專利名稱：：含一個結晶水的化合物st-246及其晶體與制備方法
技術領域：
：本發明涉及一種含一個結晶水的化合物ST-246及其晶體與制備方法。
背景技術：
：ST-246是美國Siga公司研究的一種抗正痘病毒化合物(YangG,etal.JVirol.2005,79(20):13139-49.)，該藥物在體外可以抑制正痘病毒生長，在動物模型中能夠有效治療多種正痘病毒感染(QuenelleDC,etal.AntimicrobAgentsChemother.2007,51(2):689-95;SbranaE,etal.AmJTropMedHyg.2007，76(4):768_73.)，安全且耐受性較好。目前該藥已初步完成I期臨床試驗。ST-246的結構式如圖1所示。目前的制備方法主要存在如下缺點l)不能有效降低最終產品中雜質的含量，尤其是外式異構體的含量；2)最終產品中含有0.25個結晶水，只能在嚴格不含水的溶劑中結晶得到，制備條件苛刻，也較易吸濕。專利(US2008/0004452)報道，含0.235個結晶水的ST-246放置于25°C、60%濕度的環境中兩個月，DSC及TGA分析表明ST-246含有結合的水及自由水。
發明內容本發明的目的是提供一種含一個結晶水的化合物ST-246,其名稱為ST-246*H20。ST-246*仏0的結構式如下式所示ST-246*H20的結構式ST-246*仏0可按照如下方法制備得到的:將托烷酸酐(4，4a，5，5a，6，6a-六氫-4,6-乙氧-1氫-環丙[f]異苯并呋喃-l，3-(3a氫)-二酮)和對-三氟甲基苯甲酰肼在有機堿及有機溶劑存在下，氮氣保護下加熱回流，得到ST-246"H20。上述方法中，所述有機堿為二異丙基乙胺。所述有機溶劑為無水乙醇或異丙醇。上述ST-246*H20的單斜晶系也屬于本發明的保護范圍。所述單斜晶系的空間群為C2/c，晶胞參數a=28.724(2)，b=10.533(1)，c=12.902(l)A，P=112.18(1)。;晶胞體積V二3614.7(6)A3，晶胞內分子數Z二8。上述ST-246*H20的單斜晶系是按照如下方法制備得到的將上述ST-246*H20在結晶溶劑中加熱回流使之溶解，將反應液倒入蒸餾水中，將得到的溶液在0-4°。條件下冷卻l一8h，過濾、有機溶劑洗滌、45—7(TC條件下干燥4一48h，得到ST-246H20的單斜晶系。上述方法中，所述結晶溶劑為異丙醇、乙酸乙酯或體積百分含量為90%-100%的乙醇水溶液。本發明的ST-246H20的單斜晶系可以作為抗痘類病毒藥物的活性成分，添加藥劑學可接受的輔料可制成針劑、口服劑、直腸體給藥劑或皮膚吸收劑，用于治療人及動物的正痘病毒感染。本發明的ST-246*H20具有結構穩定、結晶容易，在含濕或干燥氣氛中穩定，不易失去結晶水。由于ST-246"仏0幾乎不溶于水(溶解度僅約20微克/毫升)，制劑需微粉化，ST-246，H20微粉化后不易成團，大大方便了制劑。ST-246*H20放置在濕度為75%(環境溫度25-30°C)的密封容器中兩個月，結晶水幾乎不增加。此外，ST-246，H20的結晶條件易于控制，在含90%(體積百分含量)乙醇的溶劑中或在乙酸乙酯等溶劑中均形成ST-246，H20的單斜晶系，十分便于規模化生產。用本發明的方法可以獲得純度在99.5W以上的ST-246，H20，其外式異構體低于0.2%，且總產率高于現有文獻報道的方法。圖1為ST-246的結構式圖2為ST-246的合成路線圖3為ST-246*H20晶體的熱重分析圖圖4為ST-246*H20晶體的相對構型圖圖5為ST-246'H20晶體的橢球圖圖6為ST-246*H20晶體沿b軸方向的晶胞堆積圖圖7為ST-246*H20晶體的微粉顆粒圖具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明做進一步說明。實施例l、ST-246*&0及其晶體的制備一、托垸酸酐的合成將1000g環庚三烯溶液(Sigma公司，質量百分含量90%)和1104g順丁烯二酸酐(北京化工廠，分析純)溶于1400ml二甲苯中，氮氣保護下加熱回流10小時。(TC冷卻、過濾，石油醚(沸程60-90°C)洗滌三次，每次500ml，烘干，得到1586g淡黃色托烷酸酐(4，4a，5，5a，6,6a-六氫-4，6_乙氧-1氫-環丙[f]異苯并呋喃-l，3-(3a氫)-二酮)粗品固體。熔點9395。C，產率81.5%。將上述1586g托垸酸酐粗品用5000ml無水乙醇(北京化工廠，分析純)加熱溶解，溶解液先室溫冷卻3個小時，再放置到0。C冷卻3個小時后過濾。用無水乙醇洗滌兩次，每次500ml，干燥，得到白色針狀結晶(托垸酸酐)。熔點94-96°C，收率83.5%。二、對-三氟甲基苯甲酰肼的制備將1000g對-三氟甲基苯甲酸甲酯(大連金州通利化工有限公司)溶于700ml無水乙醇(分析純)中，攪拌下滴加433g水合肼溶液(北京醫藥集團，質量百分含量85%)。滴加完畢后加熱回流一個小時，將反應液傾入到2500ml冰水中，析出白色固體。過濾，水洗三次，干燥，得到867g白色對-三氟甲基苯甲酰肼粗品固體。產率86.7%,熔點112114r。將上述867g對-三氟甲基苯甲酰肼粗品加入到1050ml乙酸乙酯中，加熱回流溶解，然后加入1000ml石油醚(沸程60-90°C)，室溫冷卻3小時后再放置到0°C冷卻3個小時。過濾，用石油醚(沸程60-9(TC)洗兩次，每次400ml。烘干，得到749g白色片狀對-三氟甲基苯甲酰肼固體。收率86.4%，熔點113-115°C。三、ST-246，H20晶體的制備1、ST-246*1120的制備將787g托烷酸酐和887g對-三氟甲基苯甲酰肼溶于5940ml無水乙醇中，氮氣保護下滴加92ml二異丙基乙胺(DIEA)，加熱回流5小時，停止加熱；向上述反應液中加入600ml水，將得到的溶液冷卻到室溫(25°C)，過濾，用90%(體積百分含量)的乙醇水溶液洗滌三次，每次500ml，50-7(TC干燥4-12小時，得到1403g白色塊狀固體。產率89.5%，熔點195197°C。將上述得到的白色塊狀固體分別用如下兩種方法進行結晶1)以無水乙醇作為結晶溶劑5將上述1403g白色塊狀固體在4950ml無水乙醇中加熱回流，完全溶解后，加入600ml6(TC的溫水，此時反應液的溫度為80°C。反應液室溫(25°C)冷卻3小時后，再0'C冷卻4個小時。過濾，90%(體積百分含量)的乙醇水溶液洗滌三次，每次500ml。50-60。C下烘6個小時，得1350g白色塊狀晶體(ST-246'H20晶體)。收率96.2%，熔點195-196。C。2)以乙酸乙酯和正己烷組成的混合液作為結晶溶劑從上述得到的1403g白色塊狀固體中取5g放入單口瓶中，加入35ml乙酸乙酯，加熱回流使之溶解，在反應液中再加入20ml正己烷，反應液充分混勻，室溫下冷卻半個小時，再放入4"C冰箱中冷卻l個小時。過濾，正己烷洗滌兩次，每次10ml。50-6(TC下烘6個小時，得到4.3g白色塊狀晶體(ST-246*H20晶體)。2、ST-246*H20晶體的HPLC檢測、結構鑒定及結晶水含量測定從步驟l獲得的1350g白色塊狀晶體取樣進行HPLC檢測。結果表明，獲得的1350g白色塊狀晶體的純度大于99.5%，外式異構體含量小于0.2%。該HPLC條件如下UnimicroTechnologiesHPLC，Kromasil-C18-5y色譜柱。流動相A液H20+0.1%TFA;B液CH3CN+0.1%TFA。用A液和B液進行如下洗脫梯度0-25min，用由40%(體積百分含量)的B和6(B(體積百分含量)的A組成的洗脫液進行洗脫；25-28min，用由80%(體積百分含量)的B和20%(體積百分含量)的A組成的洗脫液進行洗脫，28-30min，用100%(體積百分含量)的B液進行洗脫。流速l.Oml/rain;檢測波長214nm。從步驟l獲得的1350g白色塊狀晶體取樣進行結構鑒定，元素分析表明，上述獲得的ST-246*H20晶體的分子式為C19H15F3N203.H20,計算值C，57.87%;H，4.35%;N,7,10%。分析值C，57.71%;H，4.23%;N，6.93%。'H-麵R(VarianUnityINOVA600MHz,d6-DMS0):S11.37，11.10(2brs,1H)，8.08(d，,7.8Hz,2H),7.91(d，戶7.8Hz，2H)，5.79(m,2H)，3.34(m,4H)，1.17(m，2H)，0.25(d，J=6Hz，H)，0.05(m，1H)。Ms((MicromassZapSpec，M+H):377.2。IR(Bio-RadFTS-65A，KBr壓片，3465.8，3402.7，3171.3，3075.2，3007.0，2954.9，2851.5，1790.7，1716.5，1662.5，1563.6,1329.5，1291.2，1192.7，1163.4,1132.4，1062.3，905.1，884.2，856.4，735.4cm—1)。從步驟1獲得的1350g白色塊狀晶體取樣通過熱分解方法(TGA)分析上述步驟2獲得的ST-246*&0晶體的結晶水含量。儀器PE公司DiamondI，溫度范圍630.00-600.00°C,加熱速度10°C/min。結果發現，從9(TC開始到180。C結束，ST-246*&0晶體的結晶水全部失去，重量減少4.61%，該數值與含有一個結晶水的ST-246中水的含量為4.57%相符。具體熱重分析圖如圖3所示。熱分析方法(儀器PE公司，DSCVII型)測定吸熱曲線。溫度范圍50。C-220'C，升溫速度10°C/min。結果發現，在196.2-196.3。C出現一個很大的尖峰，為其熔點。此外在115-175。C之間有部分吸熱，并在134。C及167X:處有小的吸熱峰。三批樣品的DSC曲線基本相同。3、ST-246*1120晶體結構測定(1)衍射測定上述步驟1獲得的ST-246'H20晶體呈白色塊狀，衍射分析所用晶體尺寸為0.20X0.40X0.50mm，屬單斜晶系。ST-246'H20的空間群為C2/c，晶胞參數a=28.724(2)，b=10.533(1)，c=12.902(l)A，e=112.18(1)°。晶胞體積V=3614.7(6)A3，晶胞內分子數Z二8。用MACDIP-2030K面探測儀收集衍射強度數據，敗^z輻射，石墨單色器，準直管(J)-0.90mm，晶體與IP板距離為100mm，管壓50kV，管流50mA，。掃描，最大26角為50.0°，掃描范圍為0-180°，回擺角度為6°，間隔為6°，掃描速度為0.9。/min，每個畫面掃描l次，總計攝取30幅圖象，獨立衍射點為3060個，可觀察點(lFl2》2clFl2)為2734個，數據完整度為91.6%。(2)結構計算在微機上用直接法(Sir2004)解析晶體結構，從E圖上獲得26個非氫原子位置，交迭使用最小二乘法和差值Fourier法獲得其它非氫原子位置，使用最小二乘法修正結構參數和判別原子種類，用幾何計算法和差值Fourier法獲得全部氫原子位置，最終可靠因子R^0.0671，wR2=0.1842，S=1.044。最終確定不對稱單位化學計量式為C19H15F3N203*H20，計算分子量為394.35，晶體密度為1.449g/cm3。ST-246'H20晶體分子的相對構型如圖4所示，ST-246*H20晶體的橢球圖如圖5所示，ST-246*H20晶體分子沿b軸方向的晶胞堆積圖如圖6所示。ST-246*H20晶體的原子坐標及等價溫度因子的測定結果如表1所示，ST-246*H20晶體成鍵原子間的鍵長及鍵角值的測定結果如表2所示。(3)結果分析衍射測定和結構計算的結果表明，上述步驟l獲得的ST-246'H20晶體為異喂哚基取代的苯甲酰胺類化合物，化學命名為一水4-三氟甲基-N-(3，3a，4,4a，5，5a，6，6a-八氫-1，3-二氧-4，6-乙氧環丙[f]卩引哚-2(l氫)-基)-苯甲酰胺，其英文名稱為4-trifluoromethyl-N-(3,3a,4,4a,5,5a，6,6a-octahydro-l,3-dioxo-4,6-ethenocycloprop[f]isoindol-2(lH)-yl)-benzamide。分子骨架由A、B、C、D、E5個環組成，其中六元環A(C2，C3、C4，C5，C6，G)和六元環C(C2,C3,C9，d。，C6，C》均為船式構象，五元環B和苯環D均為平面結構。A/B環和B/C環均呈順式連接，各環間二面角值為A/B:86.3°，A/C:60.6°，B/C:25.8。，C/E:30.6°。以G，C3，C6，C7所在的平面為參考平面，五元環B向下，故化合物的結構為內式。晶態下分子排列屬第二類空間群，故不具有旋光活性。分子內存在的氫鍵聯系為(Xw…03:2.787A，分子間存在的氫鍵聯系為化…0,"x，-y，z+1/2):2.77lA，(V"C^(-x+l/2，-y+l/2，-z+1):2.882A。晶態下分子以分子內、分子間氫鍵及范德華力維系其在空間的穩定排列。表l原子坐標及等價溫度因子xyzU(eq)F(l)5887(1)2119(2)11077(2)94(1)F(2)5467(1)3531(2)11479(2)96(1)F(3)5527(1)1655(3)12160(2)97(1)0(1)2586(1)2333(1)6405(1)56(1)0(2)2944(1)-1890(2)6624(2)68(1)0(3)3693(1)1229(2)6469(1)75(1)N(l)2861(1)273(2)6653(1)43(1)N(2)3300(1)506(2)7568(1)46(1)C(l)2525(1)1226(2)6126(2)42(1)C(2)2094(1)634(2)5187(2)44(1)C(3)1583(1)904(2)5299(2)50(1)C(4)1620(1)338(2)6388(2)54(1)C(5)1714(1)-891(2)6486(2)57(1)C(6)1768(1)-1504(2)5490(2)55(1)C(7)2203(1)-804(2)5281(2)47(1)C(8)2705(1)-947(2)6240(2)48(1)C(9)1203(1)184(2)4310(2)59(1)C(IO)1307(1)-1223(2)4425(2)63(1)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>c:2)-C(3)-H(3A)111.8C(ll)-c(io)-C(6)121.9(2)c:5)-C(4)-C(3)114.9(2)C(9)_c(io)-C(6)110.4(2)c:5)-C(4)-H(4A)122.5C(ll)-c(io)-H(IOA)117.0c:3)-C(4)-H(4A)122.5C(9)_c(io)-H(IOA)117.0c:4)-C(5)-C(6)115.1(2)C(6)-c(io)-H(IOA)117.0c:4)-C(5)-H(5A)122.4C(9)_C(ll)-C(IO)60.2(2)c〔6)_C(5)-H(5A)122.4C(9)-C(ll)-H(llA)117.8c:5)-C(6)-C(IO)110.6(2)c(io)-C(ll)-H(llA)117.8c:5)-C(6)-C(7)107.1(2)C(9)--cm)--H(llB)117.8c:10)-C(11)-H(11B)117.8H:11A)-C(11)-H(11B)114.90:3)-C(12)-N(2)122.7(2)0:3)-C(12)-C(13)121.3(2)N:2)-C(12)-C(13)115.9(2)c<:18)-C(13)-C(14)118.9(2)c:18)-C(13)-C(12)124.2(2)c:14)-C(13)-C(12)116.9(2)c:15)-C(14)-C(13)120.3(2)c:15)-C(14)-H(14A)119.8c:13)-C(14)-H(14A)119,8c:16)-C(15)-C(14)120.2(2)c〔16)-C(15)-H(15A)119,9c〔14)-C(15)-H(15A)119.9c(15)-C(16)-C(17)120.0(2)c(15)-C(16)-C(19)119.2(2)c(17)-C(16)-C(19)120.7(2)c(16)-C(17)-C(18)120.1(2)c(16)-C(17)-H(17A)119.9c(18)-C(17)-H(17A)119.9c(13)-C(18)-C(17)120.5(2)c(13)-C(18)-H(18A)119.7c(17)-C(18)-H(18A)119.7F(2)-C(19)-F(3)108.6(3)F(2)-C(19)-F(l)105.2(2)F(3)_C(19)-F(l)103.9(2)F(2)-C(19)-C(16)112.5(2)F(3)_C(19)-C(16)113.2(2)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實施例2、ST-246*H20晶體的吸濕性試驗將上述步驟l中獲得的ST-246，H20晶體進行熱分解實驗，結果表明，乙酸乙酯和正己烷組成的混合結晶溶劑結晶的ST-246*1W)晶體(溶劑中可能含有微量水分)及90%(體積百分含量)乙醇水溶液重結晶的產物中均含一個結晶水(42。C干燥48h后)，結晶水含量分別為4.50y。及4.6W。分別取上述兩種溶劑重結晶的ST-246H20晶體2.0073g及1.9759g，放置于25-30°C、75%濕度的密封容器中2個月。2個月后分別測得上述兩種溶劑重結晶的ST-246*H20晶體的重量分別為2.0081g及1.9768g，與2個月前相比重量基本不變，說明ST-246*H20晶體結構穩定，不易吸濕。將上述兩種溶劑重結晶的ST-246，H20晶體放在IO(TC的烘箱中干燥4小時。HPLC分析表明，IO(TC下干燥4小時ST-246*H20晶體僅失去結晶水，熱分解法測定結果表明ST-246*H20失去部分結晶水，成為含有0.2-0.5個結晶水的ST-246(名稱為ST-246'nH20)。然后將ST-246*1^20再在25°(:、75%濕度的條件下放置12天和30天，分別觀察其吸濕情況，具體測定結果如表3所示。表3ST-246*11仏0的吸濕情況變化<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>結果表明，兩者在25。C、75%濕度的條件下放置一個月后吸水量較大，說明結晶水小于1分子的ST-246較易吸濕。上述結果與專利報道(US2008/0004452)的結果相似(含0.235個結晶水的ST-246放置于25'C、60%濕度的環境中兩個月，DSC及TGA分析表明ST-246含有結合的水及自由水。由于ST-246，仏0晶體在水中的溶解度很小，僅約為20mg/ml，實際應用時需微粉化以提高生物利用度。將上述實施例1獲得的ST-246*H20晶體進行微粉化(微粉直徑低于5微米)，粉碎條件JFC-5氣流粉碎機(北京航空航天大學)，轉速2900rpm，工作壓力0.7MPa。ST-246'H20晶體的微粉顆粒如圖7所示。結果表明，上述實施例1獲得的ST-246H20晶體粉碎后吸濕少不成團，性質穩定，有利于保存與制劑，該性質大大方便了制劑，也避免了含0.25個結晶水的ST-246制備的苛刻無水條件。將上述微粉化的ST-246*H20在20-3(TC密封條件下保存，放置4個月，結果未發現成團現象。實施例3、抗正痘病毒實驗將上述實施例1獲得的ST-246*H20晶體用DMSO溶解并配制成10mM的儲備液。實驗選用的病毒株為帶有GFP熒光標記的天壇株痘苗病毒(武漢大學保藏中心)，被感染的細胞為vero細胞(武漢大學保藏中心)，通過空斑和在熒光顯微鏡下觀測熒光強度和數量來確定上述實施例1獲得的ST-246*H20晶體的抑制病毒復制的活性，具體過程如下將Vero細胞以10,000個/孔的量接種至96孔板中，20h后吸出培養液，分別加入100uL纟5DMEM稀釋的、濃度分另U為10ixM、3uM、1uM、0.3yM、0.1wM、0.03uM、0.01liM和0.003uM的上述實施例1獲得的ST-246*H20晶體配成的溶液。然后再加入100uL經DMEM和10%(質量百分含量)FBS組成的混合溶液稀釋的帶有GFP熒光標記的天壇株痘苗病毒，使每個孔中病毒的量為IOOPFU，ST-246*H20晶體配成的溶液的終濃度為5uM、1.5uM、0.5uM、0.15uM、0.05uM、0.015UM、0.005uM和0.0015uM。37°C、5%0)2培養箱培養72小時后，倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光的表達情況并拍照。綠色熒光區域的相對面積用Image-proplusVersion5.0.1.11(MediaCybernetics,Inc)進行分析和定量。熒光面積(相對值)、細胞病變率(CPE)及抑制率結果如表4所示。13<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>權利要求1、式(I)所示的化合物式(I)。2、一種制備權利要求1所述化合物的方法，是將托烷酸酐和對-三氟甲基苯甲酰胼在有機堿及有機溶劑存在下，氮氣保護下加熱回流，反應液冷卻、過濾，得到權利要求l所述的化合物。3、根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述有機堿為二異丙基乙胺。4、根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述有機溶劑為無水乙醇或異丙醇。5、權利要求l所述化合物的單斜晶系。6、根據權利要求5所述的單斜晶系，其特征在于所述單斜晶系的空間群為C2/c，晶胞參數a=28.724(2)，b=10.533(1)，c=12.902(1)A，P=112.18(1)°;晶胞體積V=3614.7(6)A3，晶胞內分子數Z=8。7、一種制備權利要求5或6所述單斜晶系的方法，是將權利要求l所述的化合物在有機溶劑中加熱回流，將反應液倒入水中，將得到的溶液在0-4'C條件下冷卻l一8h、過濾，結晶溶劑洗滌、45—7(TC條件下干燥4一48h，得到權利要求5或6所述的單斜晶系。8、根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述有機溶劑為異丙醇、乙酸乙酯或體積百分含量為90%-100%的乙醇水溶液。9、以權利要求5或6所述的單斜晶系為活性成分制備的抗痘類病毒的藥物。全文摘要本發明公開了一種含一個結晶水的化合物ST-246，其名稱為ST-246·H₂O。ST-246·H₂O，是按照如下方法制備得到的將托烷酸酐和對-三氟甲基苯甲酰肼在有機堿及有機溶劑存在下，氮氣保護下加熱回流，反應液冷卻、過濾，得到ST-246·H₂O。本發明制備的ST-246·H₂O室溫下穩定、不易失去結晶水及吸濕，微粉化后不易結塊，利于提高生物利用度。可用于制備抗痘類病毒的藥物。文檔編號C07D209/56GK101445478SQ20081011868公開日2009年6月3日申請日期2008年8月22日優先權日2008年8月22日發明者戴秋云,潔胡,董銘心申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所