、得到的比法盧定純度高，尤其可以去除HPLC主峰前雜質。具體實施方式發明人經過廣泛而深入的研究，意外地發現了在多肽固相合成比法盧定的過程中，如果使用含有DMF、哌啶、DBU、H0Bt、H00BT的去保護劑，可以使雜質最小化，尤其是DBU其對主峰前雜質的影響非常重要。進一步地，發明人發現在多肽固相合成過程中，針對-Asn-Gly-結構，使用含有哌啶、DBU、H00BT和H0Bt中的一種或多種物質組成的保護劑尤其有效。另外，發明人還發現，在多肽固相合成比法盧定的過程中，針對縮合步驟，可加入含有HOBt/DIC或TBTU/腿M的縮合劑，并且在縮合過程中進行監測；而針對縮合精氨酸(Arg)的步驟，其中還需含有五氟苯酚，可以有效降低成本。本發明中所使用的縮寫的含義列于下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>PyB0P(苯并三唑-l-基-氧)三吡咯烷鱗六氟磷酸如本文所用，"去保護劑"是指可以將連接在氨基酸上的氨基保護劑去除的化學試劑，所述的氨基保護劑可以使本領域熟知的，例如但不限于，Fmoc，Boc;優選地，本發明的去保護劑含有以其總體積計，含有3—20%哌啶和0.5—10%二環脒(DBU);優選，所述的去保護劑中還含有選自下述的一種或多種物質0—20%1—羥基苯并三唑(HOBt)、0—10%3-羥基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮(H00BT)。如本文所用，"縮合劑"是指使一個氨基酸的氨基和另一個氨基酸的羧基縮合形成肽鍵的化學試劑，可以使本領域熟知的，例如但不限于，碳二亞胺、ByP0B、HATU、TBTU。如本文所用，"切割劑"是指將同樹脂鍵合的多肽和樹脂分離的化學試劑，可以使本領域熟知的，例如但不限于，含有TFA的弱酸性溶液、HC1溶液。在本發明的一個實例中，本發明多肽固相合成比法盧定的制備方法包括以下步驟第一步，將Fmoc-亮氨酸(Fmoc-Leu)鍵合到樹脂上。所使用的樹脂可以使本領域所熟知的，優選Wang樹脂，更優選Wang樹脂的替代率為1.O-l.4mmol/g。第二步，使用本發明的去保護劑脫除Fnioc基團，即用本發明的去保護劑洗滌第一步所獲得的Fmoc-Leu-樹脂以去除Fmoc基團。第三步，是將Fmoc-氨基酸和樹脂上的氨基酸縮合，在本發明的一個優選例中，是將氨基酸根據式I所示的多肽自C端向N端逐一縮合，直至在樹脂上鍵合有如式I所示的多肽。第四步，在切割劑存在下，使多肽樹脂上的如式I所示多肽和樹脂分離，得到比法盧定。所述切割劑中含有TFA、TIS和水。在本發明的一個優選例中，第一步中將1.8—3.0倍的Fmoc_Leu-0H和Wang樹脂反應。在本發明的一個優選例中，第三步是將l.5-4.5倍樹脂當量的Fmoc-氨基酸，1.5-3.0倍樹脂當量的H0Bt用lmL/g樹脂量的DMF溶解后排加入到樹脂中，再加入2.0-6.0倍樹脂當量的DIC或TBTU反應90鐘后。將上述溶液在l(TC下，再用DMF將上述溶液稀釋至4mL/g樹脂的體積，反應6小時。在本發明的一個優選實施例中，第三步中有關Fmoc-Arg(Pbf)-0H的縮合步驟是這樣進行的1.5-6.0當量的Fmoc-Arg(Pbf)-0H和五氟苯酚，用3毫升每克樹脂量的DMF或KSCN溶解后，再加入1.5-6.0當量的縮合劑，如DIC或HATU或TBTU或PyB0P，攪拌90分鐘，將上述活化好的Fmoc-Arg(Pbf)-OPfp酯/DMF溶液加入到樹脂中，攪拌反應12-36小時。本發明通過上述四步得到的比法盧定，產率可以是90—125%，其純度可以達到77-93%。在本發明的一個優選例中，還可以將第四步得到的比法盧定進行沉降，是將第四步得到的如式I的多肽和MTBE或乙醚混合，形成多肽沉淀；較佳地，是用冰水浴或本領域熟知的其它致冷劑將MTBE或乙醚冷卻至零下10至0'C，用另一種醚洗滌、分離。將沉淀混合物過濾或離心分離沉淀，得到純化的比法盧定，其純度可達到90%或以上。本發明提到的上述特征，或實施例提到的特征可以任意組合。本案說明書所揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似特征的一般性例子。本發明的主要優點在于1、大大節約成本通過比較樹脂、特殊氨基酸的合成等方面的傳統工藝和本發明的工藝，可以降低成本約50%。2、降低雜質，提高純度現有技術中比伐盧定粗品中純度約77-93%左右，其中主峰前雜質可控制在〈1%。3、危險系數降低采用少量乙醚，大大提高了生產的安全性。乙醚閃點-45'C,沸點34.6°C,為極易燃化學物品。甲基叔丁基醚閃點-28°C，沸點55.3'C。4、環保，產生廢棄物少本發明的生產工藝完全為固相合成法，因此幾乎為無水生產，洗滌用的有機溶劑可回收循環再利用，產生廢棄物少。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分數、比率、比例、或份數按重量計。本發明中的重量體積百分比中的單位是本領域技術人員所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶質的重量。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。本發明實施例中所用HPLC方法為<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>本發明中比法盧定出峰時間約23.7分鐘，主要雜質為23-23.3分鐘,實施例1制備比法盧定1步驟一Fmoc-亮氨酸鍵合步驟2.0equivalentmolFmoc-亮氨酸，經2，6-二氯苯甲酰氯和吡啶活化與Wang樹脂(替代率1.2-1.4mmol/g)在N，N-二甲基甲酰胺溶液中反應。步驟二Fmoc脫除步驟用15%哌啶/5%DBU的DMF溶液30分鐘脫除Fmoc基團。再用DMF洗滌樹脂1遍；甲醇洗滌樹脂3遍；DMF洗滌樹脂3遍。Fmoc-氨基酸(Boc-D-Phe-0H最后一個氨基酸縮合)縮合步驟2.0-3.0倍樹脂當量的Fmoc-氨基酸，1.5倍樹脂當量的H0Bt用3mL/g樹脂量的DMF溶解后加入到樹脂中，再加入3.0倍樹脂當量的DIC.反應90鐘后，用茚三酮顯色法(Kaiser)監控，控制溫度到10oC，再用DMF將上述溶液稀釋至4mL/g樹脂的體積，反應6小時。Fmoc-Arg(Pbf)-OH縮合步驟1.5當量的Fmoc-Arg(Pbf)-OH和五氟苯酚用1毫升每克樹脂量的DMF溶解后，再加入6.0當量的HATU，攪拌90分鐘，將上述活化好的Fmoc-Arg(Pbf)-0Pfp酯/DMF溶液加入到樹脂中，控制溫度到5-8oC,攪拌反應48小時。用茚三酮顯色法(Kaiser)監控.合成完畢洗滌步驟完成多肽序列的所有氨基酸縮合后，樹脂用甲醇洗滌2遍，再用DMF洗滌3遍，最后用洗滌3遍。然后樹脂在真空下干燥直至很重。最后包裝好樹脂，并根據樹脂增重計算合成產率。步驟三切割液配制在一個合適大小的容器里將三氟乙酸(TFA)/三乙丙基硅烷(TIS)/水，按80:10:10(體積比)的配比混合，配制切割液。再將上述切割液用冰水浴或其它致冷劑冷卻至0土2°C。切割將多肽樹脂慢慢加入到冷卻好的切割液中，維持混合液溫度在5°C以下，在此溫度下攪拌反應2-3小時。過濾分離混合液，收集所有濾液，去除樹脂。沉降將甲基叔丁基醚(MTBE)冷卻至-100C，將過濾后多肽溶液加入其中形成多肽沉淀。將得到的固體沉淀用冷的乙醚洗滌3次。每次洗滌時，用足夠覆蓋離心袋或者過濾器中的固體沉淀的乙醚，并用刮鏟混合固體沉淀和乙醚，然后再次用用離心機分離沉淀，得到比法盧定I。產品干燥將如式I所示的比法盧定I多肽固體轉移到一個合適的容器中，在真空干燥箱或者干燥器中室溫干燥6小時以上。稱量多肽固體，并將其裝入一個合適的容器。產品純度85%，主峰前雜質(保留時間23.2分鐘)含量小于1%，最大單一雜質(保留時間26.3分鐘)含量小于2.5%。實施例2制備比法盧定2Fmoc-亮氨酸鍵合步驟3.0equivalentmolFmoc-亮氨酸經2，6-二氯苯甲酰氯和吡啶活化與Wang樹脂(替代率1.0-1.2mmol/g)在N，N-二甲基甲酰胺溶液中反應。樹脂上未反應的基團由苯甲酰氯/三乙胺封閉。步驟二Fmoc脫除步驟用5倍樹脂床層體積的10。/6哌啶/7。/。DBU/3。/。HOOBT的匿F溶液30分鐘脫除Fmoc基團。再用5倍樹脂床層體積的DMF洗滌樹脂1遍；5倍樹脂床層體積的甲醇洗滌樹脂3遍；5倍樹脂床層體積的DMF洗滌樹脂3遍。Fmoc-氨基酸(Boc-D-Phe-0H最后一個氨基酸縮合)縮合步驟1.5-2.0倍樹脂當量的Fmoc-氨基酸，3.0倍樹脂當量的HOBt用5mL/g樹脂量的DMF溶解后加入到樹脂中，再加入3.0倍樹脂當量的TBTU/麗M.反應90鐘后，小時用茚三酮顯色法(Kaiser)監控反應是否結束，繼續反應。Fmoc-Arg(Pbf)-0H縮合步驟6.0當量的Fmoc-Arg(Pbf)-0H和五氟苯酚用4毫升每克樹脂量的DMF溶解后，再加入1.5當量的DIC，攪拌90分鐘，將上述活化好的Fmoc-Arg(Pbf)-OPfp酯/DMF溶液加入到樹脂中，攪拌反應18小時。合成完畢洗滌步驟完成多肽序列的所有氨基酸縮合后，樹脂用5倍樹脂體積的甲醇洗滌2遍，再用5倍體積的DMF洗滌3遍，最后用5倍樹脂體積的甲醇洗滌3遍。然后樹脂在真空下干燥直至很重。最后包裝好樹脂，并根據樹脂增重計算合成產率。步驟三切割液配制在一個合適大小的容器里將三氟乙酸(TFA)/三乙丙基硅烷(TIS)/水，按90:5:5(體積比)的配比混合，配制切割液。再將上述切割液用冰水浴或其它致冷劑冷卻至0±2°C。多肽樹脂和切割液混合，維持混合液溫度在5°C以下。反應2-3小時。過濾，收集所有濾液。沉降乙醚冷卻至_10°(:，將多肽溶液加入其中，形成多肽沉淀。用過濾或離心分離沉淀。將得到的固體沉淀用冷的甲基叔丁基醚洗滌3次。每次洗滌時，用足夠覆蓋離心袋或者過濾器中的固體沉淀的甲基叔丁基醚，并用刮鏟混合固體沉淀和甲基叔丁基醚，然后再次用用離心機分離沉淀，得到比法盧定n。產品干燥將如式I所示的比法盧定多肽II固體轉移到一個合適的容器中，在真空干燥箱或者干燥器中室溫干燥6小時以上。稱量多肽固體，并將其裝入一個合適的容器。產品純度87%，主峰前雜質(保留時間23.5分鐘)含量0.63%，最大單一雜質(保留時間27.l分鐘)含量2.1%。以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并非用以限定本發明的實質技術內容范圍，本發明的實質技術內容是廣義地定義于申請的權利要求范圍中，任何他人完成的技術實體或方法，若是與申請的權利要求范圍所定義的完全相同，也或是一種等效的變更，均將被視為涵蓋于該權利要求范圍之中。權利要求1.一種多肽固相合成比法盧定(Bivalirudin)的制備方法，其特征在于，所述的方法包括步驟(1)將Fmoc-氨基酸樹脂或Fmoc-多肽樹脂和去保護劑混合，除去Fmoc保護基；(2)在縮合劑的存在下，使帶有Fmoc或Boc的氨基酸和樹脂上的氨基酸或多肽進行縮合；(3)重復步驟(1)-(2)，得到如式II所示的多肽樹脂；和(4)在切割劑的存在下，使多肽樹脂上的多肽和樹脂分離，得到如式I所示的比法盧定；所述去保護劑以其總體積計，其中含有3-20％哌啶和0.5-10％二環脒(DBU)；優選，所述的去保護劑中還含有選自下述的一種或多種物質0-20％1-羥基苯并三唑(HOBt)、0-8％3-羥基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮(HOOBT)<tablesid="tabl0001"num="0001"><table><tgroupcols="2"><colspeccolname="c001"colwidth="91%"/><colspeccolname="c002"colwidth="9%"/><thead></column></row><row><column><entrymorerows="1">D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu</entry><entrymorerows="1">式I</entry></column></row></thead><tbody></column></row><row><column><entrymorerows="1">Boc-D-Phe1-Pro2-Arg(Pbf)3-Pro4-Gly5-Gly6-Gly7-Gly8-Asn(Trt)9-Gly10-Asp(OtBu)11-Phe12-Glu(OtBu)13-Glu(OtBu)14-Ile15-Pro16-Glu(OtBu)17-Glu(OtBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-樹脂</entry><entrymorerows="1">式II</entry></column></row></tbody></tgroup></column></row><table></tables>。2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的去保護劑含有5一15%哌啶和1一7%二環脒(DBU);優選，所述去保護劑還含有選自下述的一種或多種物質0.5—10%1—羥基苯并三唑(H0Bt)、2—5%3-羥基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮3-羥基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮(H00BT)。3.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)和步驟(2)中所述的樹脂上的氨基酸是亮氨酸；步驟(2)中所述帶有Boc的氨基酸是Boc-D-Phe-0H。4.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中將Fmoc-Arg(Pbf)-0H和五氟苯酚以及縮合劑混合，使Fmoc-Arg(Pbf)-0H和樹脂上的多肽進行縮合。5.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述的縮合劑選自下述的一種或多種N，N'-二異丙基碳二亞胺(DIC)、0-(7-氮雜苯并三唑-l-基)-N，N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸(HATU)、0_(苯并三唑-1-基)-N,N，N,N-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)/N-甲基嗎啉(NMM)、(苯并三唑-1-基-氧)三吡咯烷鱗六氟磷酸(PyB0P)、l一羥基苯并三唑(H0Bt)。6.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(4)中所述的切割劑中的各物質配比為95—60三氟乙酸(TFA):5—IO三異丙基硅烷(TIS):5—30水。7.—種多肽固相合成中的去保護劑，其特征在于，所述去保護劑以其總體積計，其中含有3—20%哌啶和0.5—10%二環脒(DBU);優選，所述的去保護劑中還含有選自下述的一種或多種物質0—20%1—羥基苯并三唑(HOBt)、0—腦3-羥基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮3-羥基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮(HOOBT)。8.—種去保護劑在多肽固相合成中的應用，其特征在于，所述去保護劑以其總體積計，其中含有3—20%哌啶和0.5—10%二環脒(DBU)，所述的多肽中含有-Asn-Gly-結構；優選，所述的去保護劑中還含有選自下述的一種或多種物質0—20%l—羥基苯并三唑(HOBt)、0—10%3-羥基-1，2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮3-羥基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮(HOOBT)。9.一種五氟苯酚的用途，其特征在于，用于多肽固相合成中，將保護氨基酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH和樹脂上的氨基酸或多肽縮合的步驟。10.如權利要求9所述的用途，其特征在于，所述步驟是將1.5—6.0當量保護氨基酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH和五氟苯酚，以及1.5_6.0當量的縮合劑，和連接有氨基酸或多肽的樹脂混合12—36小時；所述的縮合劑選自下述的一種或多種N，N，-二異丙基碳二亞胺(DIC)、0-(7-氮雜苯并三唑-l-基)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸(HATU)、0-(苯并三唑-1_基)-N，N,N，N-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)、(苯并三唑-l-基-氧)三吡咯烷鱗六氟磷酸(PyBOP)、1—羥基苯并三唑(HOBt)、N-甲基嗎啉(NMM)。全文摘要本發明公開了一種多肽固相合成比法盧定(Bivalirudin)粗品的制備方法，所述的方法包括步驟(1)將Fmoc-氨基酸樹脂或Fmoc-多肽樹脂和去保護劑混合，除去Fmoc保護基；(2)在縮合劑的存在下，使帶有Fmoc或Boc的氨基酸和樹脂上的氨基酸或多肽進行縮合；(3)重復步驟(1)-(2)，得到如式II所示的多肽樹脂；和(4)在切割劑的存在下，使多肽樹脂上的多肽和樹脂分離，得到如式I所示的比法盧定；所述去保護劑以其總體積計，其中含有3-20％哌啶和0.5-10％二環脒(DBU)。文檔編號C07K1/04GK101555274SQ20091005131公開日2009年10月14日申請日期2009年5月15日優先權日2009年5月15日發明者劉亞東,張國慶,張若平,白俊才申請人:上海昂博生物技術有限公司