專利名稱：：雙特異性抗體及其制造方法
技術領域：
：本發明涉及產生雙特異性抗體的新方法，并涉及可以通過這些方法獲得的雙特異性抗體。
背景技術：
：人免疫球蛋白G(IgG)抗體存在4種具有不同結構和功能性質的亞型。IgG包括兩個重鏈-輕鏈對(半分子)，它們通過位于鉸鏈區中的重鏈間二硫鍵連接。人IgG4分子存在多種分子形式，它們的區別在于位于鉸鏈區中的重鏈間二硫鍵的有無。IgG4分子以兩個重鏈間二硫鍵均已形成或者均未形成的形式存在(6，7)。然而，不論是否存在這些鏈間二硫鍵(6，8)，人IgG4在溶液中均以由兩個Ig重鏈和兩個輕鏈組成的四聚體形式存在，這是免疫球蛋白G分子的共同性質，因為在CH3結構域之間和在CHl和CH2結構域之間存在相對強的非共價相互作用(4)。只有在非還原條件下發生變性時，兩個非共價關聯的半分子才會解離，如大小測定分析(size-determinationanalysis)例如SDS-PAGE所表現的(6，9)。幾年來人們已經知道，人IgG4分子與其它的IgG亞類不同，以單價分子形式與抗原相互作用。已經發現，血清來源的人IgG4不能沉淀純化的抗原，因為它不能交聯。雖然這種血清來源的IgG4在功能上是單價的(1，2)，但與之形成對照的是，重組產生的IgG4在與抗原相互作用中的行為表現為二價(3)。根據這些觀察結果，有人提出，血清中的IgG4分子能夠交換半分子(即，由一個重鏈和一個輕鏈構成的分子)，結果產生雙特異性分子，這樣的分子不能交聯相同的抗原(3-5)。這種半分子交換過程在本文也被稱作“Fab臂交換”。雙特異性抗體作為治療藥物的潛力是令人感興趣的，因為它們可以用作例如調節物，使效應物機制重新靶向于疾病相關的位點。然而，開發雙特異性抗體的其中一個主要的障礙就是通過傳統的技術，例如雜交瘤和化學偶聯方法，難以產生足夠量和品質的材料(10)。WO2005/062916介紹了用于在小鼠體內基于IgG4形成多聚分子的方法。此外，WO2005/062916還介紹，在鹽緩沖液中體外共同溫育兩種具有不同抗原結合特異性的IgG4抗體可形成能夠同時與兩種抗原反應的產物。然而，WO2005/062916中沒有證明，這些產物是聚集體還是雙特異性的抗體，并且反應的產出在所用條件下較低。發明概要現在人們驚奇地發現，在還原條件下，兩種具有不同抗原結合特異性的IgG4_或IgG4-樣抗體能夠進行高效的半分子交換，從而形成雙特異性抗體，而不會伴隨形成聚集體(aggregates)0因此，在第一個主要方面中，本發明涉及一種用于產生雙特異性抗體的體外方法，所述方法包括如下步驟a)提供具有第一結合特異性的第一抗體，其中所述第一抗體包含IgG4_樣CH3區，b)提供具有不同于所述第一結合特異性的第二結合特異性的第二抗體，其中所述第二抗體包含IgG4-樣CH3區，c)在允許核心鉸鏈區的半胱氨酸發生二硫鍵異構化的還原條件下共同溫育所述第一和第二抗體，和d)獲得雙特異性抗體。不受限于任何具體的理論，我們認為抗體的兩個區域對其進行半分子交換的能力具有重要的影響。首先，半分子交換的能力可能受到分子的核心鉸鏈區中的序列差異的影響，因為在核心鉸鏈區中具有CPSC序列的抗體，例如IgG4，比具有CPPC核心鉸鏈序列的抗體，例如IgGl，更容易交換。不受限于任何理論，提出這樣的假設，即CPSC序列導致核心鉸鏈(core-hinge)更有柔性(flexible)，并使鏈內二硫鍵的形成成為可能。值得一提的是，核心鉸鏈的結構與蛋白質-二硫化物_異構酶(PDI)的活性結構域CXXC相似。不同同種型的PDI的這些CXXC基序催化蛋白質中二硫鍵的形成、還原和重排。因此，不受限于任何具體的理論，認為具有IgG4-樣核心鉸鏈序列的抗體可能具有內在的重排二硫鍵的活性，這種活性被本發明方法中所用的條件所激發。第二，同樣不受限于任何理論，結果顯示為了允許交換反應發生，CH3區的序列應當是IgG4-樣，即使得不會形成強的半分子間相互作用。在另一個主要方面中，本發明涉及通過本發明的方法獲得的或者可以通過本發明的方法獲得的分離的雙特異性抗體，并涉及包含這樣的抗體的藥物組合物。在進一步的方面中，本發明涉及一種包含兩個IgG4_樣CH3區的分離的雙特異性抗體，并涉及包含這樣的抗體的藥物組合物。在更進一步的方面中，本發明涉及一種用于選擇具有期望性質的雙特異性抗體的方法，所述方法包括如下步驟a)提供一系列抗體，其中每種抗體具有不同的靶標特異性，并且其中每種抗體包含IgG4-樣CH3區，b)在還原條件下將所述系列中的每種抗體與所述系列中的另一種抗體進行溫育，從而產生一系列的抗體混合物，其中每種混合物包含不同的雙特異性抗體(adifferentbispecificantibody),c)測定所得的一系列抗體混合物的給定的期望性質，和d)選擇具有期望性質的雙特異性抗體混合物。附圖簡述圖1.經純化的重組IgGl和IgG4的SDS-PAGE分析。純化之后，將Betvl和Feldl，IgGl和IgG4抗體在非還原SDS-PAGE上進行分析。圖2.nu/nuBalb/c小鼠體內，在不同時間點上雙特異性IgG的水平。將異源交聯測定確定的雙特異性IgG的量對Betvl結合測定確定的Betvl特異性IgG的量進行作圖。含IgGl血漿樣品和含IgG4血漿樣品的數據分別用空心和實心符號表示。虛線代表在IgG半分子交換是隨機且完全的條件下雙特異性IgG的計算量。圖3.在體內產生雙特異性人IgG4分子。㈧各組SCID小鼠(η=5)注射嵌合抗體混合物100μgIgGl-Betvl/100μglgGl-Feldl(正方形)，100μgIgG4_Betvl/100μgIgG4-Feldl(圓形)，或3)100μgIgG4_Betvl/100μgIgG4_Feldl+2,000μg無關重組IgG4(IgG4-EGFR；三角形)。通過評估血漿中針對Betvl和Feldl的雙特異性活性來隨時間追蹤雙特異性抗體的產生。雙特異性IgG相對于總IgG-Betvl濃度的分數用百分比表示。帶星號的箭頭指示在過量的無關IgG4的存在下接受IgG4-BetVl/IgG4-Feldl的小鼠體內預期的雙特異反應性水平(4%)，不帶星號的箭頭指示接受IgG4-BetVl/IgG4-Feldl混合物的小鼠體內預期的雙特異反應性水平(50%)。誤差棒代表SEM。(B)通過評估小鼠血漿中放射性標記的Feldl與Feldl偶聯S印harose的交聯來測試單特異交聯活性。單特異反應性表示為通過交聯結合的放射性標記Feldl的量與總IgG-Feldl的比值，以便校正IgG的清除。誤差棒表示SEM。圖4.小鼠血漿中雙特異活性的SEC分析。將在t=24h時從給予了一種IgG4混合物的小鼠獲得的血漿(10μ1)在Superdex200柱上進行分離。小鼠被給予了含有300μgBetvl結合性IgG4和300μgFeldl結合性IgG4的混合物。在級分中Feldl特異性IgG(■)的濃度在抗原結合試驗中測量，雙特異性IgGBetvl-FeldK·)的濃度在Betvl-Feldl交聯測定中確定。用IVIg對柱進行校準，結果顯示單體、雙體和聚集型IgG分別在12.9，11.0和8.4ml洗脫(數據未顯示)。圖5.IgG在全血組分中的交換是將嵌合IgG混合物在37°C的全血、血細胞、血漿和血清中溫育24h，之后在異源交聯測定(Feldl-Betvl)中測量雙特異活性，來評估IgG4和IgGl的交換。血液從兩個供體獲得A(黑色條形)和B(灰色條形)。確定在添加了嵌合IgG4(圖A)、嵌合IgGl(圖B)或者沒有添加IgG(圖C)的混合物中的雙特異性活性。所有提供的數據均是在37°C溫育24h后測量的。圖6.人血細胞的IgG交換在37°C將嵌合IgG混合物與單個核細胞(MNC)、血小板(Thr)和紅細胞(Ery)溫育48h，之后在異源交聯測定(Feldl-Betvl)中測量雙特異活性，來評估IgG4(黑色條形)和IgGl(灰色條形)的交換。作為對照，還在無血清培養基(SFC)中溫育抗體混合物。雙特異性表示為被結合的125I-Betvl相對于總添加量的百分比。圖7.HEK和小鼠細胞系的IgG4交換在37°C將嵌合IgG混合物與HEK細胞、小鼠B細胞(J558)或雜交瘤細胞溫育，來評估IgG4半分子的交換。在異源交聯測定(Feldl-Betvl)中對分別在t=Oh(灰色條形)和t=24h(黑色條形)獲取的1μ1樣品中的雙特異活性進行測量。雙特異性表示為被結合的125I-Betvl與總添加量的百分比。圖8.紅細胞介導的IgG4交換將IgG4-BetVl/IgG4-Feldl混合物與新鮮純化的紅細胞(ery，實心符號)溫育產生了雙特異性抗體，而對于IgGl同種型的混合物沒有觀察到雙特異性。作為對照，將抗體混合物在無紅細胞的PBS中溫育(空心符號)。箭頭指示雙特異性IgG的最大預期百分比(50%)。誤差棒表示重復測量結果的范圍。圖9.IgG4在PBS中的交換通過測量雙特異活性(圖A)、二價性和抗原結合來評估IgGl(白柱)，IgG4(灰色條形)和IgG4在過量的無關IgG4(黑色條形)存在下在PBS中的交換。圖A中IgG半分子的交換是從雙特異IgG的濃度(在異源交聯測定中確定)和假設IgG半分子的交換是隨機且完全的情況下雙特異IgG的最大預期濃度計算而得的。交換表示為占最大交換的百分比，最大交換為100%。在圖B中描繪了隨時間變化的Feldl二價性，其是在同源交聯測定中測得的。將t=0時的二價IgG的濃度設定為100%，將二價IgG的濃度標準化。圖10.紅細胞裂解物的IgG4交換在來自紅細胞的裂解物中37°C溫育嵌合IgG4混合物來評估IgG4半分子的交換。將IgG4與遞增稀釋度的裂解物一起溫育。在異源交聯測定中對在所示時間點獲取的樣品進行雙特異活性(Betvl-Feldl)測量。雙特異性表達為被結合的125I-Betvl相對于添加量的百分比。圖11.受紅細胞裂解物誘導的雙特異活性的SEC分析將IgG4與新鮮制備的紅細胞裂解物在37°C溫育24h，隨后在SuperdeX200柱上進ifi雙。Superdex200HPLC(AmershamBiosciences,Uppsala,Sweden)±以0.5ml/min運行。級分中Betvl特異性IgG(■)的濃度在抗原結合測定中進行測量，雙特異性IgGFeldl-Betvl(·)的濃度在Betvl-Feldl交聯測定中加以確定。對該柱進行校準，結果顯示單體、雙體和聚集型IgG分別在12.1,10.3和8.3ml洗脫(數據未顯示)。圖12.GSH介導的IgG4交換通過在PBS/疊氮化物(Azide)中遞增濃度GSH的存在下溫育IgG4來評估GSH介導的IgG4半分子交換。在所示的時間點采取樣品，測量其中的抗原結合和雙特異活性。IgG4半分子的交換是從雙特異性IgG的測得濃度(在異源交聯測定中確定)以及假定IgG4半分子的交換是隨機且完全的情況下雙特異性IgG4的最大預期濃度計算而得的。交換表示為占最大交換的百分比，最大交換設定為100%。圖13.GSH介導的IgG4半分子交換的SECIgG4與GSH(0.5mM)溫育，隨后在Superdex200柱上進行分離。Superdex200柱在AktaHPLC單元(AmershamBiosciences,Uppsala,Sweden)上以0.5ml/min運行。級分中Betvl特異IgG(_)的濃度在抗原結合測定中進行測量，雙特異性IgGFeldl-Betvl(·)的濃度在Betvl-Feldl交聯測定中加以確定。對該柱進行校準，結果顯示單體、雙體和聚集型IgG分別在12.1,10.3和8.3ml洗脫(數據未顯示)。圖14.GSH介導的IgG4交換的溫度依賴性將IgG4_Betvl及IgG4_Feldl混合物在示明的溫度下在PBS中與GSH溫育。在t=Oh(灰色條形)和t=24h(黑色條形)，對雙特異性IgG4的濃度進行評估。由這些數據計算雙特異性IgG相對于IgG4Betvl濃度的分數，并表示為百分比。誤差棒表示重復測量的范圍。圖15.由一組還原劑介導的IgG4交換將PBS中的IgG4_Betvl和IgG4_Feldl在不同作用劑(全部為還原性，GSSG除外)的存在下在37°C溫育24h。Betvl特異性IgG的濃度在Betvl結合測定中進行測量，雙特異性IgG的濃度在異源交聯測定(Feldl-Betvl)中進行測量。計算雙特異性IgG相對于IgG-Betvl濃度的百分比。標準誤差棒表示從三次測量計算出的SEM。圖16.使用GSH的完全人類IgG4抗體的交換(A)將IgG4-CD20/IgG4-EGFr或IgGl-CD20/IgGl-EGFr混合物在有或者沒有0.5mMGSH的條件下在37°C進行溫育。在示明的時間點采取樣品。在夾心式ELISA中測量雙特異性抗體的形成。Y軸表示405nm的光密度，作為雙特異性CD20/EGFR抗體形成的量度。(B)GSH劑量依賴性的IgG4交換。將IgG4_CD20和IgG4_EGFr的混合物與所示濃度的GSH37°C溫育24h。雙特異性抗體的形成在夾心式ELISA中測量。在Y軸上繪制405nm的光密度，作為雙特異性CD20/EGFR抗體形成的量度。(C)GSH-介導的IgG4半分子交換受到反應中所用成分的影響，并且在較低GSH濃度的培養基(Freestyle293)中發生。(D)GSH-介導的IgG4半分子交換在0.5mMGSH比在5mMGSH更高。(E/F)通過ESI-TOF質譜檢測IgG4_EGFR和IgG4_CD20之間的Fab臂交換。IgG4混合物在不存在(E)或存在(F)O.5mMGSH的條件下溫育24小時，之后用PNGaseF使抗體去糖基化，并通過ESI-TOF質譜確定所得抗體的分子量。圖中顯示的是經去卷積(deconvoluted)ESI-TOF質譜。數據代表2次實驗的結果。圖17.獼猴IVIg參與重組人IgG4抗體的Fab臂交換A)將兩種重組人IgG4抗體(IgG4-⑶20和IgG4_EGFr)的混合物在存在或不存在純化獼猴免疫球蛋白或人IVIg的條件下在37°C與GSH溫育24h。雙特異性抗體通過Fab臂交換的形成在夾心式ELISA.中進行測量。B)將兩種重組人IgG4抗體(IgG4-⑶20和IgG4_EGFr)的混合物在存在或不存在過量(圓括號內所示)的來自數種動物(來源也示于圓括號中)的純化獼猴免疫球蛋白或人IVIg的條件下在37°C與GSH溫育24h。在夾心式ELISA.中測量雙特異性抗體通過Fab臂交換的形成。C)將兩種重組人IgG4抗體(IgG4-⑶20和IgG4_EGFr)的混合物在存在或不存在過量(圓括號內所示)的經純化的黑猩猩、狒狒、食蟹猴(cynomolgousmonkey)、馬和豬免疫球蛋白(圓括號內也指示了來源)或人IVIg的條件下在37°C與GSH溫育24h。在夾心式ELISA中測量雙特異性抗體通過Fab臂交換的形成。圖18.恒定區序列下劃線的序列代表CH3區圖19.IgGl突變體的GSH介導的半分子交換(A)用0、0.1、1和IOmMGSH測試GSH濃度對不同IgGl突變體的半分子交換的影響。交換的測試使用如下的混合物-IgG4a-feldlwt禾口IgG4a-betvlwt(圖中表示為IgG4wt)-IgGla-feldlwt禾口IgG4a_betvlwt(表示為IgGlwt)-IgGla-feldlCPSC和IgGla-betvlCPSC(表示為IgGl-CPSC)-IgGla-feldlCH3(IgG4)和IgGla_betvlCH3(IgG4)(表示為IgGl_CH3(IgG4))-IgGla-feldlCPSC-CH3(IgG4)和a-betvlIgGlCPSC_CH3(IgG4))(表示為IgGl-CPSC_CH3(IgG4))(B)用0.5和5mMGSH測試GSH濃度對不同IgGl突變體與野生型IgG4(IgG4wt)分子的半分子交換的影響。交換的測試使用如下的混合物-IgGla-feldlwt和IgG4a_betvlwt(表示為IgGl)-IgGla-feldlCPSC和IgG4a_betvlwt(表示為IgGl-CPSC)-IgGla-feldlCH3(IgG4)和IgG4a_betvlwt(表示為IgGl_CH3(IgG4))-IgGla-feldlCPSC-CH3(IgG4)和IgG4a_betvlwt(表示為IgGl_CPSC_CH3(G4))-IgGla-feldlR238Q和IgG4a_betvlwt(表示為IgGl_R238Q)-IgGla-feldlK292R和IgG4a_betvlwt(表示為IgGl_K292R)-IgGla-feldlQ302E和IgG4a_betvlwt(表示為IgGl_Q302E)-IgGla-feldlP328L和IgG4a_betvlwt(表示為IgGl_P328L)-IgGla-feldlCPSC-K292R和IgG4a-betvlwt(表示為IgGl_CPSC_K292R)-IgG4a-feldlwt禾口IgG4a_betvlwt(表示為IgG4)(C)用0.5和5mMGSH測試GSH濃度對不同IgGl突變體的半分子交換的影響。交換的測試使用如下的混合物-IgGla-feldlwt和IgGla-betvlwt(表示為IgGl)-IgGla-feldlCPSC和IgGla-betvlCPSC(表示為IgGl-CPSC)-IgGla-feldlCH3(IgG4)和IgGla-betvlCH3(IgG4)(表示為IgGl_CH3(IgG4))-IgGla-feldlCPSC-CH3(IgG4)和IgGla-betvlCPSC-CH3(IgG4)(表示為IgGl-CPSC-CH3(IgG4))-IgGla-feldlR238Q和IgGla-betvlR238Q(表示為IgGl_R238Q)-IgGla-feldlK292R和IgGla-betvlK292R(表示為IgGl_K292R)-IgGla-feldlQ302E和IgGla-betvlQ302E(表示為IgGl_Q302E)-IgGla-feldlP328L和IgGla-betvlP328L(表示為IgGl_P328L)-IgGla-feldlCPSC-K292R禾口IgGla-betvlCPSC_K292R(表示為IgGl-CPSC-K292R)-IgG4a-feldlwt禾口IgG4a_betvlwt(表示為IgG4)圖20.在0.5mMGSH下，具有野生型(IgG4)核心鉸鏈的IgG4分子參與重組人IgG4抗體的Fab臂交換，而具有IgGl核心鉸鏈的分子不參與。(A)兩種重組人IgG4抗體(IgG4-⑶20和IgG4-EGFr，如上文說明的)的混合物在存在或不存在過量(50和100微克/ml)的那他珠單抗(Tysabri)的條件下在37°C與0.5mMGSH溫育24h。在夾心式ELISA中測量雙特異性抗體通過Fab臂交換的形成。(B)將兩種重組人IgG4抗體(IgG4-CD20和IgG4-EGFr，如上所述)的混合物在存在或不存在等摩爾量(10微克/ml)的那他珠單抗(Tysabri)或吉妥單抗(Mylotarg)的條件下在37°C與0.5mMGSH溫育24h。在夾心式ELISA中測量雙特異性抗體通過Fab臂交換的形成。圖21.在292位點具有額外突變的IgGl-CPSC構建體的半分子交換。用0.5mMGSH測試不同IgGl突變體的半分子交換。交換的測試使用如下的混合物-IgGl-2F8wt和IgGl_7D8wt(表示為IgGl)-IgGl-2F8-CPSC和IgGl_7D8_CPSC(表示為IgGl-CPSC)-IgGl-2F8-CH3(IgG4)禾PIgGl_7D8_CH3(IgG4)(表示為IgGl_CH3(IgG4))-IgGl-2F8-CPSC-CH3(IgG4)禾口IgGl_7D8-CPSC_CH3(IgG4)(表示為IgGl-CPSC-CH3(IgG4))-IgGl-2F8-CPSC-R238Q和IgGl-7D8_CPSC-R238Q(表示為IgGl_CPSC_R238Q)-IgGl-2F8-CPSC-K292R和IgGl_7D8-CPSC_K292R(表示為IgGl_CPSC_K292R)-IgGl-2F8-CPSC-K292Y和IgGl_7D8-CPSC_K292Y(表示為IgGl_CPSC_K292Y)-IgGl-2F8-CPSC-K292F和IgGl_7D8-CPSC_K292F(表示為IgGl_CPSC_K292F)-IgGl-2F8-CPSC-K292ff和IgGl_7D8_CPSC-K292W(表示為IgGl_CPSC_K292W)-IgGl-2F8-CPSC-Q302E和IgGl-7D8_CPSC-Q302E(表示為IgGl_CPSC_Q302E)-IgGl-2F8-CPSC-P328L和IgGl-7D8-CPSC_P328L(表示為IgGl-CPSC_P328L)-IgG4-2F8wt禾口IgG4_7D8wt(表示為IgG4)在夾心式ELISA中測量雙特異性抗體通過Fab臂交換的形成。圖22.核心鉸鏈的穩定化可在體內保護IgG4抗體治療劑免于遭受Fab臂交換。(A)通過ESI-T0F質譜檢測IgG4_EGFR_CPPC和IgG4_CD20之間的Fab臂交換。將IgG4-EGFR-CPPC/IgG4-CD20混合物在5mMGSH的存在下(F)溫育24小時，之后用PNGaseF使抗體去糖基化，并通過ESI-T0F質譜確定所得抗體的分子量。圖中顯示了去卷積后的ESI-T0F譜。在使用5mMGSH時可以檢測到雙特異性EGFR/⑶20抗體(在沒有GSH或0.5mMGSH的條件下溫育未產生雙特異性抗體(數據未顯示))。(B)將數組(n=4)SCID小鼠用IgG4-CD20/IgG4_EGFR(空心圓)、IgG4_CD20/IgGl-EGFR和IgG4-CD20/IgG4-EGFR-CPPC等抗體混合物(每種300ug)進行注射。通過ELISA對雙特異性抗體的產生進行經時追蹤和定量。雙特異性抗體的定量使用體外交換的抗體混合物作為對照。數據點代表4只小鼠的在不同的實驗中至少測量2次的平均值士SEM。在IgG4-CD20/IgGl-EGFR和IgG4-CD20/IgG4_EGFR-CPPC混合物中未能檢測到雙特異性抗體。示明了測定的檢測限(虛線)，代表2000ng/ml的血清水平。圖23.CXXC-突變體的經時Fab臂交換將CXXC-突變抗體的混合物在37°C與0.5mMGSH溫育。在示明的時間點采取樣品。測量雙特異性抗體的形成。交換的測試使用如下的混合物-IgGla-feldlwt和IgGla-betvlwt(表示為IgGl)-IgG4a-feldlwt和IgG4a_betvlwt(表示為IgG4)-IgG4a-feldlCGHC和IgG4a_betvlCGHC(表示為CGHC)-IgG4a-feldlCGC和IgG4a_betvlCGC(表示為CGC)-IgG4a-feldlCPRC和IgG4a_betvlCPRC(表示為CPRC)-IgG4a-feldlCPHC和IgG4a_betvlCPHC(表示為CPHC)圖24:CXXC突變體的GSH介導的Fab臂交換用1-20，000uMGSH測試GSH濃度對CXXC突變體的Fab臂交換的影響。交換的測試使用如下的混合物-IgGla-feldlwt和IgGla-betvlwt(表示為IgGl)-IgG4a-feldlwt和IgG4a_betvlwt(表示為IgG4)-IgG4a-feldlCGHC和IgG4a_betvlCGHC(表示為CGHC)-IgG4a-feldlCGC和IgG4a_betvlCGC(表示為CGC)-IgG4a-feldlCPRC和IgG4a_betvlCPRC(表示為CPRC)-IgG4a-feldlCPHC和IgG4a_betvlCPHC(表示為CPHC)發明詳細說明定義術語“免疫球蛋白”是指一類結構相關的糖蛋白，由兩對多肽鏈，一對低分子量輕鏈(L)和一對重鏈(H)所構成，所有4條鏈均通過二硫鍵相互連接。免疫球蛋白的結構已經得到了詳盡的表征。見例如《FundamentalImmunology》第七章(Paul，W.，ed.，2nded.RavenPress,N.Y.(1989))(11)。簡而言之，每條重鏈典型地由一個重鏈可變區(本文縮寫為乂11或VH)和一個重鏈恒定區構成。重鏈恒定區通常由三個結構域構成CH1、CH2和CH3。每條輕鏈典型地由一個輕鏈可變區(本文縮寫為\或VL)和一個輕鏈恒定區構成。輕鏈恒定區通常由一個結構域Q構成。Vj^nt區可以進一步分為高可變性區(或高變區，其在序列和/或結構限定的環的形式上具有高度可變性)，也稱作補體決定區(CDR)，它們之間散布著更加保守的區，稱作框架區(FRs)。每個Vj^Pt通常由三個CDR和4個FR構成，從氨基端向羧基端的排列順序是FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(另見(12))。典型地，該區中氨基酸殘基用Kabat(13)所述的方法進行編號。使用該編號系統，肽的實際線性氨基酸序列可以包含更少或更多的氨基酸，相應于可變結構域的FR或CDR的縮短或插入。例如，重鏈可變結構域可以在VfDR2的52位殘基之后包含單氨基酸插入(依照Kabat的殘基52a)，和在重鏈FR的82位殘基之后插入殘基(例如依照Kabat的殘基82a，82b和82c等)。對于給定的抗體，可以通過將該抗體序列與一條“標準的”Kabat編號序列在同源區域處進行比對，來確定其殘基的Kabat編號。在本發明語境中，術語“抗體(Ab)”是指這樣的免疫球蛋白分子，免疫球蛋白分子的片段，或兩者之任一的衍生物，其能夠在典型的生理條件下以相當長時間的半衰期特異性結合抗原，例如至少大約30分鐘，至少大約45分鐘，至少大約1小時，至少大約2小時，至少大約4小時，至少大約8小時，至少大約12小時，大約24小時或者更長，大約48小時或者更長，大約3、4、5、6或更多天等，或者其它任何相關的功能上定義的時間段(例如足以誘導、促進、提高和/或調節與抗體結合抗原相關聯的生理響應的時間，和/或足以供抗體招募Fc介導的效應物活性的時間)。免疫球蛋白分子的重鏈和輕鏈可變區包含可以和抗原相互作用的結合結構域。抗體(Abs)的恒定區可以介導免疫球蛋白結合宿主組織或因子，包括免疫系統的各種細胞(例如效應細胞)，和補體系統的成分，例如Clq，經典補體激活途徑的第一個成分。如上文指出的，除非在另外指出或明顯與上下文矛盾，本文中的術語“抗體“包括含有突變的或野生型的核心鉸鏈區并保留特異性結合抗原的能力的抗體片段。已經顯示，抗體的抗原結合功能可以由全長抗體的片段來實施。術語“抗體”中涵蓋的結合性片段的實例包括例如F(ab‘)2片段，它們是二價片段，包括兩條Fab片段，這兩條片段通過位于鉸鏈區的一個二硫鍵相連。盡管這些片段一般包含在抗體的含義之內，但是它們作為總體以及各個獨立的個體都是本發明的獨特特征，展示不同的生物性質和效用。還應當理解，除非另外具體指出，術語“抗體”還包括通過任何已知的技術，例如酶切、肽合成和重組技術，所提供的多克隆抗體、單克隆抗體(mAbs)、類抗體多肽例如嵌合抗體和人源化抗體，以及保留特異性結合抗原能力的抗體片段(抗體結合片段)。所產生的抗體可以具有任何同種型。如本文所使用的，術語“人抗體”或“人類抗體”意圖包括具有來源于人種系免疫球蛋白序列的可變和恒定區的抗體。本發明的人抗體可以包括不是由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如由于體外隨機或定點突變或由于體內體細胞突變引入的突變)。然而，如本文所使用的，術語“人抗體”或“人類抗體”不意圖包括如下的抗體，其中來自另一哺乳動物物種(例如小鼠)的種系的CDR序列被移植到人類框架序列上。如本文所使用的，“分離的抗體，，意圖指示如下的抗體，其基本上不含其它具有不同抗原特異性的抗體。然而，特異性結合某種特定人靶抗原的表位、同種型或變異體的分離抗體可能具有與其它相關抗原(例如來源于其它物種的抗原(例如物種同源物))的交叉反應性。而且，分離的抗體可以基本不含其它的細胞材料和/或化學品。在本發明的一個實施方案中，將一組具有不同特異性的“分離”單克隆抗體組合在明確限定的組合物中。如本文所使用的，術語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”是指抗體分子單一分子組合物的制備物。單克隆抗體組合物顯示針對特定表位的單一結合特異性和親和性。因此，術語“人單克隆抗體”是指顯示單一結合特異性、且具有來源于人種系免疫球蛋白序列的可變和恒定區的抗體。人單克隆抗體可以由雜交瘤產生，雜交瘤包括相互融合的B細胞和永生化細胞，其中B細胞是從基因組中包含人重鏈轉基因和輕鏈轉基因的轉基因或轉染色體非人動物(例如轉基因小鼠)獲得的。如本文使用的，術語“結合”在某一抗體結合預定抗原的語境中通常是親和力相當于KD為大約1(TM或者更低，例如大約10_8M或者更低，例如大約10_9M或者更低，大約或者更低，或者大約10-"M或者更低的結合，所述KD例如使用BIAcore3000設備，以抗原作為配體，并以抗體作為分析物，通過表面等離子體共振(SPR)技術來加以確定；其結合預定抗原的親和力，相當于比其針對除該預定抗原或緊密相關抗原之外的非特異抗原(例如BSA、酪蛋白)的結合親和力的Kd至少低10倍，例如至少低100倍，例如至少低1000倍，例如至少低10，000倍，例如至少低100，000倍的Kd。親和力相差的量取決于抗體的KD，從而當抗體KD非常低(即抗體特異性很高)時，針對抗原的親和力較針對非特異抗原的親和力相差的量可以是至少10，000倍。如本文所使用的，術語“kd”(sec"1)是指特定抗體_抗原相互作用的解離速度常數。該值又稱為k。ff值。如本文所使用的，術語“ka”(M_iXsec"1)是指特定抗體-抗原相互作用的結合速度常數。如本文所使用的，術語“Kd”(M)是指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數。如本文所使用的，術語“Ka”(M-1)是指特定抗體-抗原相互作用的結合平衡常數，是通過ka除以kd獲得的。如本文所使用的，“同種型”是指由重鏈恒定區基因編碼的免疫球蛋白類型(例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM)。術語“表位”是指能夠特異結合抗體的蛋白決定簇。表位通常由表面分子集團(surfacegroupingsofmolecules)構成，例如氨基酸或糖側鏈，并且通常具有特異的三維結構特征，以及特異的電荷特征。構象性和非構象性表位的區別在于，在變性溶劑的存在下，與前者的結合會喪失，而后者不會。表位可以包括直接參與結合的氨基酸殘基(也稱作表位的免疫顯性組分)和不直接參與結合的其它氨基酸殘基，例如被特異性抗原結合肽有效封閉的氨基酸殘基(換言之，該氨基酸殘基位于特異抗原結合肽的足跡(footprint)內)。如本文所使用的，人抗體如果滿足下述條件，則是“來源于”或“衍生自”(derivefrom)特定的種系序列的該抗體是從使用人免疫球蛋白序列的系統獲得的，例如通過免疫攜帶人免疫球蛋白基因的轉基因小鼠或通過篩選人免疫球蛋白基因庫，且其中所選擇的人抗體的氨基酸序列與由該種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列具有至少90%，例如至少95%，例如至少96%，例如至少97%，例如至少98%，或者例如至少99%的同一性。典型地，在重鏈CD3之外，來源于特定人種系序列的人抗體將顯示與由該種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列不超過20個氨基酸的差異，例如不超過10個氨基酸的差異，例如不超過5個，例如不超過4、3、2或1個氨基酸的差異。術語“雙特異性抗體”意圖包括任何具有兩種不同的結合特異性的抗體，即該抗體結合兩種不同的表位，這兩種表位可以位于相同的靶抗原上，或者更一般地，位于不同的靶抗原上。如本文所使用的，術語“效應細胞”是指免疫響應效應期中，而不是免疫響應的識別期和激活期中所涉及的免疫細胞。免疫細胞的實例包括骨髓或淋巴來源的細胞，例如淋巴細胞(例如B細胞和T細胞，包括溶細胞性T細胞(CTL))、殺傷細胞、天然殺傷細胞、巨噬細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞、多形核細胞，例如嗜中性粒細胞、粒細胞、肥大細胞和嗜堿細胞。一些效應細胞表達特異的Fc受體，并執行特異的免疫功能。在一些實施方案中，效應細胞能夠誘導抗體依賴的細胞毒性(ADCC)，例如自然殺傷細胞能夠誘導ADCC。例如，表達FcR的單核細胞、巨噬細胞參與特異殺傷靶細胞、將抗原呈遞給免疫系統的其它成分、或結合呈遞抗原的細胞等作用。在一些實施方案中，效應細胞可以吞噬靶抗原或靶細胞。特定FcR在效應細胞上的表達可以被體液因子例如細胞因子所調節。例如，已經發現，FcyRI的表達被干擾素、(IFN-Y)和/或G-CSF上調。這種提高的表達可增加帶有FcyRI的細胞對靶標的細胞毒活性。效應細胞可以吞噬或裂解靶抗原或靶細胞。“治療”是指以緩解、減輕、阻止或根除(治愈)癥狀或疾病狀態為目的施用有效量的本發明治療活性化合物。“有效量”是指在必要的給藥劑量(dosage)或時程下，可有效獲得期望的治療結果的量。抗體的治療有效量可隨多種因素變化，例如個體的疾病狀態、年齡、性別和體重，和抗體在個體內引發期望的響應的能力。治療有效量同時還指抗體或抗體部分的治療有益效應超過任何毒性或有害效應。術語“IgG4-樣核心鉸鏈區”是指如下的核心鉸鏈區，其中半胱氨酸殘基與抗體分子中其它半胱氨酸/二硫橋相比顯著地更容易被還原和/或二硫鍵異構體化。因此，對于具有IgG4-樣核心鉸鏈區的抗體，可以找到這樣的還原性條件，在該條件下核心區的半胱氨酸殘基/二硫橋可以被還原，繼而與另一個半分子中的核心鉸鏈半胱氨酸形成二硫橋，而同時抗體內的其它二硫橋以及抗體的整體結構仍保持完整。例如，IgG4-樣核心鉸鏈區可以是IgG4核心鉸鏈區，或者是另一種同種型抗體的核心鉸鏈序列，其中核心區CPPC序列的其中一個脯氨酸被突變，例如突變成絲氨酸，如CPPC突變成CPSC。在本專利申請的語境中，術語“IgG4_樣CH3區”是指與IgG4(例如人IgG4)的CH3相同的CH3區，或者在功能上與IgG4CH3區等價的CH3區。在此語境中，“功能上等價”的意思是所述CH3區與IgG4的CH3區相似，不形成穩定的半分子間相互作用。給定的CH3區的穩定的半分子間相互作用的形成，可以通過用該CH3區替換IgG4的CH3，然后在實施例31或32給定的條件下進行交換測試來加以檢驗。如果觀察到交換，則沒有形成穩定的半分子間相互作用。例如，IgG4-樣CH3區可以是這樣的CH3區，其容許半分子交換的效率與來自IgG4的CH3區相當。由此，IgG4-樣CH3區可以在結構上與IgG4的CH3區相似，例如與IgG4的CH3區的序列有超過75%，例如超過90%的相似性。然而，作為附加條件或者替代條件，在此語境下IgG4-樣CH3區可以是這樣的CH3區，它在結構上與IgG4的CH3區不相近，但具有相似的功能特征，即它不含任何參與和其它包含相同的CH3區氨基酸序列的肽形成二硫鍵或共價或穩定非共價重鏈間鍵(例如鹽橋)的氨基酸殘基。例如，IgG4_樣CH3區可以是突變的IgGlCH3區，其中可參與半分子間CH3-CH3相互作用的一個或多個氨基酸殘基已被改變或刪除。術語“還原性條件”或“還原性環境”是指如下的條件或環境，其中底物，在這里是抗體核心區中的半胱氨酸殘基，更可能被還原而不是被氧化。術語“還原劑”是指這樣的化合物，它還原它的環境中的分子，即改變其環境中的分子，使之更加被還原(morereduced)或者更具有還原性(morereducing)。還原劑通過提供電子發揮作用，這樣其自身在還原了底物之后被氧化。因此，還原劑是提供電子的作用劑。還原劑的實例包括二硫蘇糖醇(DTT)、巰基乙醇、半胱氨酸、巰基乙醇酸鹽(或酯)、半胱胺(cysteamine)、谷胱甘肽和硼氫化鈉。在一個實施方案中，還原劑不包括酶。“二硫鍵形成”是指在一個或兩個多肽內存在的兩個半胱氨酸之間形成共價鍵的過程，其可圖示為〃-S--S-"。“二硫鍵還原”是指斷裂二硫鍵，從而形成兩個巰基(-SH基團)的過程。術語“二硫鍵異構化”是指不同半胱氨酸之間二硫鍵的交換，即二硫鍵改組(shuffling)o“蛋白質二硫鍵異構酶”是指催化蛋白質中二硫鍵的異構化的酶。在二硫橋還原的語境中使用的“無顯著還原”一般是指，在溶液中發生還原的所述二硫橋少于10%，例如少于5%，例如少于2%，或者少于1%。發明的各方面和實施方案如上文所述，在第一個主要方面中，本發明涉及一種用于產生雙特異性抗體的體外方法，所述方法包括如下步驟a)提供具有第一結合特異性的第一抗體，其中所述第一抗體包含IgG4_樣CH3區，b)提供具有不同于所述第一結合特異性的第二結合特異性的第二抗體，其中所述第二抗體包含IgG4-樣CH3區，c)在允許核心鉸鏈區的半胱氨酸發生二硫鍵異構化的還原條件下共同溫育所述第一和第二抗體，和d)獲得雙特異性抗體。在優選實施方案中，本發明方法中使用的第一和第二抗體是單克隆抗體。單克隆抗體可以，例如，通過首先由Kohleretal.(14)描述的雜交瘤方法產生，或者可以通過重組DNA方法產生。單克隆抗體還可以用例如Clackson等(15)和Marks等(16)介紹的技術從噬菌體抗體文庫中分離。單克隆抗體可以從任何合適的來源獲得。因此，例如，可以用感興趣的抗原，例如以在表面上表達該抗原的細胞或者編碼感興趣的抗原的核酸的形式，免疫小鼠，從該小鼠獲得脾B細胞，從該小鼠脾B細胞制備雜交瘤，從該雜交瘤獲得單克隆抗體。還可以從來自經過免疫的人或非人哺乳動物(例如大鼠、狗、靈長動物等)的抗體表達性細胞衍生的雜交瘤獲得單克隆抗體。在一個實施方案中，本發明的抗體是人抗體。指定的人單克隆抗體可用攜帶部分人免疫系統而非小鼠系統的轉基因或轉染色體小鼠產生。這些轉基因和轉染色體小鼠包括在本文中分別被稱作HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，并在本文中統稱為“轉基因小鼠”。HuMAb小鼠含有人免疫球蛋白基因迷你座位(miniloci)，其編碼未重排的人重鏈(P和Y)和k輕鏈免疫球蛋白序列，以及使內源P和k鏈座位失活的靶定突變(targetedmutations)(17)0因此，所述小鼠表現出小鼠IgM或k表達降低，在應答于免疫時，被引入的人重鏈和輕鏈轉基因經歷類別轉換和體細胞突變而產生高親和性的人IgG，k單克隆抗體(17-20)。HuMAb小鼠的制備在參考文獻21-25中有詳細介紹。另見US5,545,806,US5,569,825,US5,625,126,US5,633,425,US5,789,650,US5,877,397,US5，661，016、US5，814，318、US5，874，299、US5，770，429、US5，545，807、WO98/24884、WO94/25585、WO93/1227、WO92/22645、W092/03918和W001/09187。HCo7小鼠在它們的內源輕鏈(kappa)基因中有一個JKD中斷(disruption)(如Chen等(26)所述)，在它們的內源重鏈基因中有一個CMD中斷(如W001/14424的實施例1所述)，一個KCo5人kappa輕鏈轉基因(如Fishwild等(25)所述)，和一個HCo7人重鏈轉基因(如US5，770，429所述)。HCol2小鼠在其內源輕鏈(kappa)基因中有一個JKD中斷(如Chen等(26)所述)，在其內源重鏈基因中有一個CMD中斷(如W001/14424的實施例1所述)，一個KCo5人kappa輕鏈轉基因(如Fishwild等(25)所述)，和一個HCol2人重鏈轉基因(如W01/14424的實施例2所述)。在KM小鼠品系中，內源小鼠kappa輕鏈基因如Chen等(26)所述的那樣被純合地中斷，并且內源小鼠重鏈基因如W001/09187的實施例1所述那樣被純合地中斷。這種小鼠品系攜帶一個人kappa輕鏈轉基因，KCo5，如Fishwild等(25)所述。該小鼠種系還攜帶一個人重鏈轉染色體，其包括染色體14的片段hCF(SC20)，如W002/43478所述。來自這些轉基因小鼠的脾細胞可用于根據眾所周知的技術產生分泌人單克隆抗體的雜交瘤。這些轉基因非人類動物、包含編碼表達本發明所用抗體的可操作核酸序列的非人類動物、用一個或多個編碼靶標的核酸序列穩定轉染的非人類動物等，是本發明的額外特征。本發明使用的人單克隆或多克隆抗體或者本發明使用的來源于其它物種的抗體，還可以用轉基因方式來產生，其是通過產生另一種用目的免疫球蛋白重鏈和輕鏈序列轉基因的非人類哺乳動物或植物，并由所述動物或植物生產可回收的形式的抗體。就哺乳動物中的轉基因生產而言，抗體可以在山羊、牛或其他哺乳動物的奶中產生并回收。見例如us5，827，690、US5，756，687、US5，750，172和US5，741，957。進一步，本發明使用的人類或其它抗體可以通過展示型(display-type)技術產生，這類技術包括但不限于噬菌體展示、逆轉錄病毒展示、核糖體展示和其它技術，使用本領域眾所周知的技術，并且可以對所得的分子進行額外的突變，例如親和性突變，因為這些技術是本領域熟知的(見例如參考文獻27，28和30(噬菌體展示)，29(核糖體展示)，31-35和US5，733，743)。如果使用展示技術產生非人類抗體，則這些抗體可以被人源化。如上文解釋的，在一些實施方案中，本發明方法中使用的第一和/或第二抗體是IgG4抗體。然而，本發明使用的抗體理論上可以是任何同種型，只要CH3區中的序列允許半分子交換即可。例如，本發明方法中使用或獲得的抗體可以包括在SEQIDN0:19-22中顯示的任何恒定區序列(在任何指明的突變位置之外)。因此，在本發明的一個實施方案中，第一和/或第二抗體在核心鉸鏈區中包含CPPC序列。在另一個實施方案中，第一和/或第二抗體包含IgG4-樣核心鉸鏈區。例如，在一些實施方案中，所述第一和/或第二抗體是在核心鉸鏈區中包含CX^C序列的抗體，其中\和X2可以是任何氨基酸，但\和X2不能都是脯氨酸。在另一個實施方案中，所述第一和/或第二抗體是在核心鉸鏈區中包含CX3PC或CPX3C序列的抗體，其中x3可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸。在進一步的實施方案中，所述第一和/或第二抗體是在核心鉸鏈區中包含CSPC、CPSC、CRPC、CPRC、CGHC或CPHC序列的抗體。上述突變可以通過例如本領域眾所周知的定點突變來引入。同種型的選擇通常由期望的效應功能(例如⑶C誘導作用或ADCC中的活性)來指導。同種型的實例包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4(見例如SEQIDNO19-22)。可以使用人輕鏈恒定區kappa或lambda中的任何一種。如果希望的話，本發明使用的抗體類型可以通過已知的方法加以轉換。例如，本發明使用的原本為IgM、IgGl或IgG2的抗體可以被類型轉換為本發明的IgG4抗體。因此，本發明抗體的效應物功能可以通過同種型轉換而變為例如IgGl,IgG2，IgG3，IgG4，IgD，IgA，IgE或IgM抗體，用于各種治療用途。在一個實施方案中，本發明使用的第一和/或第二抗體是全長抗體。在另一個實施方案中，本發明使用的第一和/或第二抗體是抗體片段。在本發明的方法的一個實施方案中，第一和/或第二抗體包含IgG4CH3區，例如具有圖18所示序列(SEQIDNO22)的IgG4CH3區。然而，在本發明的方法的另一個實施方案中，第一和/或第二抗體包含非IgG4同種型的CH3區，其中該CH3區不包含，或者經過了修飾而不包含任何這樣的氨基酸殘基所述氨基酸殘基可以參與和包含相同的CH3區氨基酸序列的其它肽形成二硫鍵或者共價的或穩定非共價的重鏈間鍵。例如，在此處的一個進一步的實施方案中，第一和/或第二抗體包含具有圖18所示序列(SEQIDNO19)的CH3區，其中該CH3區已被修飾從而發生了一種或多種如下的氨基酸替換238位的Arg(R)已被Gln(Q)取代；239位的Asp(D)已被Glu(E)取代；292位的Lys(K)已被Arg(R)取代；302位的Gin(Q)已被Glu(E)取代；和328位的Pro(P)已被Leu(L)取代。在一個優選實施方案中，第一和/或第二抗體包含具有如圖18所示序列(SEQIDNO19)的CH3區，其中292位的Lys(K)已被Arg(R)取代。在另一個實施方案中，第一和/或第二抗體包含具有如圖18所示序列(SEQIDNO19)的CH3區，但是其中292位的Lys(K)已被Tyr(ff)或Phe(F)取代。在另一個進一步的實施方案中，第一和/或第二抗體包含具有如圖18所示序列(SEQIDNO20)的CH3區，其中CH3區已被修飾從而發生了下列氨基酸替換中的一種或多種或者全部5種234位的Arg(R)已被Gln(Q)取代；276位的Met(M)已被Val(V)取代；288位的Lys(K)已被Arg(R)取代；298位的Gin(Q)已被Glu(E)取代；和324位的Pro(P)已被Leu(L)取代。在一個優選的實施方案中，第一和/或第二抗體包含具有如圖18所示序列(SEQIDNO20)的CH3區，其中234位的Arg(R)已被Gln(Q)取代。在一個進一步優選的實施方案中，第一和/或第二抗體包含具有如圖18所示序列(SEQIDNO:20)的CH3區，其中234位的Arg(R)已被Gin(Q)取代；且324位的Pro(P)已被Leu(L)取代。在另一個進一步的實施方案中，第一和/或第二抗體包含具有如圖18所示序列(SEQIDNO:21)的CH3區，其中CH3區已被修飾從而發生了下列氨基酸替換中的一種或多種或全部10種:285位的Arg(R)已被Gin(Q)取代；314位的Ser(S)已被Asn(N)取代；322位的Asn(N)已被Lys⑷取代；327位的Met(M)已被Val(V)取代；339位的Lys(K)已被Arg(R)取代；349位的Gin(Q)已被Glu(E)取代；352位的Ile(I)已被Val(V)取代；365位的Arg(R)已被His(H)取代；366位的Phe(F)已被Tyr(Y)取代；和375位的Pro(P)已被Leu(L)取代。在一個優選實施方案中，第一和/或第二抗體包含具有如圖18所示序列(SEQIDNO:21)的CH3區，其中285位的Arg(R)已被Gin(Q)取代。在一個優選的實施方案中，第一和/或第二抗體包含具有如圖18所示序列(SEQIDNO21)的CH3區，其中285位的Arg(R)已被Gin(Q)取代；且375位的Pro(P)已被Leu(L)取代。在本發明方法的一個進一步的實施方案中，所述第一抗體在核心鉸鏈區中包含CPPC并包含IgG4-樣CH3區，且其中所述第二抗體在核心鉸鏈區中包含CPPC并包含IgG4-樣CH3區。如上文解釋的，在一個主要方面中，本發明涉及一種用于產生雙特異性抗體的體外方法，所述方法包括如下步驟a)提供具有第一結合特異性的第一抗體，其中所述第一抗體包含IgG4_樣CH3區，b)提供具有不同于所述第一結合特異性的第二結合特異性的第二抗體，其中所述第二抗體包含IgG4-樣CH3區，c)在允許核心鉸鏈區中的半胱氨酸發生二硫鍵異構化的還原條件下共同溫育所述第一和第二抗體，和d)獲得雙特異性抗體。在本發明方法的一個實施方案中，選擇步驟c)中的條件，使得核心鉸鏈區之外不發生顯著的二硫橋還原或異構化。在另一個實施方案中，步驟c)中的還原條件是這樣的條件所述條件刺激核心鉸鏈區的進行二硫鍵交換的內在活性。在本發明進一步的實施方案中，步驟c)包括還原劑的添加。在進一步的實施方案中，步驟c)包括添加一種從下組選出的作用劑谷胱甘肽、L-半胱氨酸、二硫蘇糖醇、0-巰基乙醇和半胱胺(cysteamine)。在本發明的方法的一個實施方案中，所述作用劑的濃度使得步驟c)中產生的溶液的氧化還原勢等于(equalto)或者還原性更高于(morereducingthan)在實施例31所述的條件下由1PM谷胱甘肽產生的氧化還原勢，例如等于或者還原性更高于在實施例31所述的條件下由10yM谷胱甘肽產生的氧化還原勢，例如等于或者還原性更高于由50yM谷胱甘肽產生的氧化還原勢，例如等于或者還原性更高于由0.ImM谷胱甘肽產生的氧化還原勢。在進一步的實施方案中，所述作用劑的濃度使得步驟c)中產生的溶液的氧化還原勢-等于或者還原性更高于在實施例31所述的條件下由1PM谷胱甘肽產生的氧化還原勢，例如等于或者還原性更高于在實施例31所述的條件下由10PM谷胱甘肽產生的氧化還原勢，例如等于或者還原性更高于由50yM谷胱甘肽產生的氧化還原勢，例如等于或者還原性更高于由O.lmM谷胱甘肽產生的氧化還原勢。且-等于或者還原性低于(lessreducingthan)在實施例31所述的條件下由1M谷胱甘肽產生的氧化還原勢，例如等于或者還原性低于由lOOmM谷胱甘肽產生的氧化還原勢，等于或者還原性低于由15mM谷胱甘肽產生的氧化還原勢。在一個實施方案中，其中第一抗體在核心鉸鏈區中具有CPPC序列且/或第二抗體在核心鉸鏈區中具有CPPC序列，優選的是，在步驟c)中產生的溶液的氧化還原勢等于或者還原性更高于在實施例35所述的條件下由ImM谷胱甘肽產生的氧化還原勢，例如等于或者還原性更高于由2mM谷胱甘肽產生的氧化還原勢，例如等于或者還原性更高于由4mM谷胱甘肽產生的氧化還原勢，例如等于或者還原性更高于由6mM谷胱甘肽產生的氧化還原勢，例如等于或者還原性更高于由8mM谷胱甘肽產生的氧化還原勢，例如等于或者還原性更高于由10mM谷胱甘肽產生的氧化還原勢。在進一步的實施方案中，所述還原劑的濃度使得步驟c)中產生的溶液的氧化還原勢-等于或者還原性更高于在實施例35所述的條件下由ImM谷胱甘肽產生的氧化還原勢，例如等于或者還原性更高于由2mM谷胱甘肽產生的氧化還原勢，例如等于或者還原性更高于由4mM谷胱甘肽產生的氧化還原勢，例如等于或者還原性更高于由6mM谷胱甘肽產生的氧化還原勢，例如等于或者還原性更高于由8mM谷胱甘肽產生的氧化還原勢，例如等于或者還原性更高于由10mM谷胱甘肽產生的氧化還原勢，且_等于或者還原性更低于于由1M谷胱甘肽產生的氧化還原勢，例如等于或者還原性低于由lOOmM谷胱甘肽產生的氧化還原勢，等于或者還原性低于由15mM谷胱甘肽產生的氧化還原勢。在本發明方法的一個實施方案中，步驟c)包括將所述抗體在還原型谷胱甘肽的存在下在20°C或更高的溫度下，例如在37°C下，溫育至少一個小時，例如至少2個小時，例如至少5個小時，例如至少10個小時。在本發明方法的進一步的實施方案中，選擇步驟c)中的條件，使得用本文所述的大小排阻色譜進行確定時(其中先于起始材料的抗體洗脫的峰表示聚集物的形成)，在所得的組合物中有少于10%，例如少于5%，例如少于2%，例如少于1%的抗體分子處于聚集狀態。在本發明的體外方法的一個實施方案中，該方法包括添加具有蛋白質二硫鍵異構酶活性的蛋白質，例如PDI。在本發明的體外方法的另一個實施方案中，該方法不包括添加具有蛋白質二硫鍵異構酶活性的蛋白質，例如PDI。在本發明的體外方法的一個實施方案中，該方法不包括添加活細胞或細胞提取物。如上文解釋的，本發明方法中使用的第一和第二抗體在結合特異性方面有不同，即結合不同的表位。原則上，任何特異性的組合(anycombinationsofspecificities)均可用作本發明方法的起始材料。另外，本發明的方法并不限于僅以兩種不同的抗體作為起始材料。因此，本發明的方法還可以用三種或更多種抗體作為起始材料來實施。在這樣的22實施方案中，本發明方法的步驟d)中獲得的組合物可以含有多種雙特異性抗體。在本發明方法的一個實施方案中，第一抗體具有針對腫瘤細胞或腫瘤細胞蛋白，例如erbBl、erbB2、erbB3、erbB4、MUC-1、CD19、CD20、CD4、CD38或CXCR5，或者針對B細胞受體信號成分CD79a或CD79b，的結合特異性。在另一個實施方案中，第一抗體具有針對腫瘤細胞或腫瘤細胞蛋白，例如erbBl、erbB2、erbB3、erbB4、MUC-1、CD19、CD20、CD4、CD38或CXCR5，的結合特異性；而第二抗體具有針對腫瘤細胞蛋白，例如erbBl、erbB2、erbB3、erbB4、MUC-l、CD19、CD20、CD4或CXCR5，的結合特異性。在一個進一步的實施方案中，第一抗體具有針對erbBl的結合特異性，而第二抗體具有針對erbB2的結合特異性。在另一個實施方案中，第一抗體具有針對CD19的結合特異性，而第二抗體具有針對⑶20的結合特異性。在一個進一步的實施方案中，第一抗體具有針對CD38的結合特異性，而第二抗體具有針對CD34的結合特異性。在一個更進一步的實施方案中，第一抗體具有針對CD4的結合特異性，而第二抗體具有針對CXCR5的結合特異性。在本發明方法的另一個實施方案中，第一抗體具有針對病原微生物的結合特異性。在一個進一步的實施方案中，第一抗體具有針對病原微生物的結合特異性，而第二抗體具有針對效應細胞蛋白，例如⑶3、⑶25、⑶28、⑶16、⑶89、⑶32或⑶1，的結合特異性。雙特異性抗體還可以用于將化療劑更特異性地靶定到該藥劑要作用的細胞。因此，在本發明方法的進一步實施方案中，第一抗體具有針對腫瘤細胞或腫瘤細胞蛋白，例如erbBl、erbB2、erbB3、erbB4、MUC-1,CD19、CD20、CD4或CXCR5，的結合特異性，而第二抗體具有針對化療劑的結合特異性。此外，通過使雙特異性抗體包含針對血清蛋白質的結合特異性，可以改變抗體的血清半衰期。例如，可以通過使雙特異性抗體包含針對血清白蛋白的結合特異性而延長血清半衰期。因此，在本發明方法的一個進一步的實施方案中，第一抗體具有針對腫瘤細胞或腫瘤細胞蛋白，例如erbBl、erbB2、erbB3、erbB4、MUC-1、CD19、CD20、CD4或CXCR5，的結合特異性，而第二抗體具有針對血液蛋白，例如血清白蛋白，的結合特異性。第二結合特異性還可用于將抗體靶定到特定的組織，例如腦或肝臟。因此，在本發明方法的一個進一步的實施方案中，第一抗體具有針對腫瘤細胞或腫瘤細胞蛋白，例如erbBl、erbB2、erbB3、erbB4、MUC-1,CD19、CD20、CD4或CXCR5，的結合特異性，而第二抗體具有針對腦蛋白如鐵傳遞蛋白，或肝蛋白的結合特異性。而且，第二結合特異性可用于將凝血因子靶定到特定的期望作用位點。例如，具有針對腫瘤細胞的第一結合特異性和針對凝血因子的第二結合特異性的雙特異性抗體能夠將凝血作用導向腫瘤，從而制止腫瘤生長。因此，在本發明方法的一個進一步實施方案中，第一抗體具有針對腫瘤細胞或腫瘤細胞蛋白，例如erbBl、erbB2、erbB3、erbB4、MUC-1、⑶19、⑶20、⑶4或CXCR5，的結合特異性，第二抗體具有針對參與凝血作用的蛋白，例如組織因子，的結合特異性。在本發明進一步的實施方案中，第一和/或第二抗體與從下組選出的化合物相連細胞毒劑；放射性同位素；前藥或藥物，例如紫杉烷；細胞因子；趨化因子和補體，例如Clq。這些化合物可以使針對靶細胞的殺傷更有效，例如在癌癥治療中。或者，可以將化合物與所得的雙特異性抗體偶聯，即在發生了半分子交換之后偶聯。在本發明方法的進一步的實施方案中，該方法還包括使步驟c)中獲得的化合物處于非還原或還原性較低的條件下，以便終止進一步的半分子交換。這可以通過本領域已知的各種方法實現，例如對所得組合物進行透析或者基于大小的色譜，以除去小分子還原劑。在本發明方法的更進一步的實施方案中，通過進行兩個半分子的化學交聯使所得的雙特異性抗體穩定化，從而阻止任何進一步的交換的發生，即便該雙特異性抗體隨后被用于本會使抗體發生半分子交換的條件，例如體內條件。因此，在一個實施方案中，本發明的方法包括進一步的步驟a)使鉸鏈區中的半胱氨酸化學交聯，例如通過使用含有馬來酰亞胺的化合物，例如雙馬來酰亞胺己烷(bis-maleimidohexane)，b)使半分子上的碳水化合物側鏈化學交聯，例如通過高碘酸鹽(periodate)氧化，隨后使醛基與合適的交聯劑如己二酸二酰胼(adipinedihydrazide)反應，或c)使CH3區中不對稱引入的半胱氨酸交聯，例如以Merchant等(36)—文(本文通過提述納入該文)中描述的方式，例如使用一種或多種如下的組合(援引SEQIDNO19)-第--抗體中的D282C與第二二抗體中的K275C，-第--抗體中的D282S與第二二抗體中的K275S，-第--抗體中的Y232C與第二二抗體中的S237C，-第--抗體中的Y232C與第二二抗體中的D239C，-第--抗體中的Y232C與第二二抗體中的E240C，-第--抗體中的L234C與第二二抗體中的S237C，-第--抗體中的T277C與第二二抗體中的V280C，-第--抗體中的V280C與第二二抗體中的K275C，在進--步的方面中，本發明涉及使通過交聯方法，例如上述何一種，獲得的或者可以獲得的穩定化的雙特異性抗體。不論所得的雙特異性抗體是否已通過交聯被穩定化，本發明的方法，在一些實施方案中，可以進一步包含純化雙特異性抗體的步驟。含有雙特異性抗體的混合物可以用標準色譜技術加以純化，例如(但不限于)標準蛋白A色譜，蛋白G，蛋白L，陽離子/陰離子交換色譜，大小排阻色譜，疏水相互作用色譜，嗜硫(thiophilic)色譜，或使用旨在用于捕獲IgG分子的配體(蛋白A模擬物，LlamaVhh配體等)。或者，可以用標準技術沉淀IgG混合物，例如鹽促沉淀(硫酸銨)，添加有機溶劑(DMS0，乙醇)，改變pH或非離子聚合物(聚乙二醇)。在另一種情境下，可以使用能濃集IgG分子的膜用過濾技術處理混合物。為了將雙特異性抗體純化到完全同質，可能需要將所有這些技術組合使用，因為某些混合物可能仍然含有非常接近于(nextto)雙特異性抗體的親本IgG分子。然后可能需要額外的純化步驟以將雙特異性抗體與親本單特異性IgG分子分離開來。這可以通過，例如，先使用針對第一結合親和特異性的親和柱進行結合和洗脫，然后使用針對第二結合特異性的親和柱進行結合和洗脫的純化方法來實現。在一個優選的實施方案中，特別是在沒有實施化學交聯的情況下，純化在可防止進一步半分子交換的條件，例如非還原條件下進行。(純化的)雙特異性抗體的數量、質量和純度可以用常規的生物化學技術加以分析，這些技術例如吸附測量、HP-SEC、SDS-PAGE、非變性PAGE和RP-HPLC。能夠區分雙特異性抗體與親本IgG分子的技術是特別感興趣的。這些技術的實例包括(但不限于)IEF、cIEF、CIEX和質譜(ESI、MALDI)，它們可以基于電荷和/或質量高精度地分離和檢測分子。雙特異性抗體的雙重結合特異性可以用多種不同的結合測定模式進行估計，例如使用ELISA、RIA、表面等離子體共振(SPR)、生物膜層干擾測定(Boi-layerInterferometry)技術、DELFIA、FRET、ECL、Gyros禾口AlfaScreen。在一個實施方案中，半分子交換可以在有利于形成針對兩種目的抗原之一的雙特異性抗體的條件下實施。例如，考慮針對抗原X和Y的抗體。如果用過量的針對抗原X的抗體實施交換，例如5倍過量或10倍過量，那么大多數或者全部針對抗體Y的抗體將變成雙特異性(即識別抗原X和Y)。在這個步驟之后，可以在基質固定的抗原Y和親和柱色譜上對雙特異性抗體進行純化。被結合的抗體中高度富集了期望的雙特異性抗體。未結合的針對抗原X的抗體可用于重復上述循環。在需要穩定化以防止體內交換的情況下，可以如上所述地對雙特異性抗體進行交聯。在化學交聯之后，可以通過用過量的針對抗原Z的抗體進行額外的交換反應，隨后用固定在基質上的抗原Z吸附含有抗Z的抗體(例如通過親和柱色譜)，將未穩定化的抗體從穩定化的抗體中純化出來。這樣，未結合的組分將含有期望的穩定化雙特異性抗體。在本發明方法的一個更進一步的實施方案中，該方法還包括將所得的雙特異性抗體配制供治療應用的步驟。這包括將治療有效量的雙特異性抗體配制在適于人體使用，特別是適合于腸胃外給藥，例如靜脈內注射的水溶液中。在進一步的方面中，本發明涉及一種產生雙特異性抗體的體外方法，所述方法包括如下步驟a)提供具有第一結合特異性的第一抗體，其中所述第一抗體包含核心鉸鏈區中的CPPC序列，以及IgG4-樣CH3區，b)提供具有不同于所述第一結合特異性的第二結合特異性的第二抗體，其中所述第二抗體包含核心鉸鏈區中的CPPC序列，以及IgG4-樣CH3區，和c)在允許核心鉸鏈區中的半胱氨酸發生二硫鍵異構化的還原條件下共同溫育所述第一和第二抗體，和d)獲得雙特異性抗體。優選地，在步驟c)中已經添加了還原劑，其中該作用劑的濃度使得步驟c)中產生的溶液的氧化還原勢等于或者還原性更高于在實施例35所述的條件下由ImM谷胱甘肽產生的氧化還原勢，例如等于或者還原性更高于由2mM谷胱甘肽產生的氧化還原勢，例如等于或者還原性更高于由4mM谷胱甘肽產生的氧化還原勢，例如等于或者還原性更高于由6mM谷胱甘肽產生的氧化還原勢，例如等于或者還原性更高于由8mM谷胱甘肽產生的氧化還原勢，例如等于或者還原性更高于由10mM谷胱甘肽產生的氧化還原勢。在一個進一步的方面中，本發明涉及一種組合物，其包含通過本文所述任何一種本發明方法獲得或可以獲得的雙特異性抗體。25在另一個的主要方面中，本發明涉及一種分離的雙特異性抗體，其包含兩個IgG4-樣CH3區。在一個實施方案中，所述抗體在核心鉸鏈區中包含一個或兩個CPPC序列。在另一個實施方案中，所述抗體在核心鉸鏈區中包含一個或兩個CX1X2C序列，其中X1和X2可以是任何氨基酸，但X1和X2不能都是脯氨酸。在一個進一步的實施方案中，所述抗體在核心鉸鏈區包含一個或兩個CX3PC或CPX3C序列，其中X3可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸。在一個更進一步的實施方案中，所述抗體在核心鉸鏈區包含一個或兩個CSPC、CPSC、CRPC或(PRC序列。在所述分離的雙特異性抗體的一些實施方案中，第一和/或第二CH3區屬于非IgG4同種型，其中該CH3序列不包含，或經過修飾而不包含，任何這樣的氨基酸殘基所述氨基酸殘基可以參與和包含相同CH3區氨基酸序列的其它肽形成二硫鍵或共價或穩定的非共價重鏈間鍵。在其一個進一步的實施方案中，第一和/或第二CH3區具有如圖18中所示的序列(SEQIDNO:19)，其中該CH3區已被修飾從而發生了一種或多種如下的氨基酸替換238位的Arg(R)已被Gln(Q)取代；239位的Asp(D)已被Glu(E)取代；292位的Lys(K)已被Arg(R)取代；302位的Gln(Q)已被Glu(E)取代；和328位的Pro(P)已被Leu(L)取代。在另一個進一步的實施方案中，所述第一和/或第二CH3區具有如圖18中所示的序列(SEQIDNO:20)，其中該CH3區已被修飾從而發生了一種或多種如下的氨基酸替換234位的Arg(R)已被Gln(Q)取代；276位的Met(M)已被Val(V)取代；288位的Iys(K)已被Arg(R)取代；298位的Gln(Q)已被Glu(E)取代；和324位的Pro(P)已被Leu(L)取代。在一個更進一步的實施方案中，所述第一和/或第二CH3區具有如圖18中所示的序列(SEQIDNO:21)，其中該CH3區已被修飾從而發生了一種或多種如下的氨基酸替換285位的Arg(R)已被Gln(Q)取代；314位的Ser(S)已被Asn(N)取代；322位的Asn(N)已被Lys(K)取代；327位的Met(M)已被Val(V)取代；339位的Lys(K)已被Arg(R)取代；349位的Gln(Q)已被Glu(E)取代；352位的lie(I)已被Val(V)取代；365位的Arg(R)已被His(H)取代；366位的Phe(F)已被Tyr(Y)取代；375位的Pro(P)已被Leu(L)取代。在一個更進一步的實施方案中，本發明抗體的第一和/或第二CH3區是IgG4CH3區。在一個更進一步的方面中，本發明涉及一種組合物，例如包含本發明的雙特異性抗體或者通過如上所述的任何一種本發明的方法獲得或者可以獲得的雙特異性抗體的藥物組合物，其用于作為藥物，例如用作治療癌癥或感染性疾病的藥物。在一個更進一步的方面中，本發明涉及包含本發明的雙特異性抗體或者通過如上所述的任何一種本發明的方法獲得或者可以獲得的雙特異性抗體的組合物用于制備治療癌癥或感染性疾病的藥劑的用途。本發明的方法還可用于選擇特別令人感興趣的或有效的靶結合特異性組合(combinationoftargetbindingspecificities)。例如使用本發明的方法,可以由一系列具有不同結合特異性的抗體制備一系列或“陣列”(matrix)不同的雙特異性抗體。然后可以測試所得的雙特異性抗體系列或陣列的期望的生物學性質，從而選擇出最佳的組合。因此，在一個更進一步的方面中，本發明涉及一種用于選擇具有期望性質的雙特異性抗體的方法，所述方法包括如下步驟a)提供一系列抗體，其中每種抗體均具有不同的靶點特異性(eachantibodyhasadifferenttargetspecificity)，并且其中每種抗體均包含IgG4_樣CH3區，b)將所述系列中的每種抗體與所述系列中的另一種抗體在還原條件下一起進行溫育，從而產生一系列的抗體混合物，其中每種混合物均包含不同的雙特異性抗體(eachmixturecontainsadifferentbispecificantibody),c)測定所得系列抗體混合物的給定的期望性質，和d)選擇具有所述期望性質的雙特異性抗體混合物。上述方法中的步驟b)可以按照上文關于步驟C)的描述加以實施。在一個實施方案中，所測試的期望性質是腫瘤細胞殺傷。參考文獻1.Aalberse,R.C.,R.vanderGaag,andJ.vanLeeuwen.1983.SerologicaspectsofIgG4antibodies.I.ProlongedimmunizationresultsinanIgG4_restrictedresponse.JImmunol130:722.2.vanderZee，J.S.，P.vanSwieten，andR.C.Aalberse.1986.SerologicaspectsofIgG4antibodies.11.IgG4antibodiesformsmall，nonprecipitatingimmunecomplexesduetofunctionalmonovalency.JImmunol1373566.3.Schuurman,J.，R.VanRee，G.J.Perdok，H.R.VanDoom,K.Y.Tan，andR.C.Aalberse.1999.NormalhumanimmunoglobulinG4isbispecific:ithastwodifferentantigen-combiningsites.Immunology97:693.4.Aalberse，R.C.，andJ.Schuurman.2002.IgG4breakingtherules.Immunology105:9.5.Aalberse,R.C.,J.Schuurman,andR·vanRee.1999.TheapparentmonovalencyofhumanIgG4isduetobispecificity.IntArchAllergyImmunol118:187.6.Schuurman，J.，G.J.Perdok,A.D.Gorter,andR.C.Aalberse.2001.Theinter-heavychaindisulfidebondsofIgG4areinequilibriumwithintra-chaindisulfidebonds.MolImmunol38:1·7.Bloom，J.W.，Μ.S.Madanat,D.Marriott，Τ.Wong,andS.Y.Chan.1997.IntrachaindisulfidebondinthecorehingeregionofhumanIgG4.ProteinSci6407.8.Gregory,L.，K.G.Davis,B.Sheth，J.Boyd,R.Jefferis，C.Nave,andD.R.Burton.1987.ThesolutionconformationsofthesubclassesofhumanIgGdeducedfromsedimentationandsmallangleX-rayscatteringstudies.MolImmunol24:821.9.Deng,L.，D.Wylie,Y.S.Tsao,B.Larkin,M.Voloch，andW.L.Ling.2004.DetectionandquantificationofthehumanIgG4half—molecule，HL，fromunpurifiedcell-culturesupernatants.BiotechnolApplBiochem40:261·10.MarcinandZhu(2005)ActaPharmacolSin.2664911.FundamentalImmunologyCh.7(Paul,W.,ed.,2nded.RavenPress,N.Y.(1989))12.ChothiaandLeskT.Mol.Biol.196,901-917(1987)13.Kabatetal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD.(1991)14.Kohleretal.,Nature256,495(1975)15.Clacksonetal.,Nature352,624-628(1991)16.Marksetal.，J.Mol.Biol.222,581-597(1991)17.Lonberg,N.etal.，Nature368,856—859(1994)18.Lonberg,N.HandbookofExperimentalPharmacologyl13,49-101(1994)19.Lonberg,N.andHuszar,D.，Intern.Rev.Immunol.Vol.1365-93(1995)20.Harding,F.andLonberg,N.Ann.N.Y.Acad.Sci764536~546(1995)).21.Taylor,L.etal.，NucleicAcidsResearch20,6287-6295(1992)22.Chen,J.etal.，InternationalImmunology旦，647—656(1993)23.Tuaillonetal.，J.Immunol.152,2912—2920(1994)24.Taylor,L.etal.,InternationalImmunology^,579—591(1994)25.Fishwild,D.etal.，NatureBiotechnologyU,845-851(1996)26.Chenetal.，EMBOJ.12,821-830(1993)27.Hoogenboometal.，J.Mol.Biol.227,381(1991)28.Vaughanetal.,NatureBiotechl4,309(1996)29.HanesandPlucthau,PNASUSAM，4937-4942(1997)30.ParmleyandSmith,Gene73,305-318(1988)31.ScottTIBS17,241-245(1992)32.Cwirlaetal.，PNASUSA87,6378-6382(1990)33.Russeletal.,Nucl.AcidsResearch21,1081-1085(1993),34.Hoogenboometal.，Immunol.Reviews週，43-68(1992)35.ChiswellandMcCaffertyTIBTECH10,80-84(1992)36.Merchantetal.(1998)NatureBiotech16:677-68137.Sambrook,Russelletal.2000Molecularcloning.Alaboratorymanual(thirdedition)，ColdSpringHarborLaboratoryPress38.Akkerdaas,vanReeetal.1995Allergy50(3)，215—22039.deGrootetal.1988J.AllergyClin.Immunol.82,778進一步通過如下的實施例進行舉例說明本發明，這些實施例不應理解為對本發明的進一步限制。實施例實施例1寡核苷酸引物和PCR擴增寡核苷酸引物由IsogenBioscience(Maarssen，荷蘭)合成并定量。引物在H2O中溶解為lOOpmol/μ1，并保存于-20°C。下面給出了全部PCR引物和測序引物的匯總。PCR根據制造商的說明使用PfoTurboHotstartDNA聚合酶(Stratagene，Amsterdam,荷蘭)。每個反應混合物含有200μM混合dNTP(RocheDiagnostics，Almere，荷蘭)，正向和反向引物各6.7pmol，IOOng基因組DNA或Ing質粒DNAjP1單位PftiTurboHotstartDNA聚合酶，溶于總體積20μ1的PCR反應緩沖液(與聚合酶一起提供)中。PCR反應使用TGradientThermocycler96(WhatmanBiometra,Goettingen,ΙΗ),it^T32^ififWfM序95°C變性2min、95°C30sec、60-7(TC梯度(或另一特定退火溫度)30sec、和72°C3min共30個循環；最后在72°C延伸lOmin。如果合適，將PCR混合物保存于4°C直至進一步的分析或處理。實施例2瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳根據Sambrook(37)使用50ml凝膠在IxTris乙酸EDTA緩沖液中進行。通過在凝膠中摻入溴化乙錠，并在UV光下進行觀察來使DNA可視化。使用C⑶相機和圖像分析系統(GeneGnome；Syngene,viaffestburgB.V.，Leusden，荷蘭)記錄凝膠圖像。實施例3=PCR產物的分析、純化及酶解使用MinElutePCR提純試劑盒(Qiagen，viaffestburg,Leusden，荷蘭；產品號28006)根據制造商的使用說明提純期望PCR片段。用UV分光光度計定量分離的DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳估計品質。或者，使用Tris乙酸EDTA瓊脂糖凝膠進行瓊脂糖凝膠電泳來分離PCR或消化產物(例如當存在多種片段時)，。將期望的片段從凝膠中切下，用QIAEXII凝膠提取試劑盒(Qiagen；產品編號20051)根據制造商的使用說明進行回收。實施例4通過UV分光光度計對DNA進行定量用NanoDropND-1000分光光度計(IsogenLifeScience，Maarssen，荷蘭)根據制造商的使用說明測定核酸的光密度。通過分析260nm的光密度(OD)(IOD26tlnm單位=50μg/ml)來測量DNA的濃度。對于所有樣品，使用溶解核酸的緩沖液作為參考。實施例5:限制性酶消化限制酶和補充材料系從NewEnglandBiolabs(Beverly,MA,USA)或Fermetas(Vilnius，立陶宛)獲得，并根據制造商的使用說明來使用。在最終體積為10μ1(反應體積視需要比例放大)的合適緩沖液中用5單位的酶消化DNA(IOOng)。將消化體系在推薦的溫度下溫育至少60min。對于需要使用不相容的緩沖液或不同溫度要求的限制酶進行雙重消化的片段，順次進行消化。如果需要，通過瓊脂糖凝膠電泳和凝膠提取對消化產物進行純化。實施例6=DNA片段的連接用QuickLigationKit(NewEnglandBiolabs)根據制造商的使用說明進行DNA片段的連接。對于每個連接體系，將載體DNA與大約3倍摩爾過量的插入DNA進行混合。實施例7大腸桿菌(E.coli)的轉化根據制造商的說明使用熱激法將質粒DNA(1-5μ1DNA溶液，通常為2μ1DNA連接混合物)轉化到OneShotDH5α-TIe或MACH-ITIk感受態大腸桿菌細胞(Invitrogen，Breda，荷蘭；產品編號12297-016)中。接著，將細胞涂布在含有50μg/ml氨芐青霉素的Luria-Bertani(LB)瓊脂平板上。平板在37°C溫育16_18h，直到細菌菌落變得明顯。實施例8通過PCR篩選細菌菌落使用HotStarTaqMasterMix試劑盒(Qiagen；產品編號203445)和合適的正向和反向引物(附錄1)，通過菌落PCR篩選細菌菌落中含有期望序列的載體的存在。用20μ1吸液管尖端輕輕碰觸所選克隆，并2mlLB中短暫碰觸以進行小量培養，然后重新懸浮在PCR混合物中。PCR使用TGradientThermocycler96，使用35個循環的程序95°C變性15min；35個循環的94°C30sec、55°C30sec、和72°C2min；然后在72°C進行IOmin的最終延伸步驟。如果合適，將PCR混合物保存于4°C直至通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析。實施例9從大腸桿菌培養物分離質粒DNA使用下列的Qiagen產試劑盒(購自Westburg，Leusden,荷蘭)根據制造商的說明從大腸桿菌培養物分離質粒DNA。對于大量質粒制備(50-150ml培養物)，使用HiSpeedPlasmidMaxi試劑盒(產品編號12663)或HiSpeedPlasmidMidi試劑盒(產品編號12643)。對于小量質粒制備(士2ml培養物)，使用QiaprepSpinMiniprep試劑盒(產品編號27106)，將DNA洗脫于50μ1洗脫緩沖液(與試劑盒一起提供)中。實施例10=DNA測序質粒DNA用本領域已知的標準程序進行測序。使用VectorNTI軟件(Informax，Oxford,UK)進行序列分析。實施例11在HEK-293F細胞中瞬時表達從Invitrogen獲得Freestyle293-F(—種適于懸浮生長和化學限定Freestyle培養基的HEK-293亞克隆，例如HEK-293F)細胞，并用293fectin(Invitrogen)根據制造商的規程進行轉染。實施例12:PTomG4,一種用于表達可變重鏈區和人IGG4恒定區的載體，的構建從一名志愿者血液樣品中分離基因組DNA，用其作為模板，使用引物IGG4gene2f和IGG4gene2r(見下表)PCR擴增IgG4重鏈的完整基因組恒定區，同時引入合適的用于克隆進入哺乳動物表達載體PEE6.4(L0nzaBi0l0giCS)的限制位點。對PCR片段進行純化并克隆到pEE6.4中。為此，用Hindi11和EcoRI消化PCR產物，隨后將限制酶熱失活。用Hindi11和EcoRI消化pEE6.4載體，隨后將該限制酶熱失活，并用蝦堿性磷酸酶(shrimpalkalinephosphatase)使載體片段去磷酸化，隨后將該磷酸酶熱失活。連接IgG4片段和pEE6.4Hindlll/EcoRI去磷酸化載體，并轉化進入感受態MACHI-TIk細胞(Invitrogen)。使3個克隆在LB中生長，并從小培養物(1.5mL)分離質粒DNA。限制性消化顯示出與將IgG4片段克隆到PEE6.4載體中一致的模式。將來自2個克隆的質粒DNA轉化進入DH5α-TIk大腸桿菌，分離質粒DNA，并通過分析插入物的序列對構建體進行檢查，發現一個克隆與一種來自Genbank數據庫的基因組IgG4克隆相同，只是在內含子中有一些微小差異。這些差異可能是由于多態性或者Genbank序列的序列錯誤導致的。將該質粒命名為pTomG4。表1:引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>實施例13小鼠抗Betvl抗體和抗Feldl抗體可變區的克隆用RNeasy試劑盒(Qiagen，ffestburg,Leusden，荷蘭)根據制造商的方案從0.3xl05(Betvl)或0.9xl05(Feldl)小鼠雜交瘤細胞(對于Betvl來自參考文獻38的克隆2H8，對于Feldl來自參考文獻39的克隆4F7)制備總RNA。使用SMARTRACEcDNAAmplification試劑盒(BDBiosciencesClontech,MountainView，CA，USA)，根據制造商的方案從大約IOOng總RNA制備RNA的5，-RACE-互補DNA(cDNA)。通過PCR擴增Betvl和Feldl抗體的VL和VH區。為此，根據制造商的說明使用PiliTurboHotStartDNA聚合酶(Stratagene)。每個反應混合物含有200μM混合dNTP(RocheDiagnostics)，12pmol反向引物(用于VH區的RACEGlmml，用于VL區的RACEKmml)，7.2pmolUPM-Mix(UPM-Mix:2μMShortUPMH3禾口0·4μMLongUPMH3寡核苷酸)，0.6μ1如上所述的5，RACEcDNA模板，和1.5單位PfbTurboHotstartDNA聚合酶，溶于總體積為30μ1的PCR反應緩沖液(與聚合酶一起提供)中。PCRSiS^ffiTGradientThermocycler96(WhatmanBiometra)it^T^tffl35循環的程序95°C變性2min；35個循環的95°C30sec，55°C30sec，和72°C1.5min；最后在72°C延伸lOmin。反應產物通過瓊脂糖凝膠電泳在TAE瓊脂糖凝膠上進行分離，并用溴化乙錠染色。從凝膠上切下大小正確的條帶，用QiaexII凝膠提取試劑盒(Qiagen)從瓊脂糖中分離DNA。將凝膠分離的PCR片段與200μMdATP和2.5單位Amplitaq(PerkinElmer)在72°C溫育IOmin以添加A尾巴，并用微型洗脫柱(Qiagen)進行純化。使用pGEMTeasy載體系統II試劑盒(Promega)按照制造商的方案將添加了A尾巴的PCR片段克隆到pGEMTeasy載體(Promega)中。將2μ1連接混合物轉化到OneShotDH5αTlR感受態大腸桿菌(Invitrogen)中，并涂布在LB/Amp/IPTG/Xgal平板上。為每個VH和VL序列挑取4個含有插入序列的白色克隆，并對插入序列進行測序。SEQIDNO:15和16給出了BetvlVH和VL的推導氨基酸序列，SEQIDNO17和18給出了Feldl的推導氨基酸序列。VH序列Betvl(SEQIDNO15)mkcswviffImavvtgvnsevqlqqsgaelvkpgasvklsctasgfnikdtyihffvkqrpeqglewvgridpatgntrydpkfqgkatitadtssntayIqlssItsedtavyycasfrpgyaldywgqgtsvtvssVL序列Betvl(SEQIDNO16)mesqiqafvfvflwlsgvdgdivmtqshkfmstsvgdrvsftckasqdvftavawyqqkpgqspklliywastrrtgvpdrftgsgsgtdytltissvqaedlalyycqqhfstpptfgggtkleikVH序列Feldl(SEQIDNO17)mgwsyiiIflvatatdvhsqvqlqqpgaelvkpgasvklsckasgysftsywmhwlkqrpgqglewigeinpnngrtyynekfktkatltvdkssstaymqlnsltsedsavyycarrltmvesfaywgqgtlvtfsaVL序列Feldl(SEQIDNO18)mesqtqvlmsllfwvsgtcgdivmtqspssltvtagekvtmsckssqsllnsgnqknyltwyqqkpgqppklliywastresgvpdrftgsgsgtdfsltissvqaedlaiyycqndysypftfgsgtkleik實施例14=PConGlfBetVl用于產生Betvl-IgGl重鏈的載體的構建使用引物VHexbetvlfor和VHexbetvlrev從含有小鼠抗BetVl抗體的乂11編碼區的質粒(實施例13)中PCR擴增該區，同時引入用于克隆到pConGlfO.4中的合適的限制性位點和理想的Kozak序列。凝膠純化VH片段并克隆到pConGlf0.4中。為此，用Hindi11和ApaI消化PCR產物和pConKappaO.4載體并加以純化。將VH片段和pConGlfO.4HindIII-ApaI消化載體加以連接，并轉化到感受態DH5α-TIe細胞中。選擇含有正確插入序列大小的克隆，并確認正確的序列。將該質粒命名為pConGlfBetvl。實施例15:pConKBetvl用于產生Betvl輕鏈的載體的構建使用引物VLexbetvlfor和VLexbetvlrev從含有小鼠抗BetVl抗體的\編碼區的質粒(實施例13)中擴增該區，同時引入用于克隆到pConKO.4中的合適的限制性位點和理想的Kozak序列。用HindIII和BsiWI對PCR產物和pConKappaO.4載體進行消化，并加以純化。將Vl片段和pConKappaO.4HindIII-BsiffI消化的載體加以連接，并轉化到感受態DH5α-TIk大腸桿菌中。選擇含有正確插入序列大小的克隆，并對序列進行確認。將該質粒命名為pConKBetvl。實施例16:pTomG4Betvl用于產生Betvl_IgG4重鏈的載體的構建為了構建用于表達Betvl_IgG4的載體，將BetVl的VH區克隆到pTomG4中。為此，用HindIII和ApaI消化pTomG4和pConGlfBetvl，并分離相關片段。將BetvlV11片段和PTomG4HindIII-ApaI消化的載體加以連接，并轉化到感受態DH5α-TIe細胞中。選擇含有正確插入序列大小的克隆，并確認序列。將該質粒命名為pT0mG4BetVl。實施例17=PConGlfFeldl用于產生Feldl-IgGl重鏈的載體的構建使用引物VHexfeldlfor和VHexfeldlrev從含有小鼠抗Feldl抗體的Vh編碼區的質粒(實施例13)中PCR擴增該區，同時引入用于克隆到pConGlfO.4中的合適的限制性位點和理想的Kozak序列。將VH片段進行凝膠純化并克隆到pConGlfO.4中。為此，用HindIII和ApaI對PCR產物和pConKappaO.4載體進行消化，并進行純化。將Vh片段和pConGlfO.4HindIII-ApaI消化的載體進行連接，并轉化到感受態DH5α-TIe細胞中。選擇含有正確插入序列大小的克隆，并確認序列。將該質粒命名為pConGlfFeldl。實施例18=PConKFeldl用于產生Feldl輕鏈的載體的構建使用引物VLexfeldlfor和VLexfeldlrev從含有小鼠抗Feldl抗體的\編碼區的質粒(實施例13)中通過PCR擴增該區，同時引入用于克隆到pConKO.4中的合適的限制性位點和理想的Kozak序列。用HindIII和BsiWI對PCR產物和pConKappaO.4載體進行消化，并加以純化。將\片段和pConKappaO.4HindIII-BsiffI消化的載體加以連接，并轉化到感受態DH5α-TIk大腸桿菌中。選擇含有正確插入序列大小的克隆，并確認序列。將該質粒命名為pConKFeldl。實施例19:pTomG4Feldl用于產生Feldl_IgG4重鏈的載體的構建為了構建用于表達Feldl-IgG4的載體，將Feldl的VH區克隆到pTomG4中。為此，用HindIII和ApaI對pTomG4和pConGlfFeldl進行消化，并分離相關片段。連接FeldlV11片段和pT0mG4HindIII-ApaI消化的載體，并轉化到感受態DH5α-TIe細胞中。選擇含有正確插入序列大小的克隆，并確認序列。將該質粒命名為pTomG4Feldl。實施例20用于表達2F8_IgG4和7D8_IgG4的抗體表達載體的構建構建了用于表達HuMab2F8(IgGl-EGFR)和HuMab7D8(IgGl_CD20)的表達載體。將HuMab2F8(W002/100348)和HuMab7D8(W004/035607)的VH和VL編碼區克隆到用于產生IgGl重鏈的表達載體pConGlf(LonzaBiologics)和用于產生kappa輕鏈的pConKappa中，產生載體PConG1f2F8、pConG1f7D8、pConKappa2F8和pConKappa7D8。通過HindIII/ApaI消化從pConGlf2F8和pConGlf7D8中移出這些載體的VH區，并插入到Hindlll/Apal消化的pTomG4載體中，分別產生pTomG42F8和pTomG47D8。實施例21通過在HEK-293F細胞中進行瞬時表達產生Betvl-IgGl、Betvl_IgG4、Feldl-IgGl和Feldl_IgG4根據制造商的使用說明，使用293feCtin在HEK-293F細胞中共轉染相關的重鏈和輕鏈載體，以從所有構建體產生抗體。對于Betvl-IgGl，共表達pConGlBetvl和pConKBetvl。對于Betvl_IgG4，共表達pTomG4Betvl和pConKBetvl。對于Feldl-IgGl，共表達pConGlFeldl和pConKFeldl。對于Feldl_IgG4，共表達pTomG4Feldl和pConKFeldl。對于IgGl-EGFr，共表達pConGlf2F8和pConKappa2F8。對于IgG4_EGFr，共表達pTomG42F8和pConKappa2F8。對于IgGl_CD20，共表達pConGlf7D8和pConKappa7D8。對于IgG4_CD20，共表達pTomG47D8禾口pConkappa7D8。實施例22=IgGl和IgG4抗體的純化通過蛋白A親和色譜純化IgGl和IgG4抗體。用0.20μM盲端濾膜(dead-endfilter)過濾細胞培養上清，隨后上樣到5ml蛋白A柱(rProteinAFF,GEHealthvcare)上，并用0.IM檸檬酸-NaOH，pH3對IgG進行洗脫。洗脫物立即用2MTris-HCl,pH9中和，并對12.6mM磷酸鈉，140mMNaCl，ρΗ7·4(B.Braun，Oss，荷蘭)中過夜透析。透析后，用0.20μM盲端濾膜進行無菌過濾。經純化的IgG的濃度通過濁度測定法和280nm吸光度加以測定。純化的蛋白通過SDS_PAGE、IEF、質譜和糖分析(Glycoanalysis)進行分析。實施例23經純化的IgG的SDS-PAGE分析提純之后，對Betvl和Feldl，IgGl和IgG4抗體進行非還原性SDS-PAGE分析。所用的Bis-Tris電泳方法是Laemmli方法的修改形式(Laemmli1970Nature227(5259)680-5)，其中樣品在中性pH下運行。SDS-PAGE凝膠用考馬斯染色，并用GeneGenius(Synoptics,Cambridge,UK)進行數字成像。如圖1所示，Betvl和FeldlIgGl顯示1條主帶，代表全長四聚體型(2條重鏈和2條輕鏈)Feldl和BetvlIgGl分子。Betvl和FeldlIgG4除了代表四聚體IgG4分子的主帶之外，還顯示有相當量的半分子(即一條重鏈和一條輕鏈)。實施例24小鼠中IgG4半分子交換的估計使用5只6-8周齡nu/nuBalb/c小鼠來追蹤IgG4半分子交換。將小鼠圈養在中央實驗動物設施(CentralLaboratoryAnimalFacility)(Utrecht，荷蘭)的屏障單位(barrierunit)中，置于濾蓋籠(filter-topcages)內，水和食物自由攝取。所有的實驗均得到Utrecht大學動物倫理委員會的批準。腹膜內施用嵌合抗體。在施用后4.25小時、24小時、48小時和72小時采取血液樣品(75-100μ1)。將血液收集在含有肝素的小瓶中，并在10.OOOg離心5分鐘以分離血漿和細胞。將血漿保存在_20°C，用于確定抗原特異性抗體和雙特異性抗體水平。在本實驗中，將嵌合IgG4半分子(η=2)的交換與IgGl半分子(η=3)的交換相比較。將Betvl和Feldl特異性抗體(IgGl或IgG4)的混合物以每只小鼠200μ1計600μg(每種抗原特異性抗體300μg)的劑量施用給小鼠。在抗原結合試驗中測量Betvl或Feldl結合性抗體的血漿濃度。為此，將血漿樣品與0.75mg蛋白GSepharose(AmershamBiosciences,Uppsala,Sweden)溫育在750μ1PBS-IAT(PBS添加lyg/mlIVIg，0·3%牛血清白蛋白，0·1%Tween-20和0·05%(w/v)NaN3)中，在125I標記的Betvl或125I標記的Feldl存在條件下溫育24h。接著，用PBS-T(PBS添加0.1%Tween-20和0.05%(w/v)NaN3)清洗S印harose，測量結合的放射性的量相對于添加的放射性的量的比。用純化的Betvl特異性抗體或Feldl特異性抗體作為標準(每個試驗的范圍0-200ng，由濁度測量法確定)計算Betvl或Feldl特異性IgG的濃度。雙特異性IgG的濃度在異源交聯測定的兩種變型中加以測量。在第一種測定中，在總體積300μ1的PBS-IAT中將血漿與S印harose偶聯的Betvl(0.5mg)溫育24h。隨后，用PBS-T清洗S印harose，并與125I標記的Feldl溫育24h，之后用PBS-T清洗S印harose，測量結合的放射性的量相對于所添加放射性的量。用Feldl結合試驗的校正曲線計算雙特異性IgG(Betvl-Feldl)的濃度，該校正曲線是由純化的Feldl結合性rlgG獲得的。在第二種測定中，使用S印harose偶聯的rFeldl(0.5mg)和125I標記的Betvl通過相似的程序測量Feldl-Betvl交聯活性。用純化的Betvl特異性rlgG作為標準(與Betvl結合試驗中的曲線相同)計算雙特異性IgG(Feldl-Betvl)的濃度。在圖2中，雙特異性IgG(Feldl-Betvl)的濃度相對于不同時間點上的Betvl結合性IgG的濃度作圖。與給予IgG4的小鼠形成對照的是，給予IgGl混合物的小鼠體內沒有觀察到雙特異性IgG。24h后，雙特異性IgG4的產生達到最大，對應于100%交換。在圖3A中，隨時間追蹤雙特異性人IgG4的形成。在注射了IgG4而非IgGl的混合物的小鼠血漿中經過一段時間出現了雙特異性抗體，雙特異性反應力在溫育1-2天后達到最大值即大約50%(注意如果等量的IgG4-Betvl和IgG4-Feldl被交換，在半抗體的隨機和完全交換之后最多會有50%的IgG4-Betvl半抗體被摻入到雙特異性部分中)。等量的IgG4-Betvl和IgG4_Feldl之間的隨機Fab臂交換可相當于大約一半的IgG4分子獲得雙特異性。作為對照，將20倍過量的針對無關抗原的IgG4(從抗EGFr抗體2F8產生的IgG4)與IgG4_Betvl和IgG4_Feldl—起注射到小鼠體內。過量的無關IgG4與Betvl-Feldl雙特異性IgG4的產生相競爭。在另一個實驗中(圖3B)，對相同的小鼠血漿樣品測試其將放射性標記的可溶性Feldl交聯到S印harose固定的Feldl上的能力。結果發現，在給予等量IgG4而非IgGl混合物的小鼠體內單特異性交聯活性被降低，表明單特異性交聯活性的損失。在大約1天后，達到最大減少即50%。在給予額外的過量無關IgG4的小鼠體內，單特異性交聯活性以相似的動力學幾乎完全消失。進行大小排阻色譜以排除在給予IgG4的小鼠體內觀察到的雙特異活性是IgG聚集的結果的可能性(見圖4)。為此，將血漿樣品(在t=24h獲取)在Superdex200柱上分級，之后測量級分中的Feldl結合性IgG和Betvl-Feldl交聯性IgG。Feldl結合性抗體洗脫出一個峰，保留體積為12.9ml，其對應于單體IgG的保留體積。在相同的級分中檢測到了異源Betvl-Feldl交聯活性，表明雙特異活性與單體IgG有關。在含有rlgGl的血漿中，在分級之前不存在Betvl-Feldl交聯活性。同樣，在洗脫的級分中，沒有測量出異源交聯活性(數據未顯示)。實施例25評估全血(成分)中的交換活性將嵌合抗體混合，隨后與全血、血細胞、血漿或血清溫育，以研究全血(成分)的交換活性。在本實驗中，對來自兩個健康血液供體A和B的全血中的IgG4半分子的交換進行評估，所述全血中IgG4的內源血漿水平通過濁度測量加以確定(分別為346和554μg/ml)。將全血采取在添加有終濃度為40μg/ml的TFPI(組織因子通道抑制劑，來自ChironCorporation,Emeryville,California)的采血管中。通過全血離心獲得血細胞和血漿。將細胞級分用Optimem(Invitrogen，Breda，荷蘭)清洗3次，隨后重懸在Optimem中。將全血在含有促凝劑的玻璃采血管中37°C溫育30min，之后將凝血離心下來，獲得血清。評估IgG4半分子的交換，并與IgGl半分子的交換進行比較。作為對照，還將血液樣品在沒有嵌合抗體的條件下進行溫育。在PBS中制備如下的抗體混合物1.Betvl特異性IgG4(10μg)和Feldl特異性IgG4(10μg)2.Betvl特異性IgGl(10μg)和Feldl特異性IgGl(10μg)將這些抗體混合物與血液、血細胞、血漿或血清一起在水平回轉振蕩器(125rpm)上37°C溫育，總體積為100μ1(每種抗體的終濃度為0.1μg/ml)。與全血或血細胞的溫育混合物中的最終血細胞比容為大約40%。24h后，將溫育混合物在Eppendorf離心機中以2800rpm離心lmin，之后吸取10μ1樣品至500μ1PBS-AT(PBS添加0.3%牛血清白蛋白，0.Tween-20和0.05%(w/v)NaN3)中。如果需要，將樣品存儲在4°C。在異源交聯測定中測量雙特異活性(即Feldl-Betvl交聯活性)。在此測定中，將樣品與0.5mgSepharose偶聯的重組Feldl在總體積為300μ1的PBS-IAT(PBS-AT添加1μg/mlIVIg)中溫育24h。隨后，用PBS-T清洗Sepharose,并與125I標記的Betvl溫育24h，之后用PBS-T清洗S印harose，并測量結合的放射性的量相對于所添加放射性的量。在圖5中，雙特異活性用結合的125I標記Betvl的百分比表示，其是在異源交聯測定中加以確定的。雙特異活性是IgG4半分子交換的量度。IgG4半分子交換主要在全血和全血的細胞級分中觀察到(圖5a)。細胞級分中的雙特異性水平甚至高于全血。對于這一點最有可能的解釋是，在細胞級分中，內源IgG4-其也能夠與所添加的嵌合IgG4抗體發生交換-不再存在了。在血漿和血清中也能夠觀察到一些雙特異活性，但是這個活性遠遠低于在血漿中觀察的水平，僅略高背景水平1.7%，后者是通過在Optimem中溫育IgG4混合物獲得的。在任何含IgGl的溫育物中均沒有觀察到雙特異活性(圖5b)。同樣在沒有嵌合抗體的對照溫育物中，也沒有觀察到雙特異活性(圖5c)。進行了大小排阻色譜以排除在IgG4混合物中觀察到的雙特異活性是IgG聚集的結果的可能性。為此，將樣品(在t=24h獲取)在Superdex200柱上分級，然后測量級分中的Feldl結合性IgG和Betvl-Feldl交聯性IgG。Feldl結合抗體洗脫出一個峰，保留體積為12.9ml，其對應于單體IgG的保留體積。在相同的級分中檢測到了異源的Betvl-Feldl交聯性活性，表明雙特異活性與單體IgG有關(數據未顯示)。實施例26評估血細胞介導的IgG4交換活性將嵌合抗體混合，隨后與三個不同類型的人血細胞(即單個核細胞(MNC)、紅細胞和血小板)溫育，以研究IgG4的交換活性。將來自一個匿名供體的全血抽入含有肝素的采血管中，隨后在Percoll(PharmaciaFineChemicals,Uppsala,Sweden)巾MNC。白勺MNC重懸在Optimem無血清培養基(Invitrogen，Breda，荷蘭)中備用。新鮮純化的血細胞和血小板(由BloodCellResearchDepartmentofSanquin提供)獲自兩個不同的匿名供體。這些細胞在清洗3次之后也重懸在Optimem中。此外，向血小板中補充IOmM葡萄糖。評估IgG4半分子的交換，并與IgGl半分子的交換進行比較。在PBS中制備了如下的抗體混合物-Betvl特異性IgG4(10yg)和Feldl特異性IgG4(10yg)-Betvl特異性IgGl(10μg)和Feldl特異性IgGl(10μg)在水平回轉振蕩器(125rpm)上將這些抗體混合物下與1.8xl04的MNC，4.OxlO8的紅細胞或3.5xl04的血小板(每種抗體的終濃度均為0.1μg/ml)在100μ1總體積中于37°C溫育。48h后，將溫育混合物在Eppendorf離心機中以2800rpm離心lmin，之后吸取10μ1樣品至500μ1PBS-AT(PBS添加0.3%牛血清白蛋白，0.1%Tween-20和0.05%(w/ν)NaN3)中。如果需要，將樣品保存在4°C。在異源交聯測定中測量雙特異活性(即Feldl-Betvl交聯活性)。在此測定中，將樣品與0.5mgSepharose偶聯的重組Feldl在PBS-IAT(PBS-AT添加1μg/mlIVIg)中(總體積為300μ1)溫育24h。隨后，用PBS-T清洗Sepharose,并與125I標記的Betvl溫育24h，之后用PBS-T清洗S印harose，并測量結合的放射性的量相對于所添加放射性的量。在圖6中，雙特異活性用結合的125I標記Betvl的百分比顯示，其是在異源交聯測定中測得的。所有三種細胞類型均能夠誘導雙特異活性。在Optimem無血清培養基中也可觀察到一些雙特異活性，但是這個活性遠遠低于有血細胞存在時觀察到的水平。所有測試細胞均不能交換IgGl半分子。實施例27通過人和小鼠細胞系評估IgG4交換將嵌合IgG4抗體混合，然后與三個不同的細胞系(即人胚胎腎(HEK)細胞、小鼠B細胞或雜交瘤)溫育，以研究IgG4的交換活性。J558(SAntigenPresentationResearchGroupofSanquin作為小鼠B細胞來源。產生抗Cl酯酶抑制劑的雜交瘤獲自AutoimmuneResearchGroupofSanquin。懸浮HEK(293F)細胞從Invitrogen，Breda，荷蘭獲得。所有細胞用PBS清洗3次，之后將細胞重懸在PBS中。通過將含有Betvl特異性IgG4(2μg)和Feldl特異性IgG4(2μg)的抗體混合物與前述細胞一起溫育評估IgG4半分子的交換。將抗體混合物在水平回轉振蕩器(125rpm)上與24xl05HEK細胞、25x10s小鼠B細胞或21xl05雜交瘤在50μ1總體積中(每種抗體的終濃度為80μg/ml)37°C溫育。Oh和24h后，將溫育混合物在Eppendorf離心機中以2800rpm離心lmin，之后吸取樣品至PBS-AT(PBS添加0.3%牛血清白蛋白，0.1%Tween-20和0.05%(w/v)NaN3)中。如果需要，將樣品保存在4°C。在異源交聯測定中測量雙特異活性(即Feldl-Betvl交聯活性)。在此測定中，將樣品的稀釋物與0.5mgSepharose偶聯的重組Feldl在PBS-IAT(PBS-AT添加1μg/mlIVIg)中(總體積為300μ1)溫育24h。然后，用PBS-T清洗Sepharose,并與125I標記的Betvl溫育24h，之后用PBS-T清洗S印harose，并測量結合的放射性的量相對于所添加放射性的量。在圖7中，雙特異活性用結合的125I標記Betvl的百分比顯示，其是在所述異源交聯測定中確定的。所有三種細胞類型均能夠交換IgG4半分子。實施例28紅細胞介導的IgG4半分子交換的評估將嵌合抗體混合，然后與人紅細胞溫育，以研究IgG4半分子的交換。從單個供體純化紅細胞，并在SAGM(鹽水、腺苷、葡萄糖、甘露醇)緩沖液中于4°C保存。使用之前，用PBS清洗細胞3次。在本實驗中，將IgG4半分子的交換與IgGl的交換進行比較。另外，對在過量無關IgG4存在下的IgG4交換進行評估。在PBS中制備如下的抗體混合物-Betvl特異性IgG4(4μg)和Feldl特異性IgG4(4μg)-Betvl特異性IgGl(4μg)和Feldl特異性IgGl(4μg)-Betvl特異性IgG4(4yg),Feldl特異性IgG4(4yg)和對抗原X特異的無關IgG4(80μg)將這些混合物與紅細胞在總體積100μ1的添加有0.05%(w/v)NaN3的PBS中(最終的血細胞比容為大約40%)溫育，然后在水平回轉振蕩器(125rpm)上37°C溫育。在示明的時間點，在Eppendorf離心機中以2800rpm對紅細胞離心lmin，之后吸取10μ1樣品到500μ1PBS-AT(添加70.3%牛血清白蛋白，0.1%Tween-20和0.05%(w/v)NaN3的PBS)中。在測量雙特異活性、二價性和抗原結合之前將樣品保存于4°C。作為對照，還將相同的混合物溫育在沒有紅細胞的PBS中。在抗原結合試驗中測量Betvl結合性抗體的水平。為此目的，在125I標記Betvl的存在下，將樣品在750μ1PBS-IATn^WT1μg/mlIVIg的PBS-AT)中與0.75mg蛋白GSepharose(AmershamBiosciences,Uppsala,Sweden)一起溫育24h。接著，用PBS-T(添加了0.Tween-20和0.05%(w/v)NaN3的PBS)清洗S印harose，并測量結合的放射性的量相對于所添加放射性的量。用純化的Betvl特異性抗體(每個試驗的范圍是0-200ng，用濁度計確定)作為標準品計算Betvl特異性IgG的濃度。對于使用Feldl和Betvl雙特異性抗體的實驗中的雙特異活性，在Feldl-Betvl交聯測定中加以測量。在該測定中，將含有IgG的樣品與S印harose偶聯的cat提取物(0.5mg)在總體積300μ1的PBS-AT中溫育24h。然后，用PBS-T清洗S印harose，并與125I標記的Betvl溫育24h，然后用PBS-T清洗S印harose，并測量結合的放射性的量相對于所添加的放射性的量。用純化的IgGl-Betvl(在Betvl結合試驗中利用蛋白GSepharose獲得的)作為標準計算雙特異性IgG(Feldl-Betvl)的濃度。在圖8中，提供了從紅細胞介導的交換獲得的數據。在紅細胞存在下，沒有觀察到IgGl半分子的交換，而在72h后觀察到大約最大的IgG4半分子交換(圖A)(注意如果等量的IgG4-Betvl和IgG4-Feldl被交換，則在隨機和完全的半分子交換之后，最多有50%的IgG4-Betvl半抗體會被摻入到雙特異性級分中)。在過量的無關IgG4的存在下，基本上沒有測量到IgG4半分子的交換，這與預期的Betvl與Feldl特異性IgG4與無關IgG4的交換相符。進行了大小排阻色譜以排除在IgG4混合物中觀察到的雙特異活性是IgG聚集的結果的可能性。為此，將樣品(在t=72h獲取)在SuperdeX200柱上進行分級，然后測量級分中的Feldl結合性IgG和Betvl-Feldl交聯性IgG。Feldl結合抗體洗脫為一個峰，保留體積為12.9ml，其對應于單體IgG的保留體積。在相同的級分中檢測到了異源Betvl-Feldl交聯活性，表明雙特異活性與單體IgG有關(數據未顯示)。理論上，IgG4半分子的交換也伴隨著二價性的降低。為了檢驗這一點，對溫育混合物中的二價性進行測量。在IgGl混合物中基本上沒有觀察到Feldl二價性降低，而在IgG4混合物中觀察到了50%的降低。這種降低與按照11比例混合的兩個不同IgG4分子的最大交換是相符的。與預期的一樣，在存在過量的無關IgG4時IgG4混合物中的二價性降低得更多(80%)，這是由于存在過量的無關IgG4半分子時，兩個同源半分子(Betvl或Feldl特異)發生重新雜交的可能性降低。二價性的強烈降低不是由于溫育期間抗原結合喪失的結果，因為抗原結合在溫育72h之后只有微弱的降低(10%)(數據未顯示)。同時評估了IgG在PBS(添加了0.05%(w/v)NaN3)中的交換，以研究IgG4半分子是否能夠自發交換。該實驗的條件與有紅細胞存在時的交換相似，只是沒有添加紅細胞。在PBS中37°C溫育期間沒有觀察到IgGl或IgG4半分子的自發交換，如圖9A所示。然而，在IgG4混合物中觀察到一些背景，該背景在與紅細胞溫育的期間也存在。在PBS中溫育期間沒有觀察到二價性降低(圖9B)。實施例29紅細胞裂解物介導的IgG4交換的評估將嵌合IgG4抗體混合，然后與稀釋度遞增的紅細胞裂解物溫育。從健康供體分離紅細胞，并在SAGM(鹽水、腺苷酸、葡萄糖、甘露醇)緩沖液中保存于4°C，血細胞比容為60.7%。為了獲得裂解物，用PBS-疊氮化物(PBS中添加0.05%(w/v)NaN3)清洗細胞3次，并重懸在體積二倍于存儲緩沖液的體積的水中。結果，未稀釋的紅細胞裂解物相當于血細胞比容為30%。通過將由Betvl特異性IgGA(Iyg)和Feldl特異性IgG4(1μg)的IgG4組成的抗體混合物與50μ1新鮮制備的裂解物(添加PBS/疊氮化物到總體積為100μ1)在37°C—起溫育進行IgG4半分子交換的評估。每種抗體的最終濃度為10μg/ml。在示明的時間點，從溫育混合物采取樣品至PBS-AT(PBS添加0.3%牛血清白蛋白，0.1%Tween-20和0.05%(WZV)NaN3)中以測量雙特異活性。如果需要，將樣品保存于4°C。雙特異活性(即Betvl-Feldl交聯性活性)的測量在異源交聯測定中進行。在該測定中，樣品稀釋物與0.5mgS印harose偶聯的樺木提取物(birchextract)在總體積為300μ1的PBS-IAT(PBS-AT中添加μg/mlIVIg)中溫育24h。然后，用PBS-T清洗Sepharose,并與125I標記的Feldl溫育24h，然后用PBS-T清洗S印harose，并測量結合的放射性的量相對于所添加的放射性的量。雙特異性IgG(Betvl-Feldl)的濃度用Feldl結合試驗的校正曲線加以計算，該標準曲線是用純化的Feldl結合性rlgG獲得的。在圖10中，經時(intime)的雙特異活性產生用結合的125I標記Feldl的百分比來表示，后者是在異源交聯測試中確定的。從這些數據顯然可見紅細胞的裂解物含有交換活性。在未稀釋的裂解物中觀察到最高的交換速度，而稀釋度越高，交換速度越低。在PBS中進行的對照溫育中幾乎沒有觀察到雙特異活性。實施大小排阻色譜以排除紅細胞裂解物所誘導的雙特異活性是IgG聚集的結果的可能性(圖11)。為此目的，制備溫育混合物，其由IOygBetvl結合性IgG4、10μgFeldl結合性IgG4和50μ1紅細胞裂解物組成，并添加PBS/疊氮化物到最終體積為100μ1。將該混合物在37°C溫育24h，然后將70μ1在Superdex200柱上進行分級。在級分中，測量Betvl結合性IgG和Feldl-Betvl交聯性IgG。在抗原結合試驗中測量Betvl結合性抗體的水平。將樣品與0.75mg蛋白GSepharose(AmershamBiosciences,Uppsala,Sweden)一起在125I標記的Betvl的存在下，在750μ1PBS-IAT(PBS添加1μg/mlIVIg、0.3%牛血清白蛋白、0.Tween-20和0.05%(w/v)NaN3)中溫育24h。接著，用PBS-T(PBS添加0·1%Tween-20和0.05%(w/v)NaN3)清洗S印harose，并測量已結合的放射性的量相對于所添加放射性的量。使用純化的Betvl特異抗體作為標準(每個試驗的范圍是0-200ng，用濁度計確定)計算Betvl特異IgG的濃度。在異源交聯測定中測量雙特異IgG的濃度(即Feldl-Betvl交聯活性)。在該測定中，將樣品在總體積300μ1的PBS-IAT中與0.5mg的S印harose偶聯cat提取物(其中存在Feldl抗原)溫育24h。然后，用PBS-T清洗S印harose，并與125I標記的Betvl溫育24h，之后用PBS-T清洗S印harose，并測量已結合的放射性的量相對于所添加的放射性的量。雙特異性IgG(Feldl-Betvl)的濃度的計算使用與Betvl結合試驗中所用相同的校正曲線，其是由純化的Betvl結合性rlgG獲得的。Betvl結合抗體在一個峰內洗脫，保留體積為12.6ml，對應于單體IgG的保留體積(圖11)。在相同的級分中檢測到了異源Feldl-Betvl交聯活性，表明雙特異活性與單體IgG有關。實施例30經過透析的紅細胞裂解物中IgG4交換的評估從健康供體分離紅細胞，并以60.7%的血細胞比容在SAGM(鹽水、腺苷酸、葡萄糖、甘露醇)緩沖液中保存于4°C。為了獲得裂解物，用PBS-疊氮化物(PBS中添加0.05%(w/v)NaN3)清洗細胞3次，并重懸在體積2倍于存儲緩沖液的體積的水中。因此，未稀釋的紅細胞裂解物相當于血細胞比容為30%。將一部分裂解物用Pierce產的透析膜盒(3.5kD截留)對PBS-疊氮化物進行透析。將未透析的裂解物在Amicon過濾器(3.5kD截留)中進行離心，獲得超濾液。通過將IgG4抗體混合物(Betvl特異性IgG4(0.5μg)和Feldl特異性IgG4(0.5yg))與新鮮制備的紅細胞裂解物(25μ1)或經透析的裂解物(25μ1)在37°C一起溫育來評估IgG4半分子的交換。每個溫育體系的總體積為50μ1，這樣每種抗體的終濃度為10yg/ml。使用如下的添加物Sigma產的還原型谷胱甘肽(GSH)，葡萄糖-6磷酸(G-6-P)和NADPH(均由Roche產)。這些化合物在使用之前溶解于水中。溫育24h后，從溫育混合物采取樣品到PBS-AT(PBS添加0.3%牛血清白蛋白、0.1%Tween-20和0.05%(w/ν)NaN3)中，以測量雙特異活性。如果需要，將樣品保存于4°C。在異源交聯測定中測量雙特異活性(即Betvl-Feldl交聯活性)。在該測定中，將樣品稀釋物與0.5mg的S印harose偶聯cat提取物在總體積為300μ1的PBS-IAT(PBS-AT添加μg/mlIVIg)中溫育24h。然后，將Sepharose用PBS-T清洗，與125I標記的Feldl溫育24h，之后用PBS-T清洗S印harose，并測量結合的放射性的量相對于所添加的放射性的量。將交換水平與新鮮制備的裂解物產生的雙特異活性進行比較(表2)。<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>表2.透析紅細胞裂解物中恢復雙特異活性的因子的概覽將經透析的紅細胞裂解物的交換活性與新鮮制備的裂解物進行比較。透析裂解物添加5□1超濾液。G-6-P、NADPH和GSH的終濃度分別為5mM、0.ImM和0.5mM。從這些數據顯然可見，紅細胞裂解物的活性在透析之后損失掉了。添加超濾液恢復了大部分的交換。這一結果提示，在透析期間某種組分(<3.5kD)損失了，而該組分對于交換反應是至關重要的。這一組分很可能參與氧化還原循環，因為二硫橋還原和氧化是IgG4半分子交換必需的。因此，向透析裂解物添加氧化還原循環中的三種“輔因子”(G-6-P、NADPH和GSH)，以研究這些化合物是否能夠恢復交換活性。如果同時補充G_6_P、NADPH和GSH，則交換活性可以被恢復。在各別的因子存在下溫育經透析的裂解物顯示，GSH可恢復交換活性，G-6-P或NADPH則不能。實施例31還原型谷胱甘肽介導的IgG4半分子交換的評估將嵌合抗體混合，然后與還原型谷胱甘肽(GSH)溫育，以研究IgG4的交換。將GSH(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)溶解于水中備用。在本實驗中，IgG4半分子的交換是通過將由Betvl特異性IgG4(lμg)和Feldl特異性IgG4(lμg)的IgG4組成的抗體混合物在含有GSH的PBS/疊氮化物中37°C溫育來評估的。總溫育體積為ΙΟΟμΙ，這樣每種抗體的終濃度為10yg/ml。在示明的時間點，從溫育混合物采取樣品到PBS-ATG^WT0.3%牛血清白蛋白、0.1%Tween-20和0.05%(w/v)NaN3WPBS)中。將樣品保存在4°C，用于測量抗體結合和雙特異活性。在抗原結合試驗中測量Betvl結合性抗體的水平。在125I-標記的Betvl的存在下，將樣品與0·75mg蛋白GSepharose(AmershamBiosciences,Uppsala,Sweden)在750μ1的PBS-IAT(PBS-AT添加μg/mlIVIg)中溫育24h。接著，用PBS-T(PBS添加0.l%Tween_20和0.05%(w/v)NaN3)清洗S印harose，并測量結合的放射性的量相對于所添加的放射性的量。使用純化的Betvl結合性抗體作為標準(每個試驗的范圍是0-200ng，由濁度計確定)計算Betvl特異性IgG的濃度。在異源交聯測定中測量雙特異性IgG的濃度(即Feldl-Betvl交聯活性)。在該測定中，將樣品與0.5mg的S印harose偶聯cat提取物(其中存在Feldl抗原)在總體積300μ1的PBS-IAT中溫育24h。然后，將S印harose用PBS-T清洗，并與125I-標記的Betvl溫育24h，之后用PBS-T清洗S印harose，測量已結合的放射性的量相對于所添加的放射性的量。雙特異IgG(Feldl-Betvl)的濃度的計算使用在Betvl結合試驗中所用相同的校正曲線，其是由純化的Betvl結合性IgG獲得的。在圖12中，提供了GSH介導的IgG4半分子交換的時間過程。從這些數據顯然可見，IgG4半分子在GSH的存在下被交換了。在本實驗中，在0.I-ImMGSH之間觀察到了最佳的交換，使用0.5mMGSH，在24h后達到了最高的交換(90%)。實施大小排阻色譜，以排除在GSH介導的IgG4交換之后觀察到的雙特異活性是IgG聚集的結果的可能性(圖13)。為此，將Betvl結合性IgG4與Feldl結合性IgG4(每種抗體IOyg)的混合物在PBS/疊氮化物中與0.5mMGSH溫育。將該混合物(最終體積100μ1)在37°C溫育24h，之后將70μ1在Superdex200柱上進行分級。在級分中，測量Betvl結合性IgG和Feldl-Betvl交聯性IgG。Betvl結合性抗體在一個峰中洗脫，保留體積為12.6ml，對應于單體IgG的保留體積。在相同的級分中檢測到了異源Feldl-Betvl交聯活性，提示雙特異活性與單體IgG有關。發現GSH存在下的雙特異IgG4分子的產生是溫度依賴性的，因為在37°C下比在4°C下交換發生效率更高(圖14)。實施例32.其他作用劑存在下雙特異IgG的產生混合IgGl-Betvl與IgGl-Feldl或IgG4_Betvl與IgG4_Feldl，使每種抗體的終濃度為10μg/ml，并在總體積50μ1中與還原劑一起溫育。除了GSH之外，對如下的作用劑進行測試(溫育混合物中的終濃度)=Sigma產的L-半胱氨酸(100μΜ)，Biorad產的二硫蘇糖醇(50μΜ)，Biorad產的β-巰基-乙醇(BME)(100μΜ)，和Sigma產的氧化型谷胱甘肽(GSSG，注意在該組作用劑中這種作用劑是非還原性的，而其它的則是還原性的)(100μM)。將混合物在37°C溫育24h，并采取樣品到PBS/AT中，在其中對(雙)特異IgG的濃度進行測量。圖15顯示，向純化的IgG4-Betvl和IgG4-Feldl的混合物中添加GSH或其它還原劑(但非GSSG)足以誘導Fab臂交換和雙特異IgG4的產生。相比之下，在對照IgGl混合物中沒有誘導出雙特異反應性。實施例33.使用GSH的全人IGG4抗體的交換混合IgGl-CD20、IgG4_CD20、IgGl-EGFr和IgG4_EGFr，并與GSH在Iml總體積中溫育。每種抗體的終濃度為50μg/ml；GSH的終濃度為0.5mM。將混合物在37°C溫育24h，采取樣品在PBS-AT中，對其中的(雙)特異IgG的濃度進行測量。雙特異活性用夾心式ELISA測定。該測定用含lyg/mlEGFR重組胞外域的PBSdOOμ1/孔)在4°C下對ELISA板(Greinerbio-one,Frickenhausen,Germany)包被過夜。用PBS/0.05%Tween20(PBT)清洗板3次。將樣品稀釋在ΡΒΤ/0.2%BSA(PBTB)中，并轉移到ELISA板(100μ1/孔)。在平板振蕩器(300rpm)上室溫(RT)下溫育90分鐘之后，棄去樣品，用PBT清洗板3次。接著，添加100μ1溶于PBTB中的2μg/ml小鼠抗獨特型單克隆抗體2F2SAB1.1(針對抗-⑶20抗體7D8；Genmab)，RT下在平板振蕩器(300rpm)上溫育90分鐘。棄去抗獨特型抗體，用PBT清洗板3次，然后添加100μ1/孔的在PBTB中稀釋IOOOx的HRP偶聯山羊抗小鼠IgG(JacksonImmunoResearchLaboratories,Westgrove,PA,USA)，并在RT下在平板振蕩器(300rpm)上溫育90分鐘。棄去檢測抗體，用PBT清洗豐13&。50mgABTS(RocheDiagnosticsGmbH,Mannheim,Germany)MM^ABTS緩沖液(Roche)中，添加到ELISA板上(100μ1/孔)。將ELISA板用鋁箔覆蓋，在RT下平板振蕩器(300rpm)上溫育30分鐘(或者更長時間，如果需要的話)，用100μ1每孔的草酸(RiedeldeHaenSeelze,Germany)終止反應。將ELISA板置于RT下10分鐘，然后在ELISA酶標儀內閱讀405nm吸光度。圖16A顯示，在GSH存在下溫育IgG4_EGFr和IgG4_⑶20混合物時，經過一段時間形成雙特異性的抗EGFR/CD20抗體，而在不存在GSH時則不會形成。而在IgGl抗體的混合物中，無論是否存在GSH均沒有發生Fab臂交換。為了探索GSH介導的IgG4半分子交換的動態范圍，使用GSH的完全濃度曲線(0.5-1，000μΜ)對交換進行分析。混合IgG4-CD20和IgG4_EGFr，并在總體積Iml中與GSH溫育。每種抗體的終濃度為50μg/ml；GSH的終濃度如圖16B所示。將混合物在37°C溫育24h，并將樣品采取到PBS-AT中，測量其中的(雙)特異IgG的濃度。圖16B顯示出IgG4半分子交換的明顯的GSH劑量依賴性。為了探索反應組分對GSH介導的IgG4半分子交換有何影響，在PBS和無血清和蛋白的化學限定培養基(FreeStyle293表達培養基，GIBCO/InvitrogenCorporation)中對交換進行了測試。結果發現，在該組織培養基中，GSH介導的交換在更低的GSH濃度下發生(圖16C)。還發現，在GSH介導的IgG4半分子交換中存在一個最優值，因為與5mMGSH溫育的交換明顯導致低于與0.5mM溫育的交換(圖16D)。在有或無GSH的條件下將一個IgG4-EGFr和IgG4_CD20的混合物溫育24h，并通過質譜(ESI-T0FMS)進行評估。含有200yg/ml每種抗體的50μ1樣品用ΙμN-糖苷酶F(RocheDiagnosticsNLBV，Almere，荷蘭)過夜去糖基化。樣品在AcquityUPLC(ffaters,Milford,USA)上用BEHC8，1.7μm，2.1x50mm柱在60°C進行脫鹽。注射50μ1，用5%-95%的洗脫液B梯度進行洗脫。洗脫液A是MilliQ水(MilliporeSynthesisAlO裝置)，洗脫液B是LC-MS級乙腈(Biosolve，Valkenswaard,荷蘭)。兩種洗脫液均含0.05%甲酸作為有機修飾劑(FlukaRiedel-deHaen,Buchs,Germany)。飛行時間電噴霧電離質譜在線(on-line)地記錄在以陽離子模式工作的micrOTOF質譜儀(Bruker，Bremen,Germany)±。中，ffiESijHtgg·(AgilentTechnologies,SantaClara,USA)對500_5000m/z的范圍(scale)進行內部校準。使用極大熵(MaximumEntropy)算法將質譜去卷積，該算法由DataAnalysis軟件v.3.3(Bruker)提供。圖16E顯示，在沒有GSH存在的條件下，IgG4_⑶20的分子量(145.5kD)和IgG4-EGFR的分子量(145.9kD)均保持不變。然而，在GSH存在下(圖16F)，出現了一個新峰，其質量相應于一個經Fab臂交換的分子(145.7kD)。這個新質量對應于雙特異性抗EGFR/CD20抗體的預期質量。然而，從MS譜的峰高度可以估計，雙特異抗體占了混合物中總抗體質量的50%，表明發生了隨機交換，其在24h內達到平衡。實施例34.來自獼猴(和其它物種)的多克隆免疫球蛋白參與重組人IGG4抗體的Fab臂交換將兩種重組人IgG4抗體(IgG4_⑶20和IgG4_EGFr，如上所述)的混合物在存在或不存在來自獼猴(6x)、黑猩猩(2x)、食蟹猴、狒狒、馬和豬的純化免疫球蛋白或人IVIg的條件下與GSH在37°C溫育24h。在如上所述的夾心式ELISA中測量通過Fab臂交換的雙特異性抗體形成。此外，此測定中也測試了山羊、家兔和綿羊免疫球蛋白。圖17a顯示，，獼猴多克隆免疫球蛋白與人多克隆免疫球蛋白(IVIg)在體外抑制重組抗體在還原型谷胱甘肽的存在下的Fab臂交換的能力相當。這意味著獼猴免疫球蛋白的某個組分參與了Fab臂交換。獼猴免疫球蛋白，可能是獼猴IgG4，能夠與重組人IgG4交換Fab臂。圖17b顯示，來自其它數只獼猴的多克隆免疫球蛋白在體外以不同的效力抑制重組抗體在還原型谷胱甘肽存在下的Fab臂交換。這意味著，所述參與Fab臂交換的獼猴免疫球蛋白組分以不同的濃度存在，或者該組分并不存在于所有的獼猴體內。圖17c顯示，來自數種其它猴類(狒狒、黑猩猩、食蟹猴)的多克隆免疫球蛋白，以及來自馬和豬的免疫球蛋白，在體外以不同的效力抑制重組抗體在還原型谷胱甘肽存在下的Fab臂交換。這意味著，所述參與Fab臂交換的成分以不同的濃度存在于這些物種中。山羊、家兔和綿羊免疫球蛋白對重組免疫球蛋白在還原型谷胱甘肽存在下的體外Fab臂交換無影響(數據未顯示)。實施例35.鉸鏈區或CH3結構域突變體的半分子交換制備了三種IgGl突變體具有IgG4核心鉸鏈的IgGl(IgGl-CPSC)和兩個CH3結構域互換突變體(swapmutants)S卩(IgGl_CH3(IgG4)和IgGl_CPSC_CH3(IgG4))。使用pEE-Gl-wtaBetvl作為模板(228表示抗體氨基酸殘基的EU編號。相同的位置在Kabat編號法中為241號，在SEQIDNO:19中為111號(CPPC核心鉸鏈序列中的第三個位置))，利用定點誘變在IgGl的鉸鏈中引入一個P228S突變。突變引物，正向和反向，用VectorNTIAdvance10設計P228S正向突變引物(Mutprimer-F):SEQIDNO22P228S反向突變引物(Mutprimer-R):SEQIDNO23<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>使用Quickchange定點誘變試劑盒(Stratagene)產生pEE-Gl-CPSC突變體。聚合酶鏈式反應(PCR)混合物由5μ1pEE-GlaBetvlDNA模板(35ng)，1，5μ1正向突變引物(150ng)，l，5y1反向突變引物(150ng)，1μ1(1^混合物，5“1反應緩沖液(IOx),36μ1H2O以及最后ΙμPfuTurboDNA聚合酶組成。然后將混合物應用于PCR30"95°C,30"950C(變性)，1，55°C(退火)和Hmin68°C(延伸)。該循環重復2O次。利用DNA消化和連接產生CH3結構域互換突變構建體IgGl_CH3(IgG4)和IgGl-CPSC-CH3(IgG4)。用于獲得CH3結構域和無CH3結構域的載體的消化反應體系如下1500ngDNA(pEE-Gl-betvl、pEE-Gl-CPS(^npEE-G4-betvl)、2ylBSA、2ylNeb3緩沖液、ΙμSallJnH2O至體積20μ1。在37°C溫育30，。純化DNA并用30μ1H2O洗脫，之后添加1μ1SanDI和3μ1通用緩沖液，在37°C溫育30’。將片段在含有溴化乙錠的瓊脂糖凝膠上進行凝膠電泳。在紫外光下將片段從凝膠上切下，并用DNA純化試劑盒(Amersham)溶解。用如下的程序將pEE-G4_wtSall/SanDI(其含有IgG4CH3結構域)片段連接到pEE-Gl-wt和pEE-Gl-CPSC中1μ1模板DNA(Sall/SanDI消化的pEE-Gl-wt禾口pEE-Gl-CPSC)，5μ1Sall/SanDI插入序列，4μ1Ligate-it緩沖液，9μ1H2O和1μ1連接酶，總體積為20μ1。5’后終止連接反應。采用與上面相似的程序，利用DNA消化(使用ApaI和HindIII)和連接，將betvl突變抗體的VH結構域替換為pEE-G4-a-feldlwt的VH結構域。另外，制備一種lgG4突變體IgG4-S228Pnew。在該突變體中，通過將228位絲氨酸(SEQIDNO19中的位置111)替換為脯氨酸(IgGl核心鉸鏈)來使鉸鏈穩定化。定點誘變使用QuickChangeIIXL定點誘變試劑盒(Stratagene，Amsterdam，荷蘭)，根據制造商的使用說明操作。該方法包括引入一個沉默的額外XmaI位點，用于篩選成功的誘變。簡而言之，將5μ1IOx反應緩沖液，1μ1寡核苷酸S228Pfcorrect(1OOpmo1/μ1)，1μ1寡核苷酸S228Prcorrect(100pmol/y1)，1μ1dNTP混合物，3μ1Quicksolution,1μ1質粒pTomG42F8HG(50ng/μ1)(2006年11月28日提交的(RO/DK(Genmab)、題為"Recombinantmonovalentantibodiesandmethodsforproductionthereof，，白勺PCT專禾串i青中有描述)以及ΙμPfuUltraHFDNA聚合酶混合成總體積為50μ1，并用TGradientThermocycler96(WhatmanBiometra,Goettingen,Germany；產品編號050-801)使用18個循環的程序進行擴增95°C變性Imin；18個循環的95°C50sec，60°C50sec和68°CIOmin。將PCR混合物保存于4°C直至進一步處理。接著，將PCR混合物與1μ1DpnI在37°C溫育60min以消化pTomG42F8HGV載體，然后保存于4°C直到進一步處理。將反應混合物用5μ13MNaAc和125μ1乙醇沉淀，在_20°C溫育20min，然后以14000xg在4°C離心沉降20分鐘。將DNA離心沉淀用70%乙醇清洗，干燥并溶解于4μ1水中。按照制造商的使用說明(Invitrogen)將總共4μ1反應體積轉化到OneShotDNH5αTIk感受態大腸桿菌細胞(Invitrogen，Breda，荷蘭)中。接著，將細胞涂布在含有50μg/ml氨芐青霉素的Luria-Bertani(LB)瓊脂平板上。將平板在37°C溫育16-18小時，直到細菌菌落變得明顯。通過菌落PCR和XmaI(突變將導致XmaI位點丟失)消化進行篩選之后，從細菌分離質粒，并通過DNA測序對突變進行確認。為了檢查是否引入了非期望的額外突變，對整個HC編碼區進行測序，發現沒有包含任何額外突變。將最終的構建體命名為pTomG42F8S228PNew0寡核苷酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>將來自這些構建體的重組抗體在3ml，6孔板(NUNC)內或者在125ml錐形瓶(erlenmeyers)(Corning)內于HEK293細胞中瞬時表達，以293Fectin(Invitrogen)作為轉染試劑。將下述非純化抗體的混合物(FreeStyle293表達培養基，GIBCO/InvitrogenCorporation)與0.ImMGSH在37°C溫育24h，將樣品吸取在PBS-AT中，按照先前實施例所述測量其中的(雙)特異性IgG的濃度-IgG4a-feldlwt與IgG4a_betvlwt-IgGla-feldlwt與IgG4a_betvlwt-IgGla-feldlCPSC與IgGla-betvlCPSC(下面表示為IgGlCPSC-IgGlCPSC)-IgGla-feldlCPSC與IgGla-betvlCH3(IgG4)(IgGlCPSC_IgGlCH3(IgG4))-IgGla-feldlCPSC與IgGla-betvlCPSC/CH3(IgG4)(IgGlCPSC-IgGlCPSC/CH3(IgG4))-IgGla-feldlCH3(IgG4)與IgGla-betvlCH3(IgG4)(IgGlCH3(IgG4)-IgGlCH3(IgG4))-IgGla-feldlCH3(IgG4)與IgGla-betvlCPSC/CH3(IgG4)(IgGlCH3(IgG4)_IgGlCPSC/CH3(IgG4))-IgGla-feldlCPSC/CH3(IgG4)與a-betvlIgGlCPSC/CH3(IgG4)(IgGlCPSC/CH3(IgG4)-IgGlCPSC/CH3(IgG4))-IgGla-feldlCPSC/CH3(IgG4)與IgG4a_betvlwt(IgGlCPSC/CH3(IgG4)-IgG4wt-IgG4a-betlS228Pnew%IgG4wt結果顯示，在這些體外條件下(0.ImMGSH)，當其中一種抗體含有CPSC鉸鏈且兩種抗體均含有IgG4-樣CH3時，會發生半分子交換。另外，在含有IgGl鉸鏈的IgG4分子與IgG4wt分子之間也發生半分子交換IgGlwtIgG4wtIgGlIgGlIgGlCH3(IgG4)CPSCCPSC/CH3(IgG4)IgGlwt--IgG4wt-+++IgGlCH3(IgG4)+-士IgGlCPSC----IgGl+士-+CPSC/CH3(IgG4)IgG4S228Pnew-+-=無交換+=發生交換士=有限的交換(5%)空白框=未測試用0、0.1、1和IOmMGSH測試了GSH濃度對來自不同突變體的半分子交換的影響。交換的測試使用如下的混合物-IgG4a-feldlwt與IgG4a_betvlwt-IgGla-feldlwt與IgG4a_betvlwt-IgGla-feldlCPSC與IgGla-betvlCPSC-IgGla-feldlCH3(IgG4)與IgGla-betvlCH3(IgG4)-IgGla-feldlCPSC/CH3(IgG4)與a-betvlIgGlCPSC/CH3(IgG4))對于濃度不大于ImM的GSH，結果(圖19A)證實了上文的描述。在IOmMGSH下，在含有IgGla-feldlCH3(IgG4)和IgGla-betvlCH3(IgG4)的反應中也見到了半分子交換。如前面實施例中所述實施大小排阻色譜，以排除在GSH介導的合適的IgGl突變體的交換之后所觀察到的雙特異活性是IgG聚集的結果的可能性。在相應于單體IgG的保留體積的級分中檢測到了異源Feldl-Betvl交聯活性。為了鑒定CH3結構域中負責半分子交換能力的氨基酸殘基，將IgG4_樣殘基引入到IgGl的CH3中的在IgGl和IgG4之間不同的位置上。這樣，使用pEE_Gl_wtaBetvl或pEE-Gl-wtaFeldl作為模板，基本上按照如上所述將R238Q、K292R、Q302E或P328L突變(編號參照SEQIDNO19)引入到IgGl的CH3結構域中。而且，還使用pEE_Gl_CPSCbetvl或pEE-Gl-CPSCfeldl作為模板將一個K292R突變引入到IgGlCPSC的CH3結構域內。簡而言之，用VectorNTIAdvance10設計正向和反向誘變引物。使用Quickchange定點誘變試劑盒(Stratagene)產生構建體。將來自這些構建體的重組抗體在3ml6孔板(NUNC)內或者在125ml錐形瓶(Corning)內在HEK293細胞中瞬時表達，以293Fectin(Invitrogen)作為轉染試劑。將下述非純化抗體的混合物(FreeStyle293表達培養基，GIBCO/InvitrogenCorporation)與0.5或5mMGSH在37°C溫育24h，將樣品吸取在PBS-AT中，按照先前的實施例所述測量其中(雙)特異性IgG的濃度-IgGla-feldlwt與IgG4a_betvlwt(圖19B中表示為IgGl)-IgGla-feldlCPSC與IgG4a_betvlwt(圖19B中表示為IgGl-CPSC)-IgGla-feldlCH3(IgG4)與IgG4a_betvlwt(圖19B中表示為IgGl_CH3(G4))-IgGla-feldlCPSC/CH3(IgG4)與IgG4a_betvlwt(圖19B中表示為IgGl-CPSC/CH3(G4))-IgGla-feldlR238Q與IgG4a_betvlwt(圖19B中表示為IgGl_R238Q)-IgGla-feldlK292R與IgG4a_betvlwt(圖19B中表示為IgGl_K292R)-IgGla-feldlQ302E與IgG4a_betvlwt(圖19B中表示為IgGl_Q302E)-IgGla-feldlP328L與IgG4a_betvlwt(圖19B中表示為IgGl_P328L)-IgGla-feldlCPSC/K292R與IgG4a_betvlwt(圖19B中表示為IgGl-CPSC/K292R)-IgG4a-feldlwt與IgG4a_betvlwt(圖19B中表示為IgG4)-IgGla-feldlwt與IgGla-betvlwt(圖19C中表示為IgGl)-IgGla-feldlCPSC與IgGla-betvlCPSC(圖19C中表示為IgGl-CPSC)-IgGla-feldlCH3(IgG4)與IgGla-betvlCH3(IgG4)(圖19C中表示為IgGl-CH3(G4))-IgGla-feldlCPSC/CH3(IgG4)與IgGla-betvlCPSC/CH3(IgG4)(圖19C中表示為IgGl-CPSC/CH3(G4))-IgGla-feldlR238Q與IgGla-betvlR238Q(圖19C中表示為IgGl_R238Q)-IgGla-feldlK292R與IgGla-betvlK292R(圖19C中表示為IgGl_K292R)-IgGla-feldlQ302E與IgGla-betvlQ302E(圖19C中表示為IgGl_Q302E)-IgGla-feldlP328L與IgGla-betvlP328L(圖19C中表示為IgGl_P328L)-IgGla-feldlCPSC/K292R與IgGla-betvlCPSC/K292R(圖19C中表示為IgGl-CPSC/K292R)-IgG4a-feldlwt與IgG4a_betvlwt(圖19C中表示為IgG4)結果顯示，在被測試的體外條件下(0.5mM和5mMGSH)，當兩種抗體均在292位含有一個R時，可發生半分子交換(圖19B+C)。在該實驗條件下，238位的R或Q，302位的Q或E，以及328位的P或L對于IgGl不能交換半分子均無影響。實施例36.在0.5mMGSH下，具有穩定化的IgGl-樣核心鉸鏈的IgG4分子不參與重組人IgG4抗體的Fab臂交換反應將兩種重組人IgG4抗體(IgG4-⑶20和IgG4_EGFr，如上所述)的混合物在存在或不存在過量(10，50和100微克/ml)的那他珠單抗(Tysabri)或吉妥單抗(Mylotarg)(10微克/ml)的條件下與0.5mMGSH在37°C溫育24h。那他珠單抗是一種可商購的含有野生型IgG4核心鉸鏈的人源化IgG4抗體，而吉妥單抗是一種可商購的、含有一個穩定的IgGl-樣核心鉸鏈的人源化IgG4抗體。在如上文所述的夾心式ELISA中測量雙特異性抗體通過Fab臂交換的形成。圖20A顯示，在過量的那他珠單抗的存在下，重組⑶20和EGFr抗體的Fab臂交換被抑制。圖20B顯示，在過量的那他珠單抗而非吉妥單抗的存在下，重組⑶20和EGFr抗體的Fab臂交換被抑制。這表明，在使用0.5mMGSH的體外條件下，那他珠單抗而非吉妥單抗參與Fab臂交換反應，而且穩定化的IgGl-樣核心鉸鏈不參與Fab臂交換。實施例37.在292位具有額外突變的IgGl-CPSC構建體的半分子交換與實施例35類似，在pConGlf2F8(對EGFR特異)和pConGlf7D8(對CD20特異)中制備了三種IgGl突變體一個具有IgG4核心鉸鏈的IgGl(IgGl-CPSC)和兩個CH3結構域互換突變體(IgGl-CH3(IgG4)和IgGl_CPSC_CH3(IgG4)(即其中IgGl的CH3區被IgG4的CH3區替換的構建體))。這產生了如下的構建體pGlf-2F8CPSC、pGlf_7D8CPSC、pGlf-2F8-CH3(G4)、pGlf_7D8_CH3(G4)、pGlf_2F8CPSC_CH3(G4)和pGlf_7D8CPSC_CH3(G4)。然后，以基本上與上文所述相同的方式，在pGlf-2F8CPSC和pGlf-7D8CPSC構建體的CH3結構域中引入R238Q、K292R、K292Y、K292F、K292W、Q302E或P328L突變(見SEQIDN0:19)，。簡而言之，用VectorNTIAdvance10設計正向和反向突變引物。使用Quickchange定點誘變試劑盒(Stratagene)產生構建體。將來自這些構建體的重組抗體于3ml的6孔板(NUNC)內或者在125ml錐形瓶(Corning)內在HEK293細胞中瞬時表達，以293Fectin(Invitrogen)作為轉染試劑。然后將培養物上清對PBS透析，并通過濁度計量法測量濃度(見上文)。將非純化的、交換了緩沖液的抗體的下述混合物(FreeStyle293表達培養基，GIBCO/InvitrogenCorporation)與0.5GSH在37°C溫育24h，將樣品吸取在PBS-AT中，按照先前實施例所述測量其中(雙)特異性IgG的濃度-IgGl-2F8wt與IgGl_7D8wt(表示為IgGl)-IgGl-2F8-CPSC與IgGl_7D8_CPSC(表示為IgGl-CPSC)-IgGl-2F8-CH3(IgG4)與IgGl-7D8_CH3(IgG4)(表示為IgGl-CH3(IgG4))-IgGl-2F8-CPSC-CH3(IgG4)與IgGl-7D8-CPSC_CH3(IgG4)(表示為IgGl-CPSC-CH3(IgG4))-IgGl-2F8-CPSC-R238Q與IgGl-7D8_CPSC-R238Q(表示為IgGl_CPSC_R238Q)-IgGl-2F8-CPSC-K292R與IgGl_7D8_CPSC-K292R(表示為IgGl_CPSC_K292R)-IgGl-2F8-CPSC-K292Y與IgGl_7D8-CPSC_K292Y(表示為IgGl_CPSC_K292Y)-IgGl-2F8-CPSC-K292F與IgGl_7D8-CPSC_K292F(表示為IgGl_CPSC_K292F)-IgGl-2F8-CPSC-K292ff與IgGl_7D8_CPSC-K292W(表示為IgGl_CPSC_K292W)-IgGl-2F8-CPSC-Q302E與IgGl-7D8_CPSC-Q302E(表示為IgGl_CPSC_Q302E)-IgGl-2F8-CPSC-P328L與IgGl-7D8-CPSC_P328L(表示為IgGl_CPSC_P328L)-IgG4-2F8wt與IgG4_7D8wt(表示為IgG4)圖21顯示，在被測試的體外條件下(0.5mMGSH)，當存在CPSC鉸鏈并且在292位為R時，可發生半分子交換。此外，結果顯示，292位上為Y或F，但非W，也有助于半分子交換，盡管程度低一些。238位上的R或Q，302位上的Q或E，以及328位上的P或L對IgGl-CPSC不能交換半分子沒有影響。實施例38.具有穩定化的CPPC鉸鏈的IgG4分子能夠在體外(存在5mMGSH時)進行Fab臂交換，但在體內不能在5mMGSH的存在下，將IgG4_EGFR_CPPC和IgG4_CD20的混合物溫育24h，并通過質譜(ESI-TOFMS)進行評估。將含有每種抗體200μg/ml的50μ1樣品用1μ1N-糖苷酶F(RocheDiagnosticsNLBV,Almere，荷蘭)去糖基化處理過夜。將樣品在AcquityUPLC(Waters,Milford,USA)上用BEHC8、1.7μm，2.1x50mm柱60"C脫鹽。注射5μ1，用5%-95%的洗脫液B的梯度洗脫。洗脫液A是MilliQ水(MilliporeSynthesisAlO裝置)，洗脫液B是LC-MS級乙腈(Biosolve，Valkenswaard,荷蘭)。兩種洗脫液均含有0.05%甲酸作為有機改性劑(FlukaRiedel-deHaSn，Buchs，Germany)。飛行時間電噴霧電離質譜在線地記錄在以陽離子模式工作的micrOTOF質譜儀(Bruker，Bremen，Germany)上。每次分析中利用ES調節混合物(AgilentTechnologies,SantaClara,USA)內部校準500-5000m/z的范圍。質譜使用MaximumEntropy算法去卷積，后者是由DataAnalysis軟件v.3.3(Bruker)提供的。圖22A顯示，在5mMGSH的存在下出現了一個具有對應于Fab臂交換分子(145.7kDa)的中間質量的新峰。該新質量對應于雙特異抗EGFR/CD20抗體的預期質量。當沒有使用GSH或使用0.5mMGSH時，沒有雙特異抗體峰出現(數據未顯示)。這表明，在體外較高的GSH濃度下，可使得含有IgGl-樣、CPPC鉸鏈和IgG4-樣CH3區的突變體交換半分子(在實施例35、36、37中也有說明)。為了研究含有IgGl-樣、CPPC鉸鏈和IgG4_樣CH3區的穩定化鉸鏈突變體在體內是否發生Fab臂交換，我們向免疫缺陷小鼠體內注射了IgG4-⑶20和IgGl-EGFR、IgG4-EGFR、IgG4-EGFR-CPPC的等量混合物。在不同時間點采取血液樣品，在ELISA中定量雙特異性抗體(如上文所述)，使用體外交換的混合物(IgG4-EGFR/IgG4-CD20)作為參考標準。圖22B顯示，在注射了含有野生型IgG4分子(IgG4_EGFR)的混合物的小鼠的血液中出現了雙特異性抗體。在包含鉸鏈穩定化的IgG4(IgG4-EGFR-CPPC)或IgGl分子(IgGl-EGFR)的混合物中沒有檢測到雙特異性抗體(符號在圖中未顯示)。這表明，核心鉸鏈的穩定化會在體內阻止IgG4Fab臂交換，但是不能在體內交換半分子(盡管我們不能排除鉸鏈穩定化的IgG4確實可能發生低于檢測水平(72小時內<8%)的低水平交換)。這提示含有穩定化CPPC鉸鏈的雙特異性抗體能夠通過體外Fab臂交換獲得。經過后續的針對這些雙特異性抗體的特異性純化之后，這些抗體在體內注射時將保持穩定(即不會發生Fab臂交換)。實施例39.CXXC突變體的Fab臂交換對核心鉸鏈中含有不同CXXC基序的抗體的交換Fab臂的能力進行了測試。使用上文所述的定點誘變技術將如下的CXXC基序引入到IgG4betvl和IgG4feldl中-CGHC(就蛋白質-二硫化物-異構酶，PDI描述過的活性位點序列)-CGC(據稱具有潛在的二硫化物還原能力的肽)-CPRC(GorillaIgG4的核心鉸鏈序列)-CPHC(關于人硫氧還蛋白描述的活性位點序列)將如下的純化抗體的混合物與0.5mMGSH在37°C溫育，在0_24h之間的不同時間點吸取樣品到PBS-AT中，按照前面實施例中的描述對其中的(雙)特異IgG濃度進行測量-IgGla-feldlwt與IgGla-betvlwt(在圖23禾口24中表示為IgGl)-IgG4a-feldlwt與IgG4a_betvlwt(在圖23禾口24中表示為IgG4)-IgG4a-feldlCGHC與IgG4a_betvlCGHC(在圖23和24中表示為CGHC)-IgG4a-feldlCGC與IgG4a_betvlCGC(在圖23和24中表示為CGC)-IgG4a-feldlCPRC與IgG4a_betvlCPRC(在圖23和24中表示為CPRC)-IgG4a-feldlCPHC與IgG4a_betvlCPHC(在圖23和24中表示為CPHC)結果(圖23)顯示，在一段時間內，含有CGC基序或IgGl核心鉸鏈的抗體沒有發生Fab臂交換。含有CGHC基序的抗體的Fab臂交換的效力與IgG4wt抗體相同。在含有CPRC基序的抗體中也發生了Fab臂交換，盡管稍微慢一些，而且含有CPHC基序的抗體中也有程度低一些的Fab臂交換。另外，測試了GSH濃度(1-20，000μΜ)對于這些混合物在37°C溫育24h之后進行Fab臂交換的能力的影響。發現含有CPHC-，CPRC-和CGHC-基序的抗體以及IgG4wt抗體的Fab臂交換依賴于GSH濃度(圖24)，在100-1，000μMGSH之間存在一個最佳值。權利要求一種用于產生雙特異性抗體的體外方法，所述方法包括如下步驟a)提供具有第一結合特異性的第一抗體，其中所述第一抗體包含IgG4-樣CH3區，b)提供具有不同于所述第一結合特異性的第二結合特異性的第二抗體，其中所述第二抗體包含IgG4-樣CH3區，c)在允許核心鉸鏈區中的半胱氨酸發生二硫鍵異構化的還原條件下共同溫育所述第一和第二抗體，和d)獲得雙特異性抗體。2.權利要求1的體外方法，其中所述第一抗體在核心鉸鏈區中包含CPPC序列。3.前述權利要求中任一項的體外方法，其中所述第一抗體包含IgG4-樣核心鉸鏈區。4.權利要求1或3中任一項的體外方法，其中所述第一抗體是在核心鉸鏈區中包含CX1X2C序列的抗體，其中X1和X2可以是任何氨基酸，但X1和X2不能都是脯氨酸。5.權利要求4的體外方法，其中所述第一抗體是在核心鉸鏈區中包含CX3PC或CPX3C序列的抗體，其中X3可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸。6.權利要求5的體外方法，其中所述第一抗體是在核心鉸鏈區中包含CSPC、CPSC、CRPC,CPRC,CGHC或CPHC序列的抗體。7.前述權利要求中任一項的體外方法，其中所述第一抗體包括IgG4CH3區。8.權利要求1-6中任一項的體外方法，其中所述第一抗體包含非IgG4同種型的CH3區，其中該CH3序列不包含或者已被修飾而不包含任何如下所述的氨基酸殘基所述氨基酸殘基可參與和包含相同的CH3區氨基酸序列的其它肽形成二硫鍵或者共價或穩定非共價重鏈間鍵。9.權利要求8的體外方法，其中所述CH3區具有如SEQIDNO:19所示的序列，其中該CH3區已被修飾從而發生了一種或多種如下的氨基酸替換238位的Arg(R)已被Gln(Q)取代；239位的Asp(D)已被Glu(E)取代；292位的Lys(K)已被Arg(R)取代；302位的Gln(Q)已被Glu(E)取代；和328位的Pro(P)已被Leu(L)取代。10.權利要求9的體外方法，其中292位的Lys(K)已被Arg(R)取代。11.權利要求1-6或8中任一項的體外方法，其中所述CH3區具有如SEQIDNO19所示的序列，但是其中292位的Lys(K)已被Tyr(W)或Phe(F)取代。12.權利要求8的體外方法，其中所述CH3區具有如SEQIDNO:20所示的序列，其中該Ch3已區被修飾從而發生了一種或多種如下的氨基酸替換234位的Arg(R)已被Gln(Q)取代；276位的Met(M)已被Val(V)取代；288位的Lys(K)已被Arg(R)取代；298位的Gln(Q)已被Glu(E)取代；和324位的Pro(P)已被Leu(L)取代。13.權利要求12的體外方法，其中234位的Arg(R)已被Gln(Q)取代。14.權利要求12的體外方法，其中234位的Arg(R)已被Gln(Q)取代；且324位的Pro(P)已被Leu(L)取代。15.權利要求12的體外方法，其中發生了全部5種取代。16.權利要求8的體外方法，其中所述CH3區具有如SEQIDNO:21所示的序列，其中該CH3區已被修飾從而發生了一種或多種如下的氨基酸替換285位的Arg(R)已被Gln(Q)取代；314位的Ser(S)已被Asn(N)取代；322位的Asn(N)已被Lys(K)取代；327位的Met(M)已被Val(V)取代；339位的Lys(K)已被Arg(R)取代；349位的Gln(Q)已被Glu(E)取代；352位的Ile(I)已被Val(V)取代；365位的Arg(R)已被His(H)取代；366位的Phe(F)已被Tyr(Y)取代；和375位的Pro(P)已被Leu(L)取代。17.權利要求16的體外方法，其中285位的Arg(R)已被Gln(Q)取代。18.權利要求16的體外方法，其中285位的Arg(R)已被Gln(Q)取代；和375位的Pro(P)已被Leu(L)取代。19.權利要求16的體外方法，其中發生了全部10種取代。20.權利要求1、3-7中任一項的體外方法，其中所述第一抗體是IgG4抗體。21.前述權利要求中任一項的體外方法，其中所述第二抗體在核心鉸鏈區中包含CPPC序列。22.權利要求1-20中任一項的體外方法，其中所述第二抗體包含IgG4-樣核心鉸鏈區。23.權利要求1-20或22中任一項的體外方法，其中所述第二抗體是在核心鉸鏈區中包含CX1X2C序列的抗體，其中X1和X2可以是任何氨基酸，但X1和X2不能都是脯氨酸。24.權利要求23的體外方法，其中所述第二抗體是在核心鉸鏈區中包含CX3PC或CPX3C序列的抗體，其中X3可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸。25.權利要求23的體外方法，其中所述第二抗體是在核心鉸鏈區中包含CSPC、CPSC、CRPC或CPRC序列的抗體。26.前述權利要求中任一項的體外方法，其中所述第二抗體包含IgG4CH3區。27.權利要求1-25中任一項的體外方法，其中所述第二抗體包含非IgG4同種型的CH3區，其中該CH3序列不包含或者已被修飾而不包含任何如下所述的氨基酸殘基所述氨基酸殘基可參與和包含相同的CH3區氨基酸序列的其它肽形成二硫鍵或者共價或穩定非共價重鏈間鍵。28.權利要求27的體外方法，其中所述CH3區具有如SEQIDNO19所示的序列，其中該CH3區已被修飾從而發生了一種或多種如下的氨基酸替換238位的Arg(R)已被Gln(Q)取代；239位的Asp(D)已被Glu(E)取代；292位的Lys(K)已被Arg(R)取代；302位的Gln(Q)已被Glu(E)取代；和328位的Pro(P)已被Leu(L)取代。29.權利要求28的體外方法，其中292位的Lys(K)已被Arg(R)取代。30.權利要求21-27中任一項的體外方法，其中所述CH3區具有如SEQIDNO19所示的序列，但是其中292位的Lys(K)已被Tyr(W)或Phe(F)取代。31.權利要求27的體外方法，其中所述CH3區具有如SEQIDNO:20所示的序列，其中該CH3區已被修飾從而發生了一種或多種如下的氨基酸替換234位的Arg(R)已被Gln(Q)取代；276位的Met(M)已被Val(V)取代；288位的Lys(K)已被Arg(R)取代；298位的Gln(Q)已被Glu(E)取代；和324位的Pro(P)已被Leu(L)取代。32.權利要求31的體外方法，其中234位的Arg(R)已被Gln(Q)取代。33.權利要求31的體外方法，其中234位的Arg(R)已被Gln(Q)取代；且324位的Pro(P)已被Leu(L)取代。34.權利要求31的體外方法，其中發生了全部5種取代。35.權利要求27的體外方法，其中所述CH3區具有如SEQIDNO21所示的序列，其中該CH3區已被修飾，從而發生了一種或多種如下的氨基酸替換285位的Arg(R)已被Gln(Q)取代；314位的Ser(S)已被Asn(N)取代；322位的Asn(N)已被Lys(K)取代；327位的Met(M)已被Val(V)取代；339位的Lys(K)已被Arg(R)取代；349位的Gln(Q)已被Glu(E)取代；352位的Ile(I)已被Val(V)取代；365位的Arg(R)已被His(H)取代；366位的Phe(F)已被Tyr(Y)取代；和375位的Pro(P)已被Leu(L)取代。36.權利要求35的體外方法，其中285位的Arg(R)已被Gln(Q)取代。37.權利要求35的體外方法，其中285位的Arg(R)已被Gln(Q)取代；和375位的Pro(P)已被Leu(L)取代。38.權利要求35的體外方法，其中發生了全部10種取代。39.權利要求1-20或22-26中任一項的體外方法，其中所述第二抗體是IgG4抗體。40.權利要求1或2的體外方法，其中所述第一抗體在核心鉸鏈區中包含CPPC，并包含IgG4-樣CH3區；且其中所述第二抗體在核心鉸鏈區中包含CPPC，并包含IgG4_樣CH3區。41.前述權利要求中任一項的體外方法，其中所述第一抗體和/或所述第二抗體是人類抗體。42.前述權利要求中任一項的體外方法，其中對步驟c)中的條件進行選擇，使核心鉸鏈區之外不發生顯著的二硫橋還原或異構化。43.前述權利要求中任一項的體外方法，其中步驟c)包括添加還原劑。44.前述權利要求中任一項的體外方法，其中步驟c)包括添加從下組選出的作用劑谷胱甘肽、L-半胱氨酸、二硫蘇糖醇、β-巰基乙醇和半胱胺。45.權利要求43或44的體外方法，其中所述作用劑的濃度使得步驟c)中產生的溶液的氧化還原勢等于或者還原性更高于在實施例31所述的條件下1μM谷胱甘肽產生的氧化還原勢，例如等于或者還原性更高于由10μM谷胱甘肽產生的氧化還原勢，例如等于或者還原性更高于由50μM谷胱甘肽產生的氧化還原勢，例如等于或者還原性更高于由0.ImM谷胱甘肽產生的氧化還原勢。46.權利要求43或44的體外方法，其中所述作用劑的濃度使得步驟c)中產生的溶液的氧化還原勢等于或者還原性更高于在實施例35所述的條件下由ImM谷胱甘肽產生的氧化還原勢，例如等于或者還原性更高于由2mM谷胱甘肽產生的氧化還原勢，例如等于或者還原性更高于由4mM谷胱甘肽產生的氧化還原勢，例如等于或者還原性更高于由6mM谷胱甘肽產生的氧化還原勢，例如等于或者還原性更高于由8mM谷胱甘肽產生的氧化還原勢，例如等于或者還原性更高于由IOmM谷胱甘肽產生的氧化還原勢。47.權利要求45或46的體外方法，其中所述作用劑的濃度使得步驟c)中產生的溶液的氧化還原勢等于或者還原性低于于由IM谷胱甘肽產生的氧化還原勢，例如等于或者還原性低于由IOOmM谷胱甘肽產生的氧化還原勢，等于或者還原性低于由15mM谷胱甘肽產生的氧化還原勢。48.前述權利要求中任一項的體外方法，其中步驟c)包括在還原型谷胱甘肽的存在下在20°C或更高的溫度下，例如在37°C下，溫育所述抗體至少1小時，例如至少2小時，例如至少5小時，例如至少10小時。49.前述權利要求中任一項的體外方法，其中在所得的組合物中少于10%，例如少于5%，例如少于2%，例如少于的抗體分子處于聚集狀態。50.前述權利要求中任一項的體外方法，還包括使步驟c)中獲得的組合物處于非還原性條件下，以便停止進一步的半分子交換的步驟。51.前述權利要求中任一項的體外方法，還包括使雙特異性抗體穩定化的步驟，優選地采用選自下組的方法a)鉸鏈區中半胱氨酸的化學交聯，b)半分子上碳水化合物側鏈的化學交聯，和c)CH3區中不對稱地引入的半胱氨酸的交聯。52.前述權利要求中任一項的體外方法，還包括純化雙特異性抗體的步驟，優選地在非還原性條件下實施。53.前述權利要求中任一項的體外方法，還包括將所得的雙特異性抗體配制成用于治療應用的藥物組合物的步驟。54.前述權利要求中任一項的體外方法，其中第一抗體具有針對腫瘤細胞或腫瘤細胞蛋白的結合特異性，例如針對erbBl、erbB2、erbB3、erbB4、MUC-1、CD19、CD20、CD38、CD4或CXCR5或針對⑶79a或⑶79b的結合特異性。55.權利要求54的體外方法，其中第二抗體具有針對腫瘤細胞或腫瘤細胞蛋白的結合特異性，例如針對erbBl、erbB2、erbB3、erbB4、MUC-UCD19、CD20、CD4或CXCR5的結合特異性。56.權利要求54的體外方法，其中第一抗體具有針對erbBl的結合特異性，且第二抗體具有針對erbB2的結合特異性。57.權利要求54的體外方法，其中第一抗體具有針對CD19的結合特異性，且第二抗體具有針對CD20的結合特異性。58.權利要求54的體外方法，其中第一抗體具有針對CD4的結合特異性，且第二抗體具有針對CXCR5的結合特異性。59.權利要求54的體外方法，其中第一抗體具有針對CD38的結合特異性，且第二抗體具有針對CD34的結合特異性。60.權利要求1-53中任一項的體外方法，其中第一抗體具有針對病原微生物的結合特異性。61.權利要求54或60的體外方法，其中第二抗體具有針對效應細胞蛋白質的結合特異性，例如針對⑶3、⑶25、⑶28、⑶16、⑶89、⑶32或OTl的結合特異性。62.權利要求54的體外方法，其中第二抗體具有針對化療劑的結合特異性。63.權利要求54的體外方法，其中第二抗體具有針對血液蛋白例如血清白蛋白，或針對腦蛋白例如鐵傳遞蛋白，或針對肝蛋白的結合特異性。64.權利要求54的體外方法，其中第二抗體具有針對參與凝血的蛋白質例如組織因子的結合特異性。65.前述權利要求中任一項的體外方法，其中第一和/或第二抗體連接于從下組選出的化合物細胞毒劑；放射性同位素；前體藥物或藥物，例如紫杉烷；細胞因子；趨化因子和補體，例如Clq。66.一種用于產生雙特異性抗體的體外方法，所述方法包括如下步驟a)提供具有第一結合特異性的第一抗體，其中所述第一抗體包含核心鉸鏈區中的CPPC序列以及IgG4CH3區，b)提供具有不同于所述第一結合特異性的第二結合特異性的第二抗體，其中所述第二抗體包含核心鉸鏈區中的CPPC序列以及IgG4CH3區，c)在允許核心鉸鏈區中的半胱氨酸進行二硫鍵異構化的還原條件下共同溫育所述第一和第二抗體，和d)獲得雙特異性抗體。67.權利要求66的體外方法，其中在步驟c)中已添加還原劑，其中該還原劑的濃度使得步驟c)中產生的溶液的氧化還原勢等于或者還原性更高于在實施例35所述的條件下由ImM谷胱甘肽產生的氧化還原勢，例如等于或者還原性更高于由2mM谷胱甘肽產生的氧化還原勢，例如等于或者還原性更高于由4mM谷胱甘肽產生的氧化還原勢，例如等于或者還原性更高于由6mM谷胱甘肽產生的氧化還原勢，例如例如等于或者還原性更高于由SmM谷胱甘肽產生的氧化還原勢，例如等于或者還原性更高于由IOmM谷胱甘肽產生的氧化還原勢。68.一種分離的雙特異性抗體，其是通過前述任一項權利要求的方法獲得的，或者可以通過前述任一項權利要求的方法獲得。69.一種分離的雙特異性抗體，其包括兩個IgG4-樣CH3區。70.權利要求69的雙特異性抗體，其中該抗體在核心鉸鏈區中包含一個或兩個CPPC序列。71.權利要求69的雙特異性抗體，其中該抗體在核心鉸鏈區中包含一個或兩個CX1X2C序列，其中X1和X2可以是任何氨基酸，但X1和X2不能都是脯氨酸。72.權利要求69的雙特異性抗體，其中該抗體在核心鉸鏈區中包含一個或兩個CX3PC或CPX3C序列，其中X3可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸。73.權利要求69的雙特異性抗體，其中該抗體在核心鉸鏈區中包含一個或兩個CSPC、CPSC、CRPC或(PRC序列。74.權利要求69-73中任一項的雙特異性抗體，其中第一和/或第二CH3區是非IgG4同種型的，其中該CH3序列不包含或者已被修飾而不包含任何如下所述的氨基酸殘基所述氨基酸殘基可參與和包含相同的CH3區氨基酸序列的其它肽形成二硫鍵或者共價或穩定非共價重鏈間鍵。75.權利要求74的雙特異性抗體，其中第一和/或第二CH3區具有如SEQIDNO19所示的序列，其中該CH3區已被修飾，從而發生了一種或多種如下的氨基酸替換238位的Arg(R)已被Gln(Q)取代；239位的Asp(D)已被Glu(E)取代；292位的Lys(K)已被Arg(R)取代；302位的Gln(Q)已被Glu(E)取代；和328位的Pro(P)已被Leu(L)取代。76.權利要求75的雙特異性抗體，其中第一和/或第二CH3區具有如SEQIDNO19所示的序列，但是其中292位的Lys(K)已被Arg(R)取代。77.權利要求74的雙特異性抗體，其中第一和/或第二CH3區具有如SEQIDNO19所示的序列，但是其中292位的Lys(K)已被Tyr(W)或Phe(F)取代。78.權利要求74的雙特異性抗體，其中第一和/或第二CH3區具有如SEQIDNO20所示的序列，其中該(^3區已被修飾從而發生了一種或多種如下的氨基酸替換234位的Arg(R)已被Gln(Q)取代；276位的Met(M)已被Val(V)取代；288位的Lys(K)已被Arg(R)取代；298位的Gln(Q)已被Glu(E)取代；和324位的Pro(P)已被Leu(L)取代。79.權利要求74的雙特異性抗體，其中234位的Arg(R)已被Gln(Q)取代。80.權利要求74的雙特異性抗體，其中234位的Arg(R)已被Gln(Q)取代；且324位的Pro(P)已被Leu(L)取代。81.權利要求74的雙特異性抗體，其中第一和/或第二CH3區具有如SEQIDNO21所示的序列，其中該Ch3區已被修飾，從而發生了一種或多種如下的氨基酸替換285位的Arg(R)已被Gln(Q)取代；314位的Ser(S)已被Asn(N)取代；322位的Asn(N)已被Lys(K)取代；327位的Met(M)已被Val(V)取代；339位的Lys(K)已被Arg(R)取代；349位的Gln(Q)已被Glu(E)取代；352位的lie(I)已被Val(V)取代；365位的Arg(R)已被His(H)取代；366位的Phe(F)已被Tyr(Y)取代；且375位的Pro(P)已被Leu(L)取代。82.權利要求81的雙特異性抗體，其中285位的Arg(R)已被Gln(Q)取代。83.權利要求81的雙特異性抗體，其中285位的Arg(R)已被Gln(Q)取代；且375位的Pro(P)已被Leu(L)取代。84.權利要求69-73中任一項的雙特異性抗體，其中第一和/或第二CH3區是IgG4CH3區。85.權利要求68-84中任一項的雙特異性抗體，其中核心鉸鏈區和CH3區外部的序列屬于選自下組的同種型:IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。86.一種藥物組合物，其包括權利要求69-85中任一項的雙特異性抗體。87.權利要求86的組合物，其用作藥物。88.權利要求86的組合物，其用作用于治療癌癥的藥物。89.通過權利要求1-67中任一項的方法獲得的或者可以通過權利要求1-67中任一項的方法獲得的雙特異性抗體或者權利要求68-85中任一項的雙特異性抗體在制備用于治療癌癥的藥物中的用途。90.一種用于選擇具有期望性質的雙特異性抗體的方法，所述方法包括如下步驟a)提供一系列抗體，其中每種抗體具有不同的靶標特異性，并且其中每種抗體包含IgG4-樣CH3區，b)在還原條件下將所述系列中的每種抗體與所述系列中的另一種抗體進行溫育，從而產生一系列的抗體混合物，其中每種混合物包含不同的雙特異性抗體，c)測定所得的一系列抗體混合物的給定的期望性質，和d)選擇具有所述期望性質的雙特異性抗體混合物。91.權利要求90的方法，其中步驟b)具有權利要求2-67中對步驟c)所進一步限定的一種或多種性質。92.權利要求90或91的方法，其中所述期望性質是腫瘤細胞殺傷。全文摘要本發明涉及產生雙特異性抗體的體外方法，包括如下步驟a)提供具有第一結合特異性的第一抗體，其中所述第一抗體包含IgG4-樣CH3區，b)提供具有不同于所述第一結合特異性的第二結合特異性的第二抗體，其中所述第二抗體包含IgG4-樣CH3區，c)在允許核心鉸鏈區的半胱氨酸發生二硫鍵異構化的還原條件下共同溫育所述第一和第二抗體，和d)獲得雙特異性抗體。本發明進一步涉及通過本發明的方法獲得的雙特異性抗體。文檔編號C07K16/46GK101802015SQ200880018280公開日2010年8月11日申請日期2008年3月28日優先權日2007年3月29日發明者保羅·帕倫,湯姆·文克,簡·V·D·溫克爾,羅布·阿伯斯,賈尼·舒爾曼,阿蘭·F·拉布里金,馬里金·V·D·N·科爾夫肖滕申請人:根馬布股份公司