專利名稱：類黃酮二聚物及其制備方法和使用方法
技術領域：
本發明涉及降低基于P-糖蛋白的多藥耐藥性的化合物及方法，以及這 些化合物的合成。
背景技術：
癌癥化學治療中的藥物耐受性
多藥耐藥性(MDR)是癌癥化學治療中的主要問題。最好的特征性耐藥 機制是由將各種抗癌藥物泵出細胞、導致細胞內藥物累積量降低的藥物流 出轉運體——滲透性糖蛋白(P-gp)的過度表達所介導的機制。據信，藥物被 P-gp擠出是由構象改變介導的。抗P-gp的逆轉劑或調節劑的開發已吸引了 學術界禾口工業界的興趣。Tsuruo等[Overcoming of vincristine resistance in P388 leukemia in vivo and in vitro through enhanced cytotoxicity of vincristine and vinblastine by verapamil (Cancer Res 1981， 41， 1967-1972)]率先報道了維
拉帕米(一種鈣通道阻斷劑)可以通過抑制P-pg介導的藥物流出而逆轉耐 藥性。自那時起，有大量的體外數據表明P-gp導致的MDR可由某些化合 物有效調節，所述化合物包括右維拉帕米21、右尼古地平22、 PSC 833 (Resistance modification by PSC-833, a novel non國immunosuppressive cyclosporin. Eur J Cancer 1991, 27， i 639-1642)和VX-710 (BIRICODAR (VX-710; Incel): an effective chemosensitizer in neuroblastoma. Br J Cancer 1999， 80， 1190-1196)。雖然這些所謂的二代MDR調節劑顯示出一些振奮人
心的結果，但它們的使用受制于它們與抗癌藥物之間的不可預知的藥物代 謝動力學相互作用(MDR expression in normal tissues. Pharmacologic implications for the clinical use of P-glycoprotein inhibitors. Hematol OncolClinNorthAm 1995, 9, 319-336)。由構效關系和組合化學途徑開發出的第三 代MDR調節齊U包括zosuquidar LY335979、 tariquidar XR9576、 laniquidar R101933、吖啶酮甲酰胺GF 120918和帶有取代基的二芳基咪唑ONT-090， 這些調節劑最近正在進行臨床試驗評價。
因為類黃酮通常具有較低的毒性，所以一類有望作為MDR調節劑的化 合物是類黃酮。類黃酮是水果和蔬菜中天然存在的化合物，構成人類食物 的常見成分。取決于細胞類型和所用的藥物，它們對MDR也顯示不同的效 果。據報道，柯因(l)、槲皮素(2)、莰非醇(3)和脫氫水飛薊賓(4)(圖la)直接 結合至小鼠P-gp的NBD2胞漿區(Modulation by flavonoids of cell multidrug resistance mediated by P-glycoprotein and related ABC transporters. CMLS， Cell. Mol. Life Sci. 2002, 59,307 - 322。)。通過將異戊二烯基或其他烴基引 入類黃酮結構而增加的疏水性往往產生更有效的抑制劑。8-異戊二烯柯因或 6-異戊二烯柯因(5或6)(圖la)抑制白血病K562/R7細胞內的P-gp介導的 藥物流出，而8-二甲基烯丙基莰非醇(7)在抑制Ltrmdrl方面是比環孢霉素 A或維拉帕米更好的調節劑。
即便類黃酮具有較低的毒性，當前這一代類黃酮調節劑仍有局限性。 首先是它們的活性往往是中等活性。其次，它們具有廣譜生物活性，包括 抗雌激素和抑制其他ATP酶。將類黃酮作為MDR調節劑高劑量施用，很 可能導致副作用。
在治療寄生性疾病方面的藥物耐受性
利什曼病(世界衛生組織(WHO)所針對的六種寄生性疾病之一)是全 世界88個國家存在的地方性疾病。利什曼病主要出現在北非、亞洲、拉丁 美洲和中東。有三億五千萬人口處于傳染的危險中，每年有兩百萬病例報 道。這些病例中約有四分之一是內臟利什曼病，這可能是致命的。利什曼 病的主要治療方法是施用五價的銻(Pentostam和Glucantime)。 二級治療包
9括噴他脒和兩性霉素B。這些治療具有許多副作用，并且它們的療效因出 現對這些抗利什曼原蟲藥物中的某些藥物的臨床耐受性而進一步受阻
(Human leishmaniasis: clinical, diagnostic, and chemotherapeutic developments in the last 10 years. Clin. Infect. Dis. 1997, 24， 684-703)。據報道在印度超過 500/()的內臟利什曼病病例對銻劑有耐受性(Circulating T helper 1 (Thl) cell-and Th2 cell-associated cytokines in Indian patients with visceral leishmaniasis. Am. J. Trop. Med. Hyg. 1997, 56， 522-5)。 WHO已將五價銻劑在利什曼原蟲
中的耐藥性作為其最優先考慮的因素之一。諸如米替福新(一種十六烷基 磷酸膽堿)等較新的治療劑也顯示出巨大的潛力。不過由于在血液中的半 衰期較長，以米替福新治療容易導致藥物耐受性。因此需要開發能治療顯 示多藥耐藥性的寄生性疾病的新型藥物。 發明目的
因此，本發明的目的是開發比類黃酮具有改善的活性和/或選擇性的類 黃酮衍生物，從而解決現有技術所提出的至少一個或多個以上的問題。最 低限度，本發明的目的是向公眾提供一種可用的選擇。

發明內容
因此，本發明提供式I化合物
類黃酮-接頭-類黃酮 I
其中，
所述類黃酮選自由查耳酮、黃酮、黃酮醇、黃烷酮、花色素苷和異類 黃酮組成的組；并且
所述接頭(Linker)是具有至少一個碳原子的基團。
優選的是，所述接頭選自由亞垸基、具有多個乙二醇單元的基團、具 有多個丙二醇單元的基團、具有多個鄰亞苯基二氧基、間亞苯基二氧基或 對亞苯基二氧基單元的基團或它們的組合組成的組。更優選的是，所述接頭是具有多個乙二醇單元的基團，所述基團可具
有1至13個乙二醇單元。有利的是，所述接頭具有2至6個或2至4個乙
二醇單元，更優選的是具有4個乙二醇單元。
式I中的類黃酮可以是黃烷酮，更優選是芹菜素。 本發明的另一方面提供一種合成上述式I的化合物的方法，其中 所述類黃酮是黃垸酮；并且 所述接頭是具有多個乙二醇單元的基團。 對羥基苯甲醛首先與式II化合物反應以形成式III化合物
n m
其中，R,選自-H、-甲苯磺酰基和-甲磺酰基。
然后式III化合物與式IV化合物反應以形成式I化合物
其中R2選自由-H、芐基和甲氧基甲基組成的組。 本發明還提供合成式I化合物的另一種方法，其中 所述類黃酮是黃垸酮；并且 所述接頭是具有多個乙二醇單元的基團。 對羥基苯甲醛首先與式IV化合物反應以形成式V化合物<formula>formula see original document page 12</formula>
其中，R2選自由-H、芐基和甲氧基甲基組成的組。 然后式V化合物與式II化合物反應以形成式I化合物
<formula>formula see original document page 12</formula>
其中，Ri選自-H、-甲苯磺酰基和-甲磺酰基。
本發明的再一個方面提供一種降低基于P-糖蛋白的多藥耐藥性的方
法，所述方法包括施用有效量的式I化合物的步馬聚
類黃酮-接頭-類黃酮 I
其中，
所述類黃酮選自由查耳酮、黃酮、黃酮醇、黃烷酮、花色素苷和異類 黃酮組成的組；并且
所述接頭是具有至少一個碳原子的基團。
本發明的另一個方面提供一種降低寄生性疾病中的藥物耐受性的方 法，所述方法包括施用有效量的式I化合物的步驟，優選以4MM至60MM 的濃度施用
類黃酮-接頭-類黃酮 I其中，
所述類黃酮選自由査耳酮、黃酮、黃酮醇、黃纟完酮、花色素苷和異類 黃酮組成的組；并且
所述接頭是具有至少一個碳原子的基團。
優選的是，所述寄生性疾病是由利什曼原蟲類引起的。更優選的是， 所述寄生性疾病是由選自由杜氏利什曼原蟲(L ^)"owm')、亞馬遜利什曼 原蟲(丄.amazo"era^)、 tore"fo/ae禾!H十曼原蟲(丄.fare"to/ae」、^!j帶禾lK十曼原 蟲(￡. rro/ z'ca)、豚鼠利什曼原蟲(丄.e"n'e他)、墨西哥利什曼原蟲(L we;dc朋a) 和碩大利什曼原蟲(丄.mq/or)組成的組中的一種寄生蟲引起的。
有利的是，所述藥物選自由葡萄糖酸銻鈉和噴他脒組成的組，所述藥 物的濃度優選為lmg/mL至6.4mg/mL。
本發明的另一個方面提供一種藥劑，所述藥劑包含上述類黃酮二聚物 中的任何一種類黃酮二聚物，所述藥劑用于降低基于P-糖蛋白的多藥耐藥 性或用于降低癌癥或寄生性疾病中的藥物耐受性。


現在將通過實施例并參考附圖解釋本發明的優選實施方式，在附圖中
圖1顯示已知類黃酮的結構(圖la)和本發明的二聚類黃酮的結構(圖
lb);禾口
圖2顯示通過兩種路線合成芹菜素二聚物的反合成分析；
圖3顯示"菜素單體和二聚物在MDA435LCC6 MDR細胞中對紫杉醇 細胞毒性的作用；
圖4顯示芹菜素單體和二聚物在MDA435LCC6 MDR細胞中對長春堿 細胞毒性的作用；
圖5顯示斥菜素單體和二聚物在MDA435LCC6 MDR細胞中對阿霉素 細胞毒性的作用；圖6顯示，在存在抗癌藥物(A)長春堿、(B)紫杉醇、(C)阿霉素、(D)長 春新堿、(E)柔紅霉素和(F)米托蒽醌時，在有或沒有5|aM 9d的情況下 MDA435LCC6 MDR細胞和MDA435LCC6細胞的增殖；
圖7顯示阿霉素在以(A)不同的調節劑和(B)不同濃度(O至20pM)的9d 處理的MDA435LCC6 MDR細胞和MDA435LCC6細胞中的細胞內累積；
圖8A顯示齊菜素單體和二聚物在P388/ADR細胞中對阿霉素細胞毒性 的作用，圖8B顯示9d在P388/ADR細胞中對阿霉素細胞毒性的濃度依賴 作用，表示為由在不同濃度(O至10(iM)9d的存在下的MTS細胞毒性檢測 的劑量響應曲線計算出的ICsJ直；
圖9A顯示齊菜素單體和二聚物在P388/ADR細胞中對柔紅霉素細胞毒 性的作用，圖9B顯示9d在P388/ADR細胞中對柔紅霉素細胞毒性的濃度 依賴作用。結果表示為由在不同濃度(O至10]uM)9d的存在下的MTS細胞 毒性檢測的劑量響應曲線計算出的ICso值；
圖10顯示，在存在抗癌藥物(A)長春堿、(B)紫杉醇、(C)阿霉素、(D) 長春新堿、(E)柔紅霉素和(F)米托蒽醌時，在有或沒有5pM 9d的情況下 P388/ADR細胞和P388細胞的增殖；
圖11顯示阿霉素在以(A)不同的調節劑和(B)不同濃度(O至20liM)的9d 處理的P388/ADR細胞和P388細胞中的細胞內累積；
圖12顯示9d對P-gp ATP酶活性的作用；
圖13顯示下述利什曼原蟲的藥物耐受性:(A)噴他脒耐受型豚鼠利什曼 原蟲(LePentR50)和(B)葡萄糖酸銻鈉(SSG)耐受型杜氏利什曼原蟲(Ld39和 Ld2001);
圖14顯示具有不同長度的乙二醇單元(1至13個單元)的本發明的類 黃酮二聚物對噴他脒耐受型豚鼠利什曼原蟲LePentR50(A)的耐受性、SSG 耐受型杜氏利什曼原蟲Ld39和Ld2001(B和C)和野生型杜氏利什曼原蟲 LdAG83(D)的SSG耐受性的調節活性；和9d對LePentR50的噴他脒耐受性的劑量
依賴性調節活性；
圖16顯示類黃酮二聚物9d對LePentR50的噴他脒累積的作用；
圖17顯示9c (A)和9d (B)對Ld39的SSG耐受性、9d對LdAG83 (C)
的SSG耐受性的劑量依賴調節活性和9d對LdAG83和Ld2001中的總銻累
積的作用(D);和
圖18顯示9c和9d與其他MDR調節劑對LePentR50的噴他3米耐受性 (A)和對Ld39的SSG耐受性(B)的調節活性的比較。
具體實施例方式
在下面的段落中通過舉例的方式并參考附圖來描述本發明。 本發明的目的、特征和方案將在下面的說明中公開，或者通過下面的 說明而顯而易見。本領域技術人員應當理解本申請中的討論僅是示例性實 施方式的說明，其意圖并不在于限制本發明的范圍更寬的方案，范圍更寬 的方案包含在示例性的解釋中。
改善本發明的類黃酮的效力和選擇性的方法是通過采用多價相互作用 來利用P-gp的假二聚性質(pseudodimeric nature)和多個結合點。生物體系的 多價相互作用的特征在于多個配體同時結合在一個生物實體上。"多價性" 是指單個分子具有一個或多個能同時結合在一個生物實體上的"配體"。在 合適的條件下，由于二次結合事件的熵更加有利，所以多價相互作用通常 比相應的單價相互作用更強。該方法的目的在于將類黃酮作為相對安全的 P-gp逆轉劑的優勢和在增加單體親合力方面的多價性能力的優勢結合起 來。
本發明廣義而言，合成了式I化合物
類黃酮-接頭-類黃酮 I
15其中，
所述類黃酮選自由查耳酮、黃酮、黃酮醇、黃烷酮、花色素苷和異類 黃酮組成的組；并且
所述接頭是具有至少一個碳原子的基團。
術語"類黃酮"是指基于C15骨架的化合物，該C15骨架具有在2位、 3位或4位上帶第二個芳環B的CHROMANE環(苯并二氫吡喃環)。櫟醇(蕓香、蕎麥、西洋接骨木)
莰非醇(西洋接骨木、肉桂、問荊、野芝麻、拳參)。 楊梅黃酮。
4.黃垸酮
5.花色素苷
6.異類黃酮
h。
。 ^"V。h 所有上述化合物均能用作本發明全文的"類黃酮"。類黃酮的苯環或6
元環上的-H或-OH的各種取代都是可能的。例如，-H或-OH可以被下述基
團取代
17鹵素氟、氯、溴和碘；
d Cu)烷基具有1至10個碳原子的直鏈或支化烷基，例如甲基、 乙基、丙基、l-甲基乙基、丁基、l-甲基丙基、2-甲基丙基、l，l-二甲基乙 基、戊基、2-甲基丁基；
G do鹵代烷基具有1至10個碳原子的直鏈或支化烷基，這些基 團中的某些氫原子或全部氫原子可能被如上所述的鹵原子所替換，例如， 諸如氯代甲基、二氯甲基、三氯甲基、氟代甲基、二氟甲基、三氟甲基、
氯代氟甲基、二氯氟甲基、氯代二氟甲基、l-氟乙基、2-氟乙基、2，2-二氟 乙基、2，2，2-三氟乙基、2-氯-2-氟乙基、2-氯-2,2-二氟乙基、2,2-二氯-2-氟乙 基、2，2，2-三氟乙基和五氟乙基等Q Q。鹵代烷基；
Ct dQ烷氧基通過氧原子(-O-)連接在骨架上的如上所述的具有1至 10個碳原子的直鏈或支化烷基，例如，諸如甲氧基、乙氧基、丙氧基、1-甲基乙氧基、丁氧基、1-甲基丙氧基、2-甲基丙氧基、1,1-二甲基乙氧基等
d do烷氧基；
C2 C1Q鹵代烷氧基具有2至10個碳原子的直鏈烷基，這些基團中
的某些氫原子或全部氫原子可能被如上所述的鹵原子所替代，這些基團通
過氧原子連接在骨架上，例如，2-氟乙氧基、2，2-二氟乙氧基、2,2,2-三氟乙 氧基、2-氯-2-氟乙氧基、2-氯-2,2-二氟乙氧基、2，2-二氯-2-氟乙氧基和2,2,2-
三氯乙氧基。
術語"部分或完全鹵代"是表示在以此為特征的基團中，氫原子可以 部分或完全地被相同或不同的如上所述的鹵原子所替代。
類黃酮的苯環或6元環上的氫原子或-OH基團可以部分或完全地被氨 基(其帶有上述的具有不同取代基的垸基或芳基)、硝基、硫醚基團、亞砜 基或砜基所替代。
此外，如果需要，可以用合適的酯基團保護類黃酮的苯環或6元環上 的-OH基團，例如，所述-OH基團上的H可以被具有結構-(CO)-R的d C6酰基所替代，其中R是H或具有1至5個碳原子的直鏈或支化的垸基， 例如甲基、乙基、丙基、l-甲基乙基、丁基、l-甲基丙基、2-甲基丙基、l，l-
二甲基乙基、戊基、2-甲基丁基。烷基R可以部分或完全鹵代。術語"部 分或完全鹵代"是表示在以此為特征的基團中，氫原子可以部分或完全地 被相同或不同的鹵原子所替代，例如氯代甲基、二氯甲基、三氯甲基、氟 代甲基、二氟甲基、三氟甲基、氯代氟甲基、二氯氟甲基、氯代二氟甲基、 l-氟乙基、2-氟乙基、2,2-二氟乙基、2,2，2-三氟乙基、2-氯-2-氟乙基、2-氯 -2,2-二氟乙基、2,2-二氯-2-氟乙基、2,2,2-三氟乙基和五氟乙基。
各種接頭基團(Linker Gro邵)都可用于本發明中。顯然所述接頭必須具 有兩個末端，每個末端連接所述類黃酮中的一個。接頭應當具有至少一個
碳原子，包括亞垸基(-CH2-)n;具有通式-0[-(-CH2)m-(0)]n-的基團，例如具
有多個乙二醇單元-0-(CH2-CH2-0)n-的基團，具有多個丙二醇單元
-0-(CH2-CH2-CH2-OV的基團；具有鄰苯二氧基、間苯二氧基或對苯二氧基
單元的基團；或這些基團的組合或可通過化學鍵將多個類黃酮連接在一起 的其他基團。這些基團各自又可以是"部分或完全鹵代"的。后面將顯示 接頭基團可具有各種長度，即，"m"和/或"n"可以是大于或等于1的任 何整數。
應當注意，式I中的兩個類黃酮可以是不同的。例如， 一個可以是黃酮， 而另一個可以是黃垸酮，并且各種其他組合也是可以的。
此外，連接部位可以在類黃酮的各種位置。這是化合物合成中的設計 選擇問題，將由本領域技術人員確定。
令人驚訝的是，發現本發明的類黃酮二聚物是高度有效的體外化學增 敏劑。其中的一些化合物能夠增加藥物在藥物耐受性細胞而不是藥物敏感 性細胞中的累積，并能夠在體外將抗癌藥物(紫杉醇、阿霉素、柔紅霉素、 長春新堿和長春堿)在藥物耐受性乳腺癌細胞和白血病細胞中的細胞毒性 增強5倍 50倍。合成了整體結構如9所示的一系列類黃酮二聚物(圖1)，其具有各種
長度的聚乙二醇(PEG)鏈，其中所述類黃酮是芹菜素(8)。選擇芹菜素(8)作為 母體單配體是因為據報道芹菜素是克隆HCT-15癌細胞中的MDR的調節 劑。選擇C'4位作為接頭的附著位點是因為已證實在該位置取代對分子的 活性幾乎沒有作用。研究了以1個至13個乙二醇單元連接的一系列芹菜素 二聚物在增強不同的MDR癌細胞的敏感性方面的效力。將它們的活性與芹 菜素自身以及單體10a和10b進行比較。我們還評價了它們逆轉P-gp介導 的藥物流出的能力。
聚乙二醇連接的芹菜素二聚物的合成 化學
如圖2所示，有兩條合成路線可幵發用以實現聚乙二醇(PEG)連接的類 黃酮9的合成。第一種方法(路線A)包括釆用一系列PEG連接的二醛11 ， 所述二酸是豐艮據"Synthesis of a ditopic cyclophane based on the cyclobutane ring by chalcone photocydoaddition. Tetrahedron 2003， 59， 3455 - 3459"由醛
15和相應的乙二醇二甲苯磺酸酯13a或乙二醇二甲磺酸酯13b合成的。然 后二醛11與三羥基苯乙酮14發生醇醛縮合，然后將二査耳酮氧化成環為 黃酮，得到9。另一條路線(路線B)包括合成選擇性保護的類黃酮12， 然后使類黃酮12與活化的PEG鏈13a或13b偶合。類黃酮12也可以由三 羥基苯乙酮14和苯甲醛15獲得。
直至n等于6的PEG鏈13可商購獲得。n大于6的PEG不易商購獲 得，因此需要進行合成。n大于6的PEG可通過"An expedient synthesis of monodispersed oligo(ethylene glycols). Synthesis 2004， 7, 1007 -1010"中所述 的方法獲得。乙二醇二甲苯磺酸酯13a (用于!1=2,3)和乙二醇二甲磺酸酯 13b (用于n=l， 4 9)根據"Synthesis of orthogonal end functionalized
20oligoethylene glycols of defined lengths. Tetrahedron Lett. 2004， 45， 4285 — 4288"中所述的方法在冰浴溫度由相應的PEG鏈13、甲苯磺酰氯或甲磺酰 氯和三乙胺在二氯甲垸中制備。化合物三羥基苯乙酮14和苯甲醛15均商 購獲得。經保護的2-羥基苯乙酮14a (Synthesis of a 3，4，5-trimethoxybenzoyl ester analogue of epigallocatechin-3-gallate (EGCG): A potential route to the natural product green tea catechin， EGCG. Org. Lett. 2001, 3, 843 — 846)禾口 14b (An effective synthesis of isoorientin: the regioselective synthesis of a 6-C-glucosylflavone. Carbohydrate Research 2000, 329, 507 — 513)可根據相應
的文獻中所述的方法制備。在嘗試其他目標化合物的合成之前，選擇類黃 酮9a(r^l)作為模型研究以探知最佳合成條件。
經由路線A合成9a(n4)
根據路線A進行9a的合成。結果總結于反應式1中。對羥基苯甲醛(15) 在碳酸鉀的存在下在50。/。的乙腈(ACN)水溶液中于回流溫度與乙二醇二甲 磺酸酯(13b)偶合，從而以高產率獲得二醛lla。然后在堿性介質下由二醛 lla與二芐基保護的苯乙酮14a的醇醛縮合制備二査耳酮16。合成二査耳酮 16的最初嘗試因轉化率較低、反應速度較慢以及產物的分離難以解決而不 成功。我們將這種困難歸因于所述醛在反應介質中較低的溶解性。大量的 試驗后，發現通過將二醛11 a溶解在THF中并將其添加至苯乙酮14a在60% 的KOH水溶液中的溶液內，可獲得幾乎定量的向所需的二查耳酮的轉化。 二查耳酮16具有特征性的金黃色。烯基質子較大的偶合常數(7^6Hz)表明 碳-碳雙鍵是反式。二查耳酮16轉化為二類黃酮17的成環可采用催化量的 碘在二甲基亞砜(DMSO)中在加熱條件下經由成環-消除路線以一鍋法平穩 進行。應當注意，大于催化量的碘的存在導致芐基的斷裂以及苯環的碘代。 當將大于100mg的起始二查耳酮用在所述反應中時，獲得最佳結果。用于 脫除17中的芐基保護基的方法是氫轉移氫解和在氫氣氛圍下采用催化量的 活性炭載Pd(OH)2或Pd/C。不過這些方法都不成功，總是僅回收到起始原
21料。對反應條件做了各種變化后，最終通過采用大量的10%Pd/C在THF/
水混合物中以非常低的產率獲得了類黃酮9a。因而，采用芐基作為保護劑 似乎是有問題的，總產率較低。因此，選擇甲氧基甲基(MOM)來代替芐基， 并由二醛lla重復整個合成路線(反應式1)。
采用3M的KOH-EtOH溶液通過二醛lla與二MOM-保護的苯乙酮14b 的醇醛縮合以高產率獲得了二查耳酮16a。采用催化量的碘在DMSO中進 行二查耳酮16a轉化為黃酮的成環以失敗告終。另一方面，在加熱條件下 進行2，3-二氯-5，6-二氰基-l,4-苯醌(DDQ)介導的氧化成環，可獲得去除了一 個MOM基團的17a。經過冗長的反應混合物的色譜純化，以較低的產率獲 得17a。 17a向類黃酮9a的轉化通過MOM基團的酸性介質脫保護而實現。 這些結果表明由于MOM基團可在溫和的條件下容易地去除，因此采用 MOM基團用于保護優于釆用芐基。不過，15到9a的總轉化產率仍較低。 需要對整個合成方案進行再優化。
ORl O 17aA =H, R2 = MOM O OR(
反應式1. (a) K2C03， ACN/H20,回流，14 h; (b)對于16， 14a, 60% KOH,室 溫，14 h;對于16a， 14b， 3M KOH的EtOH (乙醇)溶液，室溫，14 h; (c)對 于17，催化劑I2， DMSO，回流，14 h;對于17a， DDQ， PhMe (甲苯)/二噁烷， 回流，14h;(d)由17,H2，Pd/C，THF/H20，室溫，14h;由17a， 80°/。 AcOH(乙 酸)，回流，14 h。
經由路線B合成9a (n=l)然后根據路線B研究9a的合成。結果總結于反應式2中。苯乙酮14b 在堿性條件下與對烯丙氧基苯甲醛縮合，以高產率獲得査耳酮18。進行 DDQ介導的18的氧化成環從而得到有一個MOM基團被去除的19。采用 碳酸鉀在DMF中以芐基溴保護19中的羥基，以良好產率得到20。釆用催 化量的Pd(PPh3)4和碳酸鉀在甲醇中去除20的烯丙基保護基，以高產率得到 12a。在堿性條件下二甲磺酸酯13b(n-l)被12a的對苯氧基部分分子間親核 取代，得到21a。 21a的二聚性質由高分辨率質譜可明顯看出。鈀催化的節 基脫保護和隨后的MOM基團的酸性脫保護后，以高產率獲得類黃酮9a。
^^OAIIyl au n OH O
反應式2. (a) 3M KOH-EtOH，室溫，16 h; (b) DDQ, PhMe/二噁烷，回流，7 h; (c) K2C03， BnBr， DMF，回流，2 h; (d)催化劑Pd(PPh3)4， K2C03, MeOH，回 流，2 h; (e) K2C03, DMF，回流，2 h; (f) H2， Pd/C， CHC13,室溫，12 h; (g) 80% AcOH,回流，14h。
經由路線B合成黃酮二聚物％至9i
建立了經由路線B合成9a的最佳條件后，以相同的方式合成了具有不 同PEG鏈的其他類黃酮二聚物。結果總結于反應式3中。對于較短的鏈(11=2 和3)，采用PEG二甲苯磺酸酉旨(13a)，而對于較長的鏈(r^4 9)則采用PEG 二甲磺酸酯(13b)。在所有的情況中，均以合理的總產率制備了類黃酮二聚
23物9a至9i，總產率范圍基于12a為30% 50%。 一般而言，具有較長的PEG 鏈(11=5以上)的類黃酮二聚物作為油狀物獲得。對于具有較短的PEG鏈長度 (n=4以下)的類黃酮二聚物，它們作為固體獲得，熔點由352。C(n-1)降至131 °C(n=4)。
單價類黃酮10a和10b的合成
在隨后的生物研究中，顯然需要一元黃酮IO用于對照實驗。幸運的是， 在以二甲苯磺酸酯13a(i^3)或二甲磺酸酯13b(i^4)偶合12a的過程中，作為 少量副產物獲得了單偶合產物23a(n-3)或23b(n=4)，推測是因為在反應過 程中一個甲苯磺酸酯或甲磺酸酯水解。23a或23b的單體性質由高分辨率質 譜可明顯看出。隨后進行芐基的鈀催化脫保護，接下來進行MOM基團的 酸脫保護，得到一元黃酮10a和10b (反應式3)。
13a(n=2,3)
13b(n = 4to9)Ki、0〖 ^_
12a
Ri、/ 。VH
1 o( p丫
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R，R-Bn;IfT il
R2:R=H MOMO^^^O^iz、
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反應式3.(a)K2C03，DMF，回流；(b) H2, Pd/C， CHC13,室溫；(c)對于n:2，3; 80%AcOH,回流；對于n^4 9;6MHCl,THF,室溫。
聚乙二醇連接的芹菜素類似物二聚物的合成
采用經由路線B開發出的通用方法，可根據反應式4由各種取代的羥 基苯乙酮(31a至31/)開始制備大量的芹菜素類似物二聚物(35a至35/)。也可 通過將單體類似物34a至34/之一與一元齊菜素的甲磺酸酯24偶合，而后 進行脫保護以制得非對稱的芹菜素二聚物。
24<formula>formula see original document page 25</formula>反應式4(Me:甲基；diMeO: 二甲氧基；diCl: 二氯；reflux:回流；allyl: 烯丙基；rt.:室溫；Cat.:催化劑；Ms:甲磺酰基)
本發明中己通過兩種合成路線合成了一系列由各種長度的聚乙二醇鏈 連接在一起的基于芹菜素的類黃酮二聚物。發現由于MOM基團可在溫和 的條件下容易地去除，因此采用MOM基團用于保護優于采用芐基基團。
這可有效地應用于其他類黃酮化合物的合成中。
實驗數據 概述
所有的NMR譜圖均記錄于Bruker MHz DPX400光譜儀，&為400.1 MHz， 13(3為100.62 MHz。所有的NMR測定均在室溫進行，化學位移均按 相對于CDCl3的共振(分別是'H為7,26ppm， 13C模式中的三重峰的中 線為77.0ppm)的百萬分數(ppm)作為5的單位進行報告。低分辨率質譜和 高分辨率質譜通過電噴霧電離(ESI)模式得自Micromass Q-TOF-2或者通過 電子電離(EI)模式得自Finnigan MAT95 ST。采用Electrothermal IA9100數字熔點儀測定熔點，未作校正。所有的試劑和溶劑均為試劑級，并且如非
另外指出，均未經進一步純化而使用。薄層色譜(TLC)所用的板是E.Merck Silica Gel 60F254 (0.25 mm厚)，并在短(254 nm)UV光下顯色。色譜純化采用 MN硅膠60(230目至400目)進行。
反式-3-(4-烯丙氧基苯基)-l-[2,4-二(甲氧基甲氧基)-6-羥基苯基]丙烯酮 (18):將2-羥基-4，6-二(甲氧基甲氧基)苯乙酮14b (4.39 g, 17.1 mmol)、 4-烯 丙氧基苯甲醛(2.卯g， 17,9mmol)和KOH溶液(96。/。EtOH中的3M溶液， 30mL)添加至圓底燒瓶中。溶液立即變成褐色，將其在室溫攪拌16小時。 當TLC顯示苯乙酮完全消耗時，將反應混合物倒入含0.5M HC1溶液(180 mL)的分液漏斗中。以CH2Cl2(40mLx3)提取該混合物。將合并的有機相用 MgS04干燥，過濾并蒸發以得到粗品棕色油狀物，將該油狀物在硅膠上(70 g)進行快速柱層析(正己垸中20%的EtOAc)以得到黃色固體查耳酮18 (6.53 g, 95%): m.p.: 70畫71。C; iHNMR(CDCl3) 5 3.48 (s, 3H)， 3.53 (s， 3H), 4.57 (d, ■/= 5.2 Hz, 2H), 5.18 (s， 2H)， 5.28 (s， 2H)， 5.31 (d, /= 10.4 Hz, 1H), 5.42 (dd， 1.2, 17.2 Hz, 1H), 6.02-6.04 (m, 1H), 6.24 (d, > 2,0 Hz, 1H), 6.31 (d, /= 2,0 Hz， 1H), 6.93 (d;l/= 8.8 Hz, 2H)， 7.54 (d,聲8.8 Hz, 2H), 7.76 (AB中的A， ■/= 15.4 Hz， 1H)， 7.83 (AB中的B， ■/= 15.4 Hz, 1H), 13.9 (s, IH); 13C畫R (CDC13) 5 56.4, 56.8， 68.8， 94.0， 94.7, 95,1， 97.5， 107.5, 115.1， 118,0， 125.0， 128.3, 130.0, 132.7, 142.6， 159.8, 160.4， 163.2， 167.2, 192.8; LRMS (ESI) m/z 401 (M+ + H, 100), 423 (M""+Na， 22); HRMS (ESI) 02必2507(1^++印的計算值為401.1600， 測定值為401.1604。
5-羥基-7-甲氧基甲氧基-2-(4，-烯丙氧基苯基)-4樂苯并吡喃-4-酮(19): 將查耳酮18 (6.53 g， 16.3 mmol)、 DDQ (5.56 g， 24.5 mmol)和甲苯中25%的 二噁垸的干燥溶劑(100mL)添加至圓底燒瓶中。所述溶液立即變為深褐色， 將其在氮氣氛圍下于回流溫度攪拌7小時。當TLC顯示查耳酮18完全消耗
26時，將反應混合物冷卻至室溫并將溶劑蒸發至干。添加CH2Cl2(150mL)后， 通過吸濾除去不溶的棕色固體。將深棕色濾液以飽和NaHC03洗滌，并用 MgS04干燥，過濾，蒸發，并在硅膠(130g)上進行快速柱層析(己烷中15% 的EtOAc)，以得到淺黃色固體化合物19 (2.10 g, 36%): m.p.: 100-101°C; & NMR (CDC13) S 3.49 (s, 3H)， 4.59 (d, J= 5.2 Hz, 2H)， 5.22 (s， 2H), 5.32 (d， 《/= 10.8 Hz, 1H), 5.43 (d， /= 17.2 Hz， 1H)， 6.00-6.09 (m， 1H), 6.44 (d， J= 1.8 Hz， 1H), 6.54 (s, 1H), 6.25 (d, /= 1.8 Hz， 1H), 6.99 (d, 8.8 Hz, 2H), 7.79 (d, / = 8.8 Hz， 2H)， 12.74 (s， 1H); 13C NMR (CDC13) 5 56.4， 68.9, 94.2， 94.2, 100.0， 104.2, 106.1, 115.1， 118.2， 123.5, 127.9， 132.4, 157.5， 161.6, 161.9， 162.8, 163.9， 182.4; LRMS (ESI) m/z 355 (M++H， 36); HRMS (ESI) C20HI9O6 (M++H) 的計算值為355.1182,測定值為355.1164。
5-芐氧基-7-甲氧基甲氧基-2-(4'-烯丙氧基苯基)-4樂苯并吡喃-4-酮(20): 將化合物19(2.24 g， 6.3 mmol)、節基溴(1.70 g， 9.9 mmol)、K2C〇3 (1.80 g， 13.0 mmol)和DMF (15 mL)添加至圓底燒瓶中。將反應混合物在回流溫度攪拌2 小時。當TLC顯示19完全消耗時，將該反應混合物倒入含水(200mL)的分 液漏斗中。以CH2C12 (30 mLx3)提取該混合物。將合并的有機相用MgS04 干燥，過濾并蒸發，得到褐色油狀物，將該油狀物在硅膠(50g)上以梯度洗 脫液(己垸中30%的EtOAc—己垸中60%的EtOAc)進行快速柱層析，得到米 白色固體化合物20(2.01 g,72%): m.p.: 120- 122°C; 'H NMR (CDC13) S 3.68 (s, 3H), 4.78 (d， 《/= 5.2 Hz， 2H)， 5.41 (s, 2H), 5.43 (s， 2H), 5.51 (d, /= 10.8 Hz, 1H), 5.62 (d, ■/= 17.2 Hz， 1H), 6.21 - 6.26 (m, 1H), 6.69 (d， /= 2.0 Hz， 1H), 6.77 (s, 1H)， 6.94 (d， 2.0 Hz， 1H)， 7,18 (d， J= 8.6 Hz， 2H), 7.45 (t, J= 7.6 Hz, 1H)， 7.58 (dd, /= 7.2， 7.6 Hz, 2H), 7.82 (d, /= 7.2 Hz， 2H)， 7.99 (d, /= 8.6 Hz, 2H); 13C NMR (CDC13) 5 56.4, 68.9, 7.07, 94.3， 96.0, 98.7， 107.6, 110.2， 115.0， 118.1, 123.9, 126.6, 127.6， 128.5, 128.7, 132.6， 136.4, 159.4, 159.6， 160.7， 161.0， 161,2， 177.4; LRMS (ESI) m/z 445 (M""+H， 100)， 467 (M++Na， 15); HRMS (ESI) C27H2506 (W+H)的計算值為445.1651,測定值為445.1641。
275-節氧基-7-甲氧基甲氧基-2-(4，-羥基苯基)-4/f-苯并吡喃-4-酮(12a):將 化合物20 (2.01 g, 4.5 mmol)、催化量的Pd(PPh3)4(0.1 g)、K2C03 (2.50 g, 18.1 mmol)和MeOH (80 mL)添加至圓底燒瓶中。該反應混合物在回流溫度攪拌 2小時。當TLC顯示20完全消耗時，將該反應化合物倒入含水(200 mL)的 燒杯中。用1MHCl溶液將該溶液酸化至pH4，形成大量米白色固體，通 過吸濾收集所述固體。將收集的固體溶于50。/。EtOAc的MeOH溶液中，并 通過過濾除去不溶的黑色炭。將褐色濾液在減壓下蒸發，慢慢結晶出白色 固體化合物12a (1.42 g, 78%): m.p.: 202-204。C; 'HNMR "-DMSO) 5 3.59 (s， 3H), 5.40 (s， 2H), 5.51 (s， 2H)， 6.77 (s, 1H)， 6.85 (d, J= 1.8 Hz, 1H), 7.07 (d, J= 1.8 Hz， 1H), 7.09 (d, > 8.8 Hz, 2H), 7.49 (t, J= 7.6 Hz， 1H), 7.58 (dd, J=7.2, 7.6 Hz， 2H)， 7.79 (d， /= 7.2 Hz, 2H)， 8.06 (d, J= 8.8 Hz, 2H), 10.41 (s, 1H); 13C NMR (c4-DMSO) 5 56.5， 70.3， 94.4, 96.2, 99.1， 106.6, 109.6, 116.3， 121.7， 127.3, 127.9, 128.3, 128.7, 137.3， 159.2, 159.4, 160.7, 161.0, 161.2, 176.1; LRMS (ESI) m/z 405 (IvT+H, 100), 427 (M++Na， 19); HRMS (ESI) C24H2106 (M+ + H)的計算值為405.1338，測定值為405.1336。
由12a合成類黃酮二聚物21a至21i的一般步驟將化合物12a(1.6當 量)、二甲磺酸酯13b(對于i^l,4to9)或二甲苯磺酸酯13a(n = 2,3)(l當 量)、K2C03(8當量)和DMF添加至圓底燒瓶中。將該反應混合物在回流溫 度攪拌2小時至3小時。在加熱過程中，反應混合物逐漸由淺褐色轉變為 乳白色。當TLC顯示12a完全消耗時，將該反應混合物倒入含水(200 mL) 的分液漏斗中。以CH2Cl2(20mLx3)提取該混合物。如果混合物不能分離成 兩層，則添加1MHCi(20mL)。將合并的有機層用MgS04干燥，過濾并蒸 發，得到粗品反應混合物。通過如下所述的結晶或快速柱層析進行類黃酮 二聚物的純化。
1,4-二[4'-((5-芐氧基-7-甲氧基甲氧基)-4樂苯并吡喃-4-酮-2-基)苯基]-l，4-二氧丁烷(21a):該化合物由12a (230 mg, 0.57 mmol)、乙二醇二甲磺 酸酯(75 mg, 0.34 mmol)、 K2C03 (380 mg)和DMF (8 mL)按照如上所述的合 成類黃酮二聚物的一般步驟制備。從EtOAc中結晶后，得到作為白色固體 的標題化合物(150 mg, 63%): m.p.: 173-175°C; NMR (CDC13) 5 3.50 (s, 6H), 4.40 (s， 4H), 5.23 (s， 4H), 5.25 (s， 4H)， 6.51 (d, 1.6 Hz, 2H), 6.57 (s， 2H), 6.77 (d， ■/= 1.6 Hz， 2H), 7.04 (d, /= 8.8 Hz, 4H), 7.30 (t, /= 7.2 Hz, 2H)， 7,39 (dd, J= 7.2， 7.6 Hz， 4H), 7.63 (d， 7.6 Hz, 4H), 7.83 (d, J= 8.8 Hz, 4H); 13C NMR (CDC13) S 56.4, 66,5, 70.7， 94.3,96,0， 98.8， 107.7, 110.2， 114.9, 124.3， 126.6, 127.6, 127.7， 128.5, 136.4， 159.4， 159.6, 160.6, 160.9, 161.3, 177.4; LRMS (ESI) m/z 835 (M++H, 100), 857 (MT+Na, 68); HRMS (ESI) C5oH42C^Na(M^Na)的計算值為857.2574，測定值為857.2571。
1 ，7- 二 [4'-((5-芐氧基-7-甲氧基甲氧基)-4/7-苯并吡喃-4-酮-2-基)苯 基]-l，4,7-三氧庚烷(21b):該化合物由12a (200 mg, 0.50 mmol)、 二乙二醇二 甲苯磺酸酯(130 mg, 0.31 mmol)、 K2C03 (360 mg)和DMF (8 mL)按照如上所 述的合成類黃酮二聚物的一般步驟制備。從EtOAc中結晶后，得到作為白 色固體的標題化合物(88mg,40。/。) m.p.: 110-111 °C;HNMR (CDC13) 5 3.48 (s， 6H), 3.96 (t， /= 4.6 Hz， 4H), 4.22 (t, /= 4.6 Hz， 4H)， 5.26 (s, 8H)， 6.47 (d, /= 1.8 Hz， 2H)， 6.58 (s， 2H), 6.73 (d, J= 1.8 Hz, 2H), 6.99 (d， /= 8.6 Hz， 4H), 7.30 (t, 7.6 Hz， 2H)， 7.40 (dd, 7.2， 7.6 Hz, 4H), 7.62 (d, 7.2 Hz， 4H), 7.78 (d， /= 8.6 Hz， 4H); 13C NMR (CDC13) 5 56.4, 67.6, 69.8, 70.7, 94.3, 95.9， 98,7, 107.5， 110.1,114.9， 123.9, 126.6， 127.6， 128.5， 136.4， 159.4， 159.5, 160.7, 161.1， 161.3, 177.4; LRMS (ESI) m/z 879 (M""+H, 7); HRMS (ESI) C52H47013 (M+ + H) 的計算值為879.3017，測定值為879.3032。
1,10-二[4'-((5-芐氧基-7-甲氧基甲氧基)-4仏苯并吡喃-4-酮-2-基)苯 基]-l,4,7,10-四氧癸垸(21c)和9-[4，-((5-芐氧基-7-甲氧基甲氧基)-4//-苯并吡 喃-4-酮-2-基)苯基]-3,6,9,-三氧壬垸-l-醇(23a):這些化合物由12a (200 mg,0.50mmol)、三乙二醇二甲苯磺酸酯(140 mg， 0.33 mmol)、 K2C03 (380 mg) 和DMF(8 mL)按照如上所述的合成類黃酮二聚物的一般步驟制備。從 EtOAc中結晶后，得到作為白色固體的化合物21c (96 mg, 42%): m.p.: 78-80 °C; !H NMR (CDC13) S 3.48 (s， 6H), 3.77 (s, 4), 3.89 (t，4.8 Hz， 4H)， 4.17 (t，
4.8 Hz， 4H)， 5.20 (s， 8H), 6.46 (d, /= 1.6 Hz， 2H)， 6.56 (s, 2H)， 6.72 (d, 1.6 Hz， 2H)， 6,97 (d, 8,6 Hz， 4H)， 7.30 (t， /= 7.2 Hz， 2H), 7.39 (t, J= 7.2 Hz, 4H)， 7.62 (d, J= 7.2 Hz， 4H), 7.76 (d, >/= 8.6 Hz, 4H); 13C NMR (CDC13) 5 56.4， 67.5, 69.6, 70.6， 70.9, 94.3， 95.9， 98.7, 107.4， 110.1, 114.9， 123.8, 126.6, 127.5, 128.5， 136.4, 159.4， 159.5， 160.7， 161.2, 161.2, 177.3; L腿S (ESI) m/z 923 (M+ + H， 18), 946 + Na， 50); HRMS (ESI) C54H50OI4Na + Na)的計算 值為945.3098，測定值為945.3103。然后將母液進一步蒸發，并在硅膠(20 g)上以梯度洗脫液(CH2Cl2中20%的丙酮—CH2Cl2中50%的丙酮)進行快 速柱層析，得到淺黃色油狀物化合物23a(56mg，21。/。) NMR (CDC13) 5 2.64 (br， 1H), 3.47 (s， 3H)， 3.60 (t， /= 4.2 Hz， 2H)， 3.67 - 3.73 (m， 6H), 3.86 (t, /= 4.7 Hz， 2H)， 4.16 (t， J= 4.7 Hz， 2H)， 5.20 (s， 2H)， 5.22 (s, 2H), 6.48 (d， J= 2.0 Hz, 1H), 6.57 (s, 1H), 6.73 (d， /= 2.0 Hz, 1H)， 6.97 (d， J= 8.8 Hz， 2H)， 7.28 (t, J= 7.4 Hz, 1H)， 7.37 (dd， J= 7.4， 7.8 Hz, 2H), 7.61 (d， J= 7.8 Hz， 2H)， 7.77 (d,
8.8 Hz, 2H); 13C NMR (CDC13) 5 56.3, 61.6， 67.4, 69.4， 70.2, 70.6, 70.7， 72.4， 94.2, 95.9, 98.6， 107.4， 110.0， 114.8， 123.8, 126.5, 127.5, 127.5, 128.4, 136.3， 159.3, 159.5， 160.7， 161.1, 161.2， 177.3。
1，13-二[4，-((5-芐氧基-7-甲氧基甲氧基)-4//-苯并吡喃-4-酮-2-基)苯 基]-l，4，7，10，13-五氧十三垸(21d)和12-[4，-((5-芐氧基-7-甲氧基甲氧基)-4//-苯并吡喃-4-酮-2-基)苯基]-3，6，9，12-四氧十二烷-l-醇(23b):這些化合物由12a (1.33 g, 3.3 mmol)、四乙二醇二甲磺酸酯(0.72 g， 2.1 mmol)、 K2C03 (2.27 g) 和DMF (30 mL)按照如上所述的合成類黃酮二聚物的一般步驟制備。在硅 膠(40 g)上快速柱層析(CH2Cl2中2%的MeOH)后，得到作為白色泡沫的標題化合物21d (0.93 g， 58%): &畫R (CDC13) 5 3.44 (s, 6H)， 3.67 (t, /= 1.6 Hz, 4H)， 3.69 (t， J= 1.6 Hz， 4H)， 3,83 (t， /= 4.4 Hz, 4H), 4.09 (t, /= 4.0 Hz， 4H)， 5.15 (s, 8H), 6.42 (d, J= 1.8 Hz, 2H), 6.49 (s, 2H), 6.67 (d, /= 1.8 Hz, 2H)， 6.92 (d，8.8 Hz, 4H), 7.25 (t，7.2 Hz, 2H), 7.36 (dd, /= 7.2, 7,6 Hz, 4H), 7.60 (d J= 7.6 Hz, 4H), 7.71 (d, 8.8 Hz, 4H); 13C NMR (CDC13) 5 56.4, 67.5, 69.5, 70.6， 70.6, 70.8, 94.3, 95.9, 98.6, 107.4， 110.0, 114.8， 123.7, 126.6， 127.5, 127.5: 128.5, 136.5, 159.3， 159.5, 160.6, 161.2, 177.2; L脂S (ESI) m/z 967 (M^ + H， 18), 989 (]VT + H, 100); HRMS (ESI) C56H55015 (M+ + H)的計算值為 967.3541，測定值為967.3568。得到作為淺黃色油狀物的標題化合物23b (0.27 g， 14%): 'H NMR (CDC13) S 3.00 (br, 1H), 3.44 (s， 3H), 3.56 (t, J= 4.2 Hz, 2H)， 3.62-3.69 (m， 10H), 3.82 (t， /= 4.5 Hz， 2H), 4.13 (t，4.5 Hz, 2H)， 5.17 (s， 2H)， 5.18 (s, 2H), 6.44 (d， 1.8 Hz， IH)， 6.53 (s, 1H), 6.70 (d， /= 1.8 Hz， 1H), 6.94 (d, J= 8.8 Hz, 2H)， 7.25 (t, 7.4 Hz, 1H), 7.35 (dd, J= 7.4， 7.6 Hz， 2H)， 7.59 (d, J= 7.6 Hz, 2H)， 7.74 (d, /= 8.8 Hz, 2H); 13C NMR (CDC13) 5 56.2, 61.4, 67.3， 69.3， 70.0， 70.3， 70.4， 70.4, 70.6, 72.4， 94.1， 95.8， 98.5， 107.2, 109.9, 114.7, 123.6, 126.4， 127.4， 128.3， 136.2， 159.2， 159.3， 160.6， 161.0， 161.1, 177.2。
1，16-二[4，-((5-芐氧基-7-甲氧基甲氧基)-4//-苯并吡喃-4-酮-2-基)苯 基]-l,4，7,10，13，16-六氧十六烷(21e):該化合物由12a (300 mg, 0.74 mmol)、 五乙二醇二甲磺酸酯(170 mg， 0.43 mmol)、 K2C〇3 (480 mg)和DMF (10 mL) 按照如上所述的合成類黃酮二聚物的一般步驟制備。在硅膠(15 g)上快速柱 層析(CH2Cl2中2。/。的MeOH)后，得到作為白色泡沫的標題化合物(160 mg， 43%): !HNMR (CDC13) 5 3.44 (s， 6H), 3.63隱3.68 (m, 12H), 3.81 (t, 4.2 Hz, 4H), 4.09 (t， ■/= 4.2 Hz, 4H), 5.15 (s, 8H), 6.42 (d， 7= 1.6 Hz, 2H), 6.49 (s, 2H), 6.67 (d, /= 1.6 Hz， 2H), 6.93 (d， /= 8.6 Hz, 4H), 7.26 (t, /= 6.8 Hz， 2H)， 7.36 (dd, 6.8, 7.4 Hz, 4H), 7.59 (d, J= 7.4 Hz, 4H), 7.71 (d, J= 8.6 Hz, 4H); 13C NMR (CDC13) 5 56.4， 67.5, 69.5, 70.5， 70.8, 94.3， 95.9， 98.6, 107.4， 110.0,
31114.8， 123.7, 126.6, 127.5, 127.5， 128,5， 128.6， 136.4， 159.3, 159.5, 160.6, 161.2， 177.3; L腹S (ESI) m/z 1011 (M+ + H， 4), 1033 (1VT + Na， 26); HRMS (ESI) C58Hs90!6(Nf + H)的計算值為1011.3803，測定值為1011.3793。
1,19_二[4，-((5-芐氧基-7-甲氧基甲氧基)-4界苯并吡喃-4-酮-2-基)苯 基]-l，4，7,10,13，16,19-七氧十九垸(21f):該化合物由12a (230 mg， 0.57 mmol)、 六乙二醇二甲磺酸酯(160 mg, 0.37 mmol)、 K2C03 (400 mg)和DMF (10 mL) 按照如上所述的合成類黃酮二聚物的一般步驟制備。在硅膠(15 g)上快速柱 層析(CH2Cl2中2%的MeOH)后，得到作為白色泡沫的標題化合物(160 mg, 53%): NMR (CDC13) 5 3.47 (s, 6H), 3.64 - 3.71 (m， 16H), 3.85 (t， 《/= 4.4 Hz, 4H)， 4.15 (t， 《/= 4.4 Hz， 4H)， 5.19 (s， 4H), 5.21 (s, 4H), 6.47 (d， 《/= 2.0 Hz, 2H)， 6.54 (s， 2H), 6,72 (d, J= 2.0 Hz, 2H), 6.97 (d, /= 8.8 Hz, 4H), 7.27 (t, J= 7.2 Hz, 2H)， 7.38 (dd, J= 7.2， 7.6 Hz， 4H)， 7.61 (d, J= 7.6 Hz, 4H)， 7.76 (d， 《/= 8.8 Hz, 4H); 13C NMR (CDC13) 5 56.4， 67.5， 69.5, 70.5， 70.6, 70.6, 70.8, 94.3， 95.9， 98.7， 107.5， 110.1， 114.9， 123.8, 126.6, 127.5, 128.5, 136.4， 159.4, 159.5, 160.6， 161.2， 177.3; L腹S (ESI) m/z 1055 (M+ + H, 11), 1077 (M+ + Na， 47); HRMS (ESI)C6oH62017Na(M+ + Na)的計算值為1077.3885，測定值為1077.3883。
1,22- 二 [4'-((5-芐氧基-7-甲氧基甲氧基)-4/f-苯并吡喃-4-酮-2-基)苯 基]-l,4,7，10,13，16,19,22-八氧二十二烷(21g):該化合物由12a (220 mg， 0.54 mmol)、七乙二醇二甲磺酸酯(160mg, 0.33mmol)、 K2C03 (370 mg)和DMF (10 mL)按照如上所述的合成類黃酮二聚物的一般步驟制備。在硅膠(15 g) 上快速柱層析(CH2Cl2中4%的MeOH)后，得到作為白色泡沫的標題化合物 (160 mg, 54%): 'H NMR (CDC13) 5 3.44 (s， 6H), 3.61 - 3.69 (m, 20H)， 3.82 (t， ■/= 4.2 Hz， 4H)， 4.12 (t, J= 4.2 Hz, 4H), 5.17 (s, 4H)， 5.18 (s， 4H)， 6.44 (d， J= 1.6 Hz, 2H)， 6.51 (s, 2H)， 6.69 (d, 1.6 Hz, 2H), 6.94 (d, /= 8.6 Hz, 4H)， 7.25 (t， /= 6.8 Hz, 2H)， 7.36 (dd, /= 6.8, 7.0 Hz, 4H), 7.60 (d， J= 7.0 Hz， 4H), 7.34 (d， J= 8.6 Hz， 4H); 13C鹿R (CDC13) 5 56.4， 67.5, 69.5， 70.5, 70.5， 70.8, 94.3,
3295.9， 98.6， 107.4, 110.1， 114.8， 123.7, 126.6, 127,5， 128.5, 128.7, 136.4, 159.3, 159.5， 160.6, 161.2， 177.3; L固S (ESI) m/z 1099 (M" + H， 7), 1121 + Na， 31); HRMS (ESI) C62H66018Na (M+ + Na)的計算值為1121.4147，測定值為 1121.4132。
1,25-二[4'-((5-芐氧基-7-甲氧基甲氧基)-4樂苯并吡喃-4-酮-2-基)苯 基]-l,4,7,10,13,16，19，22,25-九氧二十五垸(21h):該化合物由12a (250 mg, 0.62mmol)、八乙二醇二甲磺酸酯(200 mg, 0.38 mmol)、 K2C03 (420 mg)禾口 DMF(IO mL)按照如上所述的合成類黃酮二聚物的一般步驟制備。在硅膠(15 g)上快速柱層析(CH2Cl2中4%的MeOH)后，得到作為白色泡沫的標題化合 物(170 mg, 48%): & NMR (CDC13) 5 3.43 (s， 6H)， 3.59匿3.67 (m， 24 H), 3.80 (t， 4.8 Hz, 4H)， 4.10 (t, J= 4.8 Hz, 4H), 5.15 (s， 4H)， 5.16 (s, 4H), 6.43 (d， /= 2.0 Hz, 2H), 6.50 (s， 2H), 6.68 (d, 2.0 Hz， 2H), 6.92 (d， 9.2 Hz， 4H), 7.25 (t, /= 7.6 Hz, 2H)， 7.34 (dd, /= 7.6， 7.2 Hz, 4H), 7.59 (d， 《/= 7.2 Hz， 4H), 7.72 (d, /= 9.2 Hz, 4H); 13C NMR (CDC13) 5 56.4, 67.5， 69.4, 70.5, 70.5, 70.8, 94.3, 95.9， 98.6, 107.4, 110.1， 114.8， 123.7, 126.5， 127.5， 128.5, 136.4, 159.3, 159.5， 160.6, 161.2, 161.2, 177.2; LRMS (ESI) m/z 1144 (M++ H, 3), 1166 (M+ + Na， 21); HRMS (ESI) C64H70O19Na (]Vf + Na)的計算值為1165.4409，測定 值為1165.4424。
1,28-二[4，-((5-芐氧基-7-甲氧基甲氧基)-4//-苯并吡喃-4-酮-2-基)苯 基]-l,4,7，10,13,16，19，22,25，28-十氧二十八烷(21i):該化合物由12a (240 mg, 0.59mmol)、九乙二醇二甲磺酸酯(210 mg， 0.37 mmol)、 K2CO3(410mg)禾口 DMF (10 mL)按照如上所述的合成類黃酮二聚物的一般步驟制備。在硅膠 (15 g)上快速柱層析(CH2Cl2中4%的MeOH)后，得到作為白色泡沬的標題化 合物(180 mg， 51%):H NMR (CDC13) 5 3.42 (s， 6H)， 3.58 - 3.66 (m， 28H)， 3.80 (t, J= 4.6 Hz, 4H), 4.10 (t， /= 4.6 Hz, 4H), 5.14 (s, 4H)， 5.15 (s, 4H), 6.42
33(d， /= 2.0 Hz， 2H)， 6.48 (s， 2H), 6.67 (d, /= 2.0 Hz, 2H)， 6.91 (d, /= 8.8 Hz, 4H) 7.23 (t， J= 7.6 Hz， 2H), 7.33 (t, /= 7.6 Hz， 4H), 7.59 (d， /= 7.6 Hz, 4H)， 7.71 (d， J= 8.8 Hz， 4H); 13C NMR (CDC13) S 56.3, 67.5, 69.4, 70.5， 70.5, 70.8， 94.2， 95.9, 98.6, 107.4， 110.1, 114.8， 123.7， 126.5, 127.5， 128.5， 136.4， 159.3， 159.5， 160.6， 161.2, 161.2, 177.2; LRMS (ESI) m/z 1188 (M^ + H， 3)， 1210 (W + Na， 23); HRMS (ESI) C66H7502Q (M+ + H)的計算值為1187.4852，測定值為 1187.4825。
化合物21a至21i和23a至23b氫解的一般步驟將化合物21或23、 催化量的10%活性炭載鈀和氯仿添加至圓底燒瓶中。在氣球壓力的氫氣氛 圍下于室溫將該反應混合物劇烈攪拌12小時。當TLC顯示起始物質完全消 耗后，通過吸濾去除炭。通過流經短硅膠墊純化淺黃色濾液，得到脫保護 產物。
1,4-二[4，-((5-羥基-7-甲氧基甲氧基)-4//-苯并吡喃-4-酮-2-基)苯基]-1，4-二氧丁烷(22a):該化合物由21a (64 mg， 0.08 mmol)、 10%炭載鈀(15 mg)禾口 氯仿(IO mL)按照如上所述的氫解的一般步驟制備。得到作為白色固體的標 題化合物(43 mg, 86%): m.p.: 206 - 207 。C; 畫R (CDC13) 5 3.51 (s， 6H)， 4.44 (s, 4H), 5.24 (s, 4H)， 6.47 (d， 2.0 Hz, 2H)， 6.59 (s， 2H), 6.66 (d, 2.0 Hz, 2H), 7.07 (d, J= 8.8 Hz, 4H), 7.86 (d， J= 8.8 Hz, 4H)， 12.73 (s, 2H); 13C NMR (CDC13) S 56.4， 66.5， 94.2， 94.3， 100.1, 104.5， 106.2， 115.1, 124.0, 128.1, 157.5, 161.5， 162.0， 162.9, 163.9， 182.5; L腹S (ESI) m/z 655 (M+ + H, 14)， 677 (Nf + Na, 8); HRMS (ESI)的計算值為C36H31012 (M++ H) 655.1816，測 定值為655.1845.
1,7- 二 [4'-((5-羥基-7-甲氧基甲氧基)-4界苯并吡喃-4-酮-2-基)苯 基]-l，4,7-三氧庚烷(22b): i亥化合物由21b (88 mg, 0.10 mmol)、 10%炭載鈀(18 mg)和氯仿(IO mL)按照如上所述的氫解的一般步驟制備。得到作為白 色固體的標題化合物(60mg， 86%): m.p.: 171-172°C; 'HNMR(CDCb) S 3.50 (s, 6H)， 3.98 (t， 《/= 4.4 Hz， 4H)， 4.24 (t， J= 4.4 Hz, 4H)， 5.23 (s， 4H), 6.44 (d， J= 1.6 Hz， 2H), 6.55 (s， 2H)， 6.62 (d， J= 1.6 Hz, 2H), 7.00 (d, 9.0 Hz, 4H), 7.79 (d， J=9.0 Hz, 4H), 12.63 (s, 2H); 13C NMR (^-DMSO) 5 56.5, 68.0, 69,3, 94.3, 94.9， 99.8， 104.1， 105,6， 115.5， 123.0， 128.8, 157.4, 161.5， 162.1， 162.9， 164.1, 182.4; LRMS (ESI) m/z 699 (W + H, 5)， 721 (M+ + Na， 3); HRMS (ESI) C3sH35C^(Nf + H)的計算值為699.2078，測定值為699.2079。
1,10-二[4，-((5-羥基-7-甲氧基甲氧基)-4//-苯并吡喃-4-酮-2-基)苯基]-1，4，7，10-四氧癸烷(22c):該化合物由21c (96 mg, 0.10 mmol)、 10%炭載鈀(15 mg)和氯仿(10mL)按照如上所述的氫解的一般步驟制備。得到作為淺黃色 固體的標題化合物(62 mg, 80%): m.p.: 159-160°C; 'HNMR(CDC13) S 3.39 (s， 6H), 3.62 (d, J= 4.0 Hz， 4H), 3.76 (t， J"= 4.6 Hz, 4H)， 4.17 (t， J= 4.6 Hz， 4H)， 5.28 (s, 4H), 6.37 (d， 2.0 Hz， 2H)， 6.76 (d, J= 2.0 Hz， 2H), 6.87 (s， 2H), 7.06 (d, J= 8.8 Hz， 4H), 7.96 (d， J= 8.8 Hz, 4H), 12.85 (s, 2H); 13C NMR (d6-DMSO) S 56.3， 67.8, 69.0， 70.3, 94.2, 94.7， 99.6， 103.9, 105.4， 115.2， 122.8, 128.6， 157.2， 161.4, 161.9, 162.7， 163.8， 182.2; LRMS (ESI) m/z 743 + H， 9); HRMS (ESI) C4oH390!4(lVr + H)的計算值為743.2340，測定值為743.2343。
1，13-二[4'-((5-羥基-7-甲氧基甲氧基)-4//-苯并吡喃-4-酮-2-基)苯基]-1，4，7,10，13-五氧十三烷(22d):該化合物由21d (930 mg, 0.96 mmol)、 10。/。炭 載鈀(88 mg)和氯仿(20mL)按照如上所述的氫解的一般歩驟制備。得到作為 白色泡沫的標題化合物(710 mg, 94%): NMR (CDC13) 5 3.39 (s, 6H)， 3.55 -3.59 (m, 8H)， 3.76 (t， J= 4.6 Hz, 4H), 4.13 (d， J= 4.6 Hz， 4H)， 5.28 (s, 4H), 6.37 (d, /= 2.0 Hz, 2H)， 6.75 (d, 2.0 Hz, 2H)， 6.85 (s， 2H)， 7,04 (d， J= 8.8 Hz, 4H)， 7.95 (d， 8.8 Hz， 4H)， 12.84 (s， 2H); 13C NMR (d6-DMSO) S 56.3, 56.3， 67.8, 69.0, 70.2， 94.2, 94.7， 99.6， 103.9， 105.4， 115.2， 122.8， 128.6, 157.1, 161.4，161.9, 162.7, 163.8， 182.2; L腿S (ESI) m/z 787 (M+ + H, 57), 809 (M十+ Na, 60); HRMS (ESI) C42H43015 (M+ + H)的計算值為787.2602，測定值為 787.2591。
1,16_二[4，-((5-羥基-7-甲氧基甲氧基)-4^-苯并吡喃-4-酮-2-基)苯基]-1，4,7,10，13,16-六氧十六垸(22e): i亥化合物由21e (75 mg, 0.07 mmol)、 10%炭 載鈀(12 mg)和氯仿(lOmL)按照如上所述的氫解的一般步驟制備。得到作 為白色泡沬的標題化合物(52 mg， 84o/0): & NMR (CDC13) S 3.48 (s, 6H)， 3.66 畫3.73 (m, 12H)， 3.87 (t， 4.6 Hz, 4H)， 4.17 (t, J =4.6 Hz, 4H), 5.22 (s， 4H)， 6.42 (d, J= 2.0 Hz， 2H), 6.52 (s， 2H), 6.61 (d, /= 2.0 Hz， 2H)， 6.97 (d, J= 9.0 Hz， 4H)， 7.77 (d， J= 9.0 Hz, 4H)， 12.72 (s， 2H); 13C NMR (CDC13) S 56.4, 67.0, 67.6， 69.5， 70.6， 70.8, 94.1， 94.2， 100.0, 104.2， 106.1， 115.0, 123.4, 127.9， 157.4， 161.7， 161.9， 162.8, 163.9, 182.4; L腹S (ESI) m/z 831 (M4 + H， 35), 853 (M+ + Na， 100); HRMS (ESI) C44H46016Na + Na)的計算值為853.2684，測定 值為853.2677。
1,19-二[4，-((5-羥基-7-甲氧基甲氧基)-4//-苯并吡喃-4-酮-2-基)苯基]-1,4，7,10,13，16，19-七氧十九烷(22f):該化合物由21f (76 mg, 0.07 mmol)、 10% 炭載鈀(19 mg)和氯仿(10 mL)按照如上所述的氫解的一般步驟制備。得到作 為白色泡沫的標題化合物(52 mg, 83%): ''H—NMR (CDCi3) S 3.47 (s, 6H)， 3.64 -3.72 (m, 16H), 3.85 (t， 《/= 4.6 Hz, 4H), 4.15 (t， /=4.6 Hz, 4H), 5.20 (s, 4H)， 6.40 (d， 2.0 Hz， 2H), 6.49 (s， 2H)， 6.58 (d， J= 2.0 Hz， 2H)， 6.95 (d， /= 8.8 Hz， 4H)， 7.74 (d, /= 8.8 Hz, 4H), 12.70 (s, 2H); 13C麗R (CDC13) S 56.3, 66.9， 67.5, 69.4, 70.4， 70.5， 70.7， 94.1， 94.1, 99.9， 104.1, 106.0， 114.9, 123,3， 127.8, 157.3， 161.7, 161.8, 162.7， 163.8, 182.3; L畫S (ESI) m/z 875 (M+ + H, 28), 897 (M+ + Na， 100); HRMS (ESI) C46H50O17Na (M+ + Na)的計算值為 897.2946，測定值為897.2936。1 ，22- 二 [4'-((5-羥基-7-甲氧基甲氧基)-4W-苯并吡喃-4-酮-2-基)苯 基]-l，4，7，10，13，16,19,22-八氧二十二烷(22g):該化合物由21g (102 mg， 0,09 mmol)、 10%炭載鈀(21 mg)和氯仿(10 mL)按照如上所述的氫解的一般步驟 制備。得到作為白色泡沫的標題化合物(78 mg， 91%): & NMR (CDC13) S 3.45 (s， 6H)， 3.61-3.70 (m， 20H), 3.84 (t, 4.6 Hz， 4H)， 4.12 (t， J=4.6 Hz， 4H)， 5.18 (s, 4H), 6.38 (d, 2.0 Hz， 2H)， 6.47 (s， 2H)， 6.56 (d, 2.0 Hz, 2H), 6.93 (d， 9.0 Hz， 4H), 7.72 (d, J= 9.0 Hz, 4H)， 12.70 (s, 2H); 13C NMR (CDC13) 5 56.3, 67.6， 69.4, 70.5， 70.5， 70.8， 94.1， 94.2， 99,9， 104.1, 106.0, 114.9， 123.3， 127.9， 157.4， 161.8, 161.8, 162.8， 163.9, 182.3; LRMS (ESI) m/z 919 (M+ + H， 5)， 941 (M+ + Na, 100); HRMS (ESI) C48H54018Na (MT + Na)的計算值為 941.3208，測定值為941.3188。
1,25-二[4，-((5-羥基-7-甲氧基甲氧基)-4/f-苯并吡喃-4-酮-2-基)苯基]-l,4，7,10,13，16,19,22,25-九氧二十五烷(22h): i亥化合物由21h (89 mg， 0.08 mmol)、 10%炭載鈀(16 mg)和氯仿(10 mL)按照如上所述的氫解的一般步驟 制備。得到作為白色泡沫的標題化合物(62 mg， 83°/。) NMR (CDC13) S 3.50 (s， 6H)， 3.68-3.75 (m， 24H)， 3.87 (t， J" = 4.6 Hz， 4H), 4.18 (t，聲4.6 Hz, 4H), 5.23 (s, 4H)， 6.44 (d， /= 2.0 Hz， 2H), 6.54 (s， 2H)， 6.62 (d， 《/= 2.0 Hz， 2H), 6.98 (d, /= 8.8 Hz, 4H), 7.78 (d, /= 8.8 Hz, 4H), 12.72 (s, 2H); 13C NMR (CDC13) 5 56.4， 56.4， 67.6, 69.5， 70.2， 70.3， 70.4, 70.7， 94.2， 94.3， 100.0， 104.3, 106.1， 115,0, 123.5， 128.0, 157.4， 161.7, 161.9， 162.9, 163.9， 182.4; L脂S (ESI) m/z 963 (M+ + H， 50), 985 (M+ + Na， 100); HRMS (ESI) C5。H59019 (M+ + H)的計算 值為963.3651，測定值為963.3637。
1,28-二[4，-((5-羥基-7-甲氧基甲氧基)-4ff-苯并吡喃-4-酮-2-基)苯基]-1，4，7,10，13，16,19,22,25，28-十氧二十八烷(22i):該化合物由黃酮21i (120 mg， 0.10 mmol)、 10%炭載鈀(28 mg)和氯仿(10 mL)按照如上所述的氫解的一般步驟制備。得到作為白色泡沫的標題化合物(92mg，90%): iHNMR(CDCl3) S 3.39 (s, 6H)， 3.53 - 3.63 (m， 28H)， 3.77 (t, /= 4.6 Hz， 4H), 4,04 (t, 7=4.6 Hz， 4H)， 5.11 (s， 4H), 6.28 (d, /= 1.8 Hz， 2H)， 6.37 (s, 2H), 6.47 (d, J= 1.8 Hz， 2H)， 6.84 (d, J= 8.8 Hz， 4H)， 7.62 (d， /= 8.8 Hz， 4H), 12.63 (s， 2H); 13C NMR (CDC13) S 56.0, 57.2, 69.1， 70.1， 70.2， 70.4， 93.8， 93.8， 99.5, 103.6， 105.6， 114.6: 122.8， 127.5, 156.9， 161.4， 161.5, 162.4， 163.5， 181.9; L固S (ESI) m/z 1007 (M+ + H, 10), 1029 (M+ + Na， 58); HRMS (ESI) C52H6202()Na (M十+ Na)的計算 值為1029.3732，測定值為1029.3696。
9-[4，-((5-羥基-7-甲氧基甲氧基)-4//-苯并吡喃-4-酮-2-基)苯基]-3，6,9,匿 三氧壬烷-l-醇(24a):該化合物由23a(48mg, 0.09mmol)、 10。/o炭載鈀(8mg) 和氯仿(IO mL)按照如上所述的氫解的一般步驟制備。得到作為淺黃色固體 的標題化合物(32mg, 80%): m.p.: 57-59°C;NMR (CDC13)S 3.49 (s,3H)， 3.62 (t， J= 4.2 Hz, 2H)， 3.70 - 3.75 (m， 6H), 3.89 (t, J= 4.7 Hz， 2H)， 4.20 (t，
4.7 Hz, 2H), 5.23 (s， 2H)， 6.45 (d, J= 2.0 Hz， 1H), 6.56 (s， 1H), 6.64 (d, J= 2.0 Hz， 1H), 7.00 (d, 8.8 Hz, 2H)， 7.81 (d, 8.8 Hz, 2H); l3C畫R (CDC13) S 56.2， 61.5， 67.4, 69.3, 70.1， 70.7， 72.3, 94.0， 94.1, 99.9, 104.1， 106.0, 114.8， 123.4， 127.8， 157.3， 161.6, 161.8, 162.3， 163.9， 182.3; L腿S (EI) m/z 446 (M+, 100); HRMS (EI) C23H2609 (M+)的計算值為446.1577，測定值為446.1570。
12-[4，-((5-羥基-7-甲氧基甲氧基)-4界苯并吡喃-4-酮-2-基)苯 基〗-3,6，9，12-四氧十二烷-l-醇(24b):該化合物由23b (150 mg， 0.26 mmol)、 10%炭載鈀(22 mg)和氯仿(20 mL)按照如上所述的氫解的一般步驟制備。得 到作為淺黃色油狀物的標題化合物(122 mg, 96%):NMR (CDC13) S 3.44 (s， 3H), 3.56 (t, ■/= 4.2 Hz， 2H), 3.62 - 3.69 (m， IOH)， 3.82 (t， J= 4.5 Hz， 2H), 4.13 (t, J= 4.5 Hz, 2H), 5.18 (s, 2H), 6,44 (d, J= 1.8 Hz, IH)， 6.53 (s, 1H), 6.70 (d, /=
1.8 Hz, 1H), 6.94 (d, /= 8.8 Hz， 2H), 7.74 (d， /= 8.8 Hz, 2H); 13C NMR (CDC13) S 56.2， 61.4， 67.3, 69.3, 70.0， 70.3， 70.4， 70.4, 70.6， 72.4， 94.1， 95.8, 98.5， 107.2，
38126.4， 127.4， 128,3， 136.2， 159.2, 159.3， 160.6, 161.0， 161.1， 177.2; LRMS (EI) m/z 490 (W， 100); HRMS (EI) C^H^Ojo (W)的計 算值為490.1839，測定值為490.1828。
22a至22i的MOM基團脫保護的一般步驟方法A:將化合物22和 75。/。AcOH添加至圓底燒瓶中。將該反應混合物在回流溫度攪拌14小時。 當TLC顯示22完全消耗時，將該反應混合物冷卻至0。C，并添加冰水。通 過吸濾收集所形成的米白色固體。方法B:將化合物22、 6MHC1溶液和 THF添加至圓底燒瓶中。將該反應混合物在室溫攪拌15分鐘。當TLC顯 示22完全消耗時，將反應混合物倒入含水的分液漏斗中。以EtOAc(20mL X3)萃取該混合物。將合并的有機層用MgS04干燥，過濾并蒸發，得到 粗品混合物。通過流經短硅膠墊純化所述粗品混合物，得到所需的產物。
1，4-二[4，-((5，7-二羥基)-4if-苯并吡喃-4-酮-2-基)苯基]-l,4-二氧丁烷 (9a):該化合物由化合物22a (43 mg, 0.07 mmol)和75%乙酸(20 mL)按照上 述方法A制備。得到作為淺綠色固體的標題化合物(26 mg, 70%): m.p.: 352-355°C; & NMR (>/6-DMSO) 5 4.46 (s, 4H), 6.19 (d, 1.6 Hz, 2H)， 6.50 (d, J= 1.6 Hz， 2H)， 6.88 (s, 2H), 7.17 (d， /= 8.4 Hz， 4H), 8.04 (d, ■/= 8.4 Hz, 4H), 10.85 (s, 2H)， 12.90 (s, 2H); 13C NMR (CDC13) S 67.0, 94.5， 99.3, 104.1, 104.2, 115.5, 123.4, 128.8， 157.8, 161.7, 161.9, 163.6, 164.7， 182.2; LRMS (EI) m/z 566 (1Vf， 11); HRMS (ESI) C32H2301Q (M+ + H)的計算值為567.1291 ，測定值 為567.1268。
1,7-二[4，-((5，7-二羥基)-4界苯并吡喃-4-酮-2-基)苯基]-1,4，7-三氧庚烷 (9b):該化合物由化合物22b (57 mg, 0.08 mmol)和75%乙酸(25 mL)按照上 述方法A制備。得到作為米白色固體的標題化合物(42 mg， 84%): m.p.: 268-270。C; 'H NMR (^-DMSO) 5 3.85 (s, 4H), 4.22 (s, 4H), 6.16 (d, 1,8 Hz,
392H)， 6.46 (d, /= 1.8 Hz, 2H), 6.84 (s, 2H), 7.09 (d， J= 8.8 Hz, 4H), 7.98 (d, J = 8.8 Hz， 4H), 10.82 (s， 2H), 12.98 (s, 2H); 13C NMR (^誦DMSO) 5 68.0， 69,3， 94.4， 99.3， 103.9， 104.2, 115.4, 123.3， 128.7， 157.7, 161.9, 161.9, 163.6, 164.6, 182.2; LRMS m/z 611 (M"" + H， 8), 633 (M+ + Na， 3); HRMS: C^EbOu (M+ + H)的計算值為611.1553，測定值為611.1542。
1,10-二[4'-((5，7-二羥基)-4&苯并吡喃-4-酮-2-基)苯基]-1,4,7,10-四氧癸 烷(9c):該化合物由化合物22c (62 mg， 0.08 mmol)和75%乙酸(25 mL)按照 上述方法A制備。得到作為淺黃色固體的標題化合物(43 mg， 79%): m.p.: 143-145°C; !H NMR DMSO) 5 3.81 (s， 4H)， 3.95 (s, 4H), 4.36 (s, 4H)， 6.35 (d， J= 1.0 Hz, 2H), 6.64 (d, 1.0 Hz， 2H), 7.01 (s, 2H), 7.27 (d， 8.8 Hz, 4H), 8.16 (d， J= 8.8 Hz, 4H)， 11.00 (s， 2H)， 13.08 (s, 2H); 13C NMR (d6-DMSO) 5 67.8, 69.0, 70.2, 94.2， 99.1， 103.7， 104.0, 115.2, 123.0， 128.5, 157.5， 161.7， 161.8， 163.4， 164.4， 182.0; L腹S (ESI) m/z 655 (M十+ H, 15); HRMS (ESI) C36H^O,2(W + H)的計算值為655.1816，測定值為655.1816。
1，13-二[4，-((5，7-二羥基)-4樂苯并吡喃-4-酮-2-基)苯基]-l,4,7，10，13-五氧 十三垸(9d):該化合物由化合物22d (720 mg， 0.92 mmol)、 6M HC1溶液(70 mL)和THF (50 mL)按照上述方法B制備。得到作為淺黃色固體的標題化合 物(62。 mg， 97%》m.p.: 131-133。C;HNMR械-DMSO) S 3.54-3,58 (m, 8H)， 3.75 (t， /= 4.4 Hz, 4H)， 4.15 (t， /= 4.4 Hz， 4H)， 6.16 (d， /= 2.0 Hz， 2H)， 6.45 (d， /= 2.0 Hz， 2H)， 6.81 (s， 2H)， 7.07 (d， 8.8 Hz, 4H), 7.96 (d, 8.8 Hz， 4H)， 10.81 (s, 2H)， 12.88 (s， 2H); 13C NMR "-DMSO) S 68.0， 69.2, 70.3， 70.4， 94,4， 99.3, 103.9, 104.2, 115.4, 123.2, 128.7， 157.7, 161.8, 161.9, 163.6, 164.6, 182.2; LRMS (ESI) m/z 699 (JVT + H, 33)， 721 (M+ + Na， 58); HRMS (ESI) C38H35013Na(M+ + Na)的計算值為721.1897，測定值為721.1896。
1，16-二[4，-((5,7-二羥基)-4界苯并吡喃-4-酮-2-基)苯基]-1，4,7，10，13,16-六氧十六烷(9e):該化合物由化合物22e(48mg, 0.06mmol)、 6M HC1溶液 (20 mL)和THF (20 mL)按照上述方法B制備。得到作為淺黃色泡沫的標題 化合物(37 mg, 86%); !H兩R (^6-丙酮)S 3.59 - 3.65 (m, 12H)， 3.83 (t, J= 4.6 Hz, 4H), 4.20 (t, /= 4.6 Hz, 4H)， 6.22 (d， 2.0 Hz， 2H)， 6.51 (d， /= 2.0 Hz， 2H), 6.63 (s, 2H), 7.09 (d, /= 8.8 Hz, 4H)， 7.95 (d， 8.8 Hz， 4H)， 12.90 (s， 2H); 13C NMR (^畫丙酮)5 67.8, 69.2， 70.4， 70.5, 93.8, 98.8， 103.6, 104,4， 115.0， 123.4， 128.1， 157.8, 162.0， 164.0, 164.6， 182.2; L函S (ESI) m/z 743 (W + H, 34), 765 (W + Na, 100); HRMS (ESI) C40H38O14Na (M+ + Na)的計算值為 765.2159，測定值為765.2164。
1，19- 二 [4，-((5，7- 二羥基)-4//-苯并口比喃-4-酮-2-基)苯 基]-l，4，7,10，13,16，19-七氧十九烷(9f):該化合物由化合物22f (45 mg, 0.05 mmol)、 6M HC1溶液(20 mL)和THF (20 mL)按照上述方法B制備。得到作 為淺黃色泡沫的標題化合物(36 mg， 89%): ^NMR(4-丙酮)S 3.56 - 3.65 (m, 16H)， 3.81 (t， 4.6 Hz, 4H), 4.17 (t， 《/= 4.6 Hz, 4H)， 6.22 (d， 2.0 Hz, 2H), 6.48 (d， /= 2.0 Hz, 2H), 6.57 (s, 2H), 7.02 (d, /= 8.8 Hz, 4H)， 7.88 (d, 8.8 Hz， 4H), 12.88 (s， 2H); 13C NMR (^-丙酮)S 67.7， 69.2, 70.3， 70.3, 70.5， 93.9, 98.8， 103.5, 104.4, 114.9, 123.3， 128.0, 157.6, 162.0， 162.3, 163.6, 163.9, 182.0; LRMS (ESI) m/z 809 (M+ + Na， 15); HRMS (ESI) C42H43015 (M+ + H)的計算 值為787.2602，測定值為787.2614。
1,22- 二 [4，-((5,7- 二羥基)-4//-苯并吡喃-4-酮-2-基)苯 基]-l，4，7，10，13，16,19,22-八氧二十二烷(9g):該化合物由化合物22g (65 mg， 0.07 mmol)、 6M HC1溶液(20 mL)和THF (20 mL)按照上述方法B制備。得 到作為淺黃色泡沫的標題化合物(58mg, 99%): ^NMR"-丙酮)S3,54-3.65 (m， 20H), 3.81 (t, 4.6 Hz, 4H), 4.18 (t， 4.6 Hz， 4H)， 6.23 (d, J= 2.0 Hz, 2H), 6.49 (d， /= 2.0 Hz, 2H), 6.59 (s， 2H), 7.04 (d， /= 9.0 Hz， 4H), 7.卯(d，
41J= 9.0 Hz， 4H)， 12.90 (s， 2H); 13C NMR (^-丙酮)S 67.7， 69.2， 70.3， 70.3, 70.5 93.9， 98.8, 103.6， 104.4, 114.9, 123.3， 128.0, 157.8, 162,0， 162.0, 163.6， 163.9, 182.0; LRMS (ESI) m/z 853 (M4 + Na, 36); HRMS (ESI) C44H47016 (M+ + H)的 計算值為831.2864，測定值為831.2889。
1，25- 二 [4'-((5,7- 二羥基)-4//-苯并吡喃-4-酮-2-基)苯基]-1,4,7，10，13，16，19，22,25-九氧二十五烷(9h):該化合物由化合物22h (50 mg， 0.05mmol)、 6M HC1溶液(20 mL)和THF (20 mL)按照上述方法B制備。得 到作為淺黃色泡沫的標題化合物(42 mg, 92%): NMR (4_丙酮)S 3.53 -3.65 (m, 24H), 3.83 (t， J= 4.6 Hz, 4H)， 4.19 (t， 4.6 Hz， 4H), 6.23 (d, 2.0 Hz， 2H)， 6.51 (d， 2.0 Hz, 2H)， 6.62 (s, 2H), 7.07 (d， /= 9.0 Hz, 4H), 7.94 (d， /= 9.0 Hz, 4H)， 12.88 (s， 2H); 13C NMR (^-丙酮)5 67.8， 69.2， 70.3, 70.3, 70.5， 93.9, 98.8, 103.6， 104.4, 115.0, 123.3， 128.0， 157.6, 162,0， 162.3， 163.7， 163.9, 182.0; LRMS (ESI) m/z 875 (M+ + H， 3), 897 (M+ + Na, 100); HRMS (ESI) 046: 51017(^4+ + : )的計算值為875.3126，測定值為875.3145。
1，28- 二 [4，-((5，7- 二羥基)-4//-苯并吡喃-4-酮-2-基)苯基]-1,4,7,10，13，16，19，22,25，28-十氧二十八垸(9i):該化合物由化合物22i (78 mg， O.OSmmol)、 6M HCl溶液(20 mL)和THF (20 mL)按照上述方法B制備。得 到作為淺黃色油狀物的標題化合物(69 mg, 97%): ''H NMR (^-丙酮)3 3.53 -3.64 (m, 28H), 3.80 (t， J= 4.6 Hz， 4H)， 4.15 (t, 4.6 Hz, 4H)， 6.23 (d， 2.0 Hz, 2H), 6.48 (d， J= 2.0 Hz， 2H), 6.57 (s， 2H), 7.02 (d, J= 8.8 Hz, 4H)， 7.88 (d， J= 8.8 Hz, 4H)， 12.94 (s, 2H); 13C NMR (^-丙酮)S 67.7， 69.2， 70.3, 70.3， 70.5， 93.9, 98.9， 103.5， 104.4, 114.9, 123.2， 128.0, 157.7, 162.0， 162.3, 163.6, 164.0, 182.0; LRMS (ESI) m/z 919 (M+ + H, 4), 941 (M+ + Na, 100); HRMS (ESI) C48H55018 (M+ + H)的計算值為919.3388，測定值為919.3399。
429-[4，-((5，7-二羥基)-4//-苯并吡喃-4-酮-2-基)苯基]-3，6，9，-三氧壬烷-1-醇 (10a):該化合物由化合物24a(28mg， 0.06mmol)、 6M HC1溶液(IO mL)和 THF (10 mL)按照上述方法B制備。得到作為淺黃色固體的標題化合物(19 mg, 75%): m.p.: 135-137°C; NMR (4-固SO) 5 3.40 (t, J= 4.8 Hz, 2H)， 3,45 - 3.59 (m, 6H), 3.75 (t， 4.4 Hz， 2H), 4.18 (t， /= 4.4 Hz, 2H), 4.57 (t, /= 5.2 Hz, 1H)， 6.18 (d, 2.0 Hz, 1H)， 6.48 (d, J= 2.0 Hz, 1H)， 6.86 (s， 1H), 7.10 (d, 8.8 Hz, 2H)， 8.00 (d， 8.8 Hz, 2H), 10.85 (br, 1H)， 12.91 (s, 1H); 13C NMR 04-DMSO) S 60.6， 68.0， 69.2, 70.2， 70.4， 72.8， 94.4， 99.3, 103.9, 104.2， 115.4, 123.2， 128.7， 157.7， 161.8， 162.0, 163.7， 164.6， 182.2; L固S (EI) m/z 402 (M+, 100); HRMS (EI) C^H220s(M+)的計算值為402.1315，測定值為 402,1297。
12-[4，-((5，7-二羥基)-4界苯并吡喃-4-酮-2-基)苯基]-3,6，9，12-四氧十二垸 -I-醇(lOb):該化合物由化合物24b (80mg, 0.16 mmol)、6MHC1溶液(10mL) 和THF (10 mL)按照上述方法B制備。得到作為淺黃色油狀物的標題化合物 (65 mg, 89%): iHNMR(CDCl3)5 3.61 (t,Xl Hz， 2H), 3.68 - 3.75 (m， IOH)， 3.84 (t, /= 4.4 Hz， 2H)， 4.05 (t, 4.4 Hz, 2H), 6.21 (d, 2.0 Hz， 1H), 6.28 (d, J= 2.0 Hz, IH)， 6.35 (s， IH)， 6.74 (d, /= 8.8 Hz, 2H), 7.52 (d, J= 8.8 Hz， 2H); 13C NMR (CDC13) 5 61.4， 67,2， 69.4， 69.8, 70.4， 70.4, 70.4， 72.2， 94.2， 99.4， 103,1, 104.4, 114.4, 122.7, 127.3， 157.3， 161.2， 161.5， 163.3， 181.9; LRMS (EI) m/z 446 (M+， 97); HRMS (EI) C23H2609 (M+)的計算值為446.1577，測定值為 446.1574。
通過路線A制備化合物9j(n=10):將固體碳酸鉀(6mmo])和4-羥基苯甲 醛(2.2 mmol)添加至攪拌著的二甲磺酸酯13b(n=10) (1 mmol)的乙腈(5 mL/mmol)溶液中，并將所得的反應混合物在8(TC加熱16小時。之后，過 濾反應液，并以二氯甲垸洗滌固體。在減壓下蒸發二氯甲烷/乙腈母液，快
43速柱層析(EtOAc)后得到作為無色油狀物的二醛llj (n=10) (61°/。)。 & NMR (CDC13， 400 MHz): 3.6 3.75 (m， 32H), 3.87 (m， 4H)， 4.20 (m, 4H)， 7.01 (d， /= 8.5 Hz, 4H), 7.81 (d， ■/= 8.5 Hz, 4H)， 9,87 (s, 2H); 13C NMR (CDC13, 100固z): 67.68， 69.40, 70.47， 70.52, 70.81， 114.83， 130.0， 131.92, 163.82, 190.82; ES-MS C34H51013 (MH")的計算值為667.3330，測定值為667.3345。
將60% (重量/體積)的KOH溶液(0.25 mL/mmol)添加至攪拌著的二醛 llj (n=10) (1 mmol)和2,4-二芐氧基-5-羥基苯乙酮(2.1 mmol)的THF溶液 (0.25mL/mmol)中。將所得的溶液在室溫攪拌16小時。之后，將該反應混 合物倒入水中，并以乙酸乙酯反復洗滌，直至有機層保持無色為止(通常 洗滌三次)。將合并的有機層干燥(MgS04)，過濾并減壓蒸發，提取至EtOAc 并真空濃縮之后，得到作為黃色油狀物的查耳酮16〗(11=10)(產率>95%)。不 經任何純化將其立即用于下一步。"HNMR (CDC13, 400 MHz): 3.60-3.75 (m, 36H), 3.78 (m， 4H), 4.13 (m， 4H)， 5.06 (s， 4H), 5.10 (s, 4H), 6.16 (d, 2 Hz, 2H)， 6.21 (d, 2 Hz， 2H)， 6.70 (d， J= 8.5 Hz， 4H)， 6.99 (d, J= 8.5 Hz, 4H), 7.27- 7.5 (m， 20H), 7.68 (d, 16 Hz, 2H), 7.77 (d, 7= 16 Hz, 2H), 14.76 (s， 2H)。
將少量的碘(通常為一晶粒)添加至15(TC、攪拌著的查耳酮16j的 DMSO(最小體積)溶液中。所得的反應混合物于常溫再攪拌16小時或者攪 拌至采用少量樣品的& NMR光譜分析發現反應完成為止。反應完成后， 將混合物倒入水(10 mL/mL所用的DMSO)中，并以乙酸乙酯洗滌所得的黃 色懸浮液。繼續洗滌直至有機層保持透明為止(通常洗滌3次 4次)。然 后以5%的硫代硫酸鈉溶液、水洗滌合并的有機層，然后干燥(MgS04)、過 濾并減壓蒸發，通過快速柱層析(梯度，丙酮/DCM 1:5—l:3)純化后得到作 為淺橙色/淺褐色油狀物的類黃酮二聚物17j(n=10)(16%)。 ！HNMR(CDCl3， 400固z): 3.6-3.75 (m, 32H)， 3.87 (m, 4H)， 4.19 (m， 4H)， 5,10 (s, 4H), 5.20 (s，4H)， 6.44 (d， /= 2 Hz， 2H)， 6.58 (s， 2H)， 6.62 (d， 2 Hz, 2H)， 7.01 (d, J= 8.5 Hz， 4H), 7.27- 7.40 (m, 16H), 7.61 (d, /= 8.5 Hz， 4H)， 7.79 (d，8.5 Hz， 4H)。
將水逐滴添加至含有經保護的二類黃酮17j的THF溶液的燒瓶中，直 至混合物恰好開始變渾濁為止。在該點處，逐滴添加THF直至所有物質溶 解。添加10%的炭載鈀(通常為1當量重量)，將所得的黑色懸浮液脫氣并 充入氫氣。將所得的反應混合物在室溫快速攪拌直至& NMR光譜分析顯 示芐基保護基被完全脫去為止。反應完成后，真空除去溶劑以得到作為橙 色/褐色油狀物的化合物9j (n=10)。 & NMR (^6-丙酮，400 MHz): 3.54- 3.64 (m, 32H), 3.88 (m， 4H)， 4.26 (m, 4H)， 6.27 (d， 《/= 2 Hz, 2H), 6.56 (d， /= 2 Hz， 2H)， 6.67 (s， 2H), 7.14 (d， J= 8 Hz, 4H), 8.02 (d,8 Hz， 4H), 13.01 (s, 2H)。
采用與9j所述相同的步驟制備化合物9k (平均n=13)，不同之處在于由 商購的13(平均11=13)制備二甲磺酸酯13b(平均n=13)。通過快速柱層析 (EtOAc)純化后得到作為無色油狀物的化合物llk (平均n=13) (61%)。 NMR (CDC13， 400 MHz) 5 3.6-3.75 (m,約44H)， 3.88 (m， 4H), 4.22 (m, 4H)， 7.00 (d， /= 8.5 Hz, 4H), 7.81 (d, 8.5 Hz, 4H), 9.88 (s, 2H)。提取至EtOAc并 真空濃縮后得到作為黃色油狀物的化合物16k (平均n=13)(產率>95%)。不 經任何純化將其直接用于下一步。^NMR(CDCl3,400MHz): 3.60-3.75 (m, 約44H), 3.80 (m, 4H), 4.14 (m, 4H)， 5.07 (s， 4H)， 5.10 (s, 4H)， 6.18 (d, J= 2 Hz, 2H), 6.23 (d， /= 2 Hz, 2H)， 6.73 (d， /= 8.5 Hz, 4H), 7.03 (d, 8.5 Hz, 4H)， 7.27- 7.5 (m, 20H)， 7.69 (d, /= 16 Hz, 2H), 7.77 (d, J= 16 Hz, 2H), 14.76 (s, 2H)。通過快速柱層析(梯度，丙酮/DCM 1:5—l:3)純化后得到作為淺橙色/ 淺褐色油狀物的化合物17k(平均n-13)(28。/。)。 ^NMR (CDC13， 400 MHz): 3.6-3.75 (m，約44H)， 3.89 (m, 4H)， 4.20 (m， 4H)， 5.13 (s, 4H)， 5.23 (s， 4H), 6.47 (bs 2H), 6.56 (bs, 2H), 6.62 (bs, 2H)， 7.00 (m, 4H)， 7.27- 7.40 (m, 16H), 7.61 (m 4H)， 7.78 (m， 4H)。得到作為橙色/褐色油狀物的化合物9k (平均
45n=13)。 & NMR (^-丙酮，400 MHz): 3.54-3.64 (m,約44H)， 3.87 (m， 4H)， 4.26 (m, 4H)， 6.27 (br, 2H)， 6.55 (br, 2H)， 6.70 (br, 2H)， 7.1 (m， 4H)， 8.0 (m， 4H)。
聚乙二醇連接的斧菜素類似物的二聚物的合成
合成査耳酮32a至32/的一般步驟將2，-羥基苯乙酮31(1.0當量)、4-烯丙氧基苯甲醛(l.O當量)和過量的氫氧化鉀溶液(96y。EtOH中的3M溶液) 添加至圓底燒瓶中。將該混合物在室溫攪拌16小時。當TLC顯示2，-羥基 苯乙酮完全消耗時，以1 M HC1溶液在冰浴溫度將該反應混合物酸化至 pH5。以CH2Cl2(30mLx3)連續提取該混合物。將合并的有機層用MgS04 干燥，過濾并減壓蒸發，得到粗品混合物，以5%乙酸乙酯的己烷溶液洗滌 該混合物，得到所需的查耳酮。
合成黃酮33a至33/的一般步驟將催化量的碘(4 mol。/。)一次添加至50 。C、充分攪拌的查耳酮32的二甲基亞砜溶液中。然后將該反應混合物在130 。C攪拌12小時。在加熱過程中，反應混合物慢慢由淺褐色變為深褐色。當 TLC顯示査耳酮32完全消耗時，將該反應混合物倒入含水(200 mL)的分液 漏斗中。以CH2Cl2(30mLx3)提取該混合物。如果所述混合物不能分為兩 層，則添加1 MHC1 (20mL)。以0.5%的硫代硫酸鈉溶液洗滌合并的有機層， 用MgS04干燥，過濾并蒸發，得到粗品反應混合物，將其結晶，得到所需 的黃酮33。
通過黃酮33a至33/的烯丙基的脫保護來合成34a至34/的一般步驟 將催化量的Pd(PPh3)4 (2 mol。/。)在回流溫度下一次添加至裝有黃酮33 (1當 量)、K2C03(6當量)和MeOH的圓底燒瓶中。將該反應混合物在回流溫度攪 拌2小時。當TLC顯示33完全消耗時，將該反應混合物倒入含水(200 mL) 的燒杯中。用1MHCi溶液將所述溶液酸化至pH4，形成大量米白色固體，通過吸濾收集該固體。將所收集的固體溶于丙酮，并通過過濾除去不溶的 黑色炭。減壓下蒸發所得的褐色濾液，得到標題化合物34。這些黃酮中的
某些先前已經在文獻中報道過[化合物33a-Huang， X.; Tang, E.; Xu, W. -M.; Cao， J. J. Comb. Chem. 2005, 7， 802-805;化合物34a-Miyake, H.; Takizawa, E.; Sasaki, M.; Bull. Chem. Soc. Jpn., 2003， 76， 835國836;化合物34d-Jesthi, R K.; Sabat, B. K.; Rout, M. K. J. Indian Chem. Soc. 1965, 42， 105-108;化合物 34e-Ono, M.; Yoshida, N.; Ishibashi， K.; Haratake， M,; Arano, Y,; Mori, H.; Nakayama, M. J. Med. Chem.， 2005， 48, 7253-7260;化合物34f國Jha, B. C; Amin, G. C. Tetrahedron 1958， 2， 241-245;化合物34i- Pelter， A.; Bradshaw， J.; Warren, R. Phytochemistry 1971， 10， 835-850;化合物34i-Pelter, A.; Ward, R. S.; Balasubramanian, M. Chem. Comm. 1976， 4， 151-152;化合物34j和化合物 34k-Prendergast， Patrick T. Use of flavones, coumarins and related compounds to treat infections. PCT Int. Appl. (2001), 70 pp; j七合物34/- Bargellini, G.; Grippa， A. Gazzetta Chimica Italiana 1927, 57， 605 - 609。]。
合成黃酮二聚物35a至35/的一般步驟將黃酮34 (1.6當量)、四乙 二醇二甲磺酸酯(1.0當量)、K2C03 (4當量)和DMF添加至圓底燒瓶中。 將該反應混合物在回流溫度攪拌2小時至3小時。在加熱過程中，反應混 合物慢慢由深褐色變為乳白色。當TLC顯示黃酮34完全消耗時，將反應混 合物倒入含水(200 mL)的分液漏斗中。以CH2C12 (20 mL x 3)連續提取所述 混合物。如果所述混合物不能分成兩層，則添加1MHCl(20mL)。將合并的 有機層用MgS04干燥，過濾并蒸發，得到粗品反應混合物。如下所述，通 過由丙酮結晶或硅膠上的快速柱層析(以20%丙酮的CH2Cl2溶液作為洗脫 劑)進行黃酮二聚物35的純化。
1，13-二[4，-(4i7-苯并吡喃-4-酮-2-基)苯基]-l，4，7，10，13-五氧十三垸(35a): 在硅膠上快速柱層析后得到作為淺黃色固體的標題化合物(0.98 g， 37%):
47NMR (CDC13) 3.63誦3.67 (m, 8H), 3.79 (t, /= 4.8 Hz, 4H), 4.06 (t, J= 4.4 Hz， 4H), 6.57 (s， 2H), 6.87 (d， J= 8.8 Hz, 4H), 7.25 (dd, J= 7.6, 7.6 Hz， 2H)， 7.37 (d， 8.0 Hz, 2H)， 7.53 (ddd， /= 1.2, 7.6， 7.6 Hz， 2H), 7.68 (d， 《/= 8.8 Hz, 4H)， 8.06 (dd, J= 0.8， 7.6 Hz, 2H); 13C NMR (CDC13) S 67.3, 69.2, 70.4， 70.5， 105.6， 114.6, 117.6, 123.5, 123.5, 124.7, 125.1， 127.5， 133.3, 155.7， 161.3， 162.8， 177.9。
1，13-二[4，-(7-氟-4//-苯并吡喃-4-酮-2-基)苯基]-1,4,7,10，13-五氧十三烷 (35b):在硅膠上快速柱層析后得到作為淺黃色固體的標題化合物((U5 g， 54%): iHNMR (CDC13) 3.68 - 3.74 (m, 8H)， 3.87 (t， J= 4.8 Hz， 4H)， 4.16 (t, J= 4.4 Hz, 4H)， 6.65 (s, 2H), 6.98 (d,聲8.8 Hz， 4H)， 7.08 (t, /= 7.6 Hz， 2H)， 7.16 (d， J= 8.0 Hz, 2H), 7.77 (d， 《/= 8.8 Hz, 4H), 8.17 (dd, /= 6.4, 8.8 Hz, 2H); 13C NMR (CDC13) S 67.6, 69,5， 70.6, 70.8, 104.5, 104.7, 106.0， 113.6, 113.8， 115.0， 120.6， 123.6， 127.9, 156.9, 157.1， 161.7， 163.5, 164.2， 166.8， 177.3。
1,13-二[4，-(6-氟-4仏苯并吡喃-4-酮-2-基)苯基]-1,4，7,10，13-五氧十三烷 (35c):在硅膠上快速柱層析后得到作為白色固體的標題化合物(0.13 g， 55%)。 m.p.: 147-149。C; &而R (CDC13) 3.66 - 3.75 (m, 8H)， 3.88 (t, J= 4.4 Hz, 4H)， 4.17 (t, > 4.8 Hz， 4H)， 6.68 (s， 2H)， 6.98 (d, J= 8.8 Hz， 4H)， 7.36 (dt， 聲0.4, 6.0 Hz， 2H)， 7.49 (dd， J= 4.0, 8.8 Hz， 2H)， 7.80 (d， 8.0 Hz， 6H); 13C NMR (CDC13) S 67.6， 69.5， 70.6， 70.8， 105.3， 110.4， 110.6， 115.0， 120.0， 121.5， 121.8, 123.7, 124.9， 127.9， 152.2, 158.2， 160.7， 161.7， 163.5， 177.4。
1，13-二[4'-(6-氯-4i7-苯并吡喃-4-酮-2-基)苯基]-l,4，7,10，13-五氧十三烷 (35d):在硅膠上快速柱層析后得到作為黃色固體的標題化合物(48 mg， 31%): m.p.: 180-182°C; 'H NMR (CDC13) 3.70 - 3.76 (m, 8H)， 3.90 (t， J= 4.8 Hz， 4H), 4.18 (t， 4.8 Hz， 4H)， 6.70 (s, 2H)， 7.00 (d, J= 8.8 Hz, 4H)， 7.47 (d， /= 8.8 Hz, 2H)， 7.60 (dd， J= 2.8, 8.8 Hz, 2H)， 7.81 (d， /= 8.8 Hz, 4H) 8.14 (d，J= 2.4 Hz， 2H); "C雇R (CDC13) S 67.6， 69.5， 70.7， 70.8， 105.9， 115,0, 119.6, 123.6, 124.8, 125.1， 127.9， 131.0， 133.7, 154.4, 161.8， 163.5, 177.0; L脂S (ESI) m/z 703 (M+ + H, 10), 725 (M+ + Na, 37); HRMS (ESI) C38H3309C12 (M+ + H) 的計算值為703.1502，測定值為703.1505。
1,13-二[4，-(6-溴-4//-苯并吡喃-4-酮-2-基)苯基]-l，4，7，10，13-五氧十三烷 (35e):在硅膠上快速柱層析后得到作為黃色固體的標題化合物(43 mg， 34%): m.p.: 184-186。C; NMR (CDC1》3.69 - 3.75 (m, 8H), 3.88 (t， </= 4.8 Hz, 4H)， 4.17 (t, J= 4.8 Hz, 4H), 6.68 (s， 2H), 6.98 (d， J= 8.8 Hz， 4H), 7.38 (d, /= 9.2 Hz， 2H), 7.71 (dd， J= 2.4， 8.8 Hz， 2H)， 7.78 (d， 《/= 8.8 Hz， 4H) 8.27 (d, J =2.0 Hz, 2H); 13C NMR (CDC13) 5 67.6, 69.5, 70.6， 70.8, 106.0， 115.0, 119.8, 123.6， 125.1， 127.9, 128.2, 136.5, 154.8， 161.8, 163.5， 176.9; L畫S (ESI) m/z 793 (M+ + H， 8), 815 (IvT + Na, 20); HRMS (ESI) C38H3309Br2 (M+ + H)的計算 值為791.0491，測定值為791.0506。
1,13-二[4，-(6，8-二氯-4/f-苯并吡喃-4-酮-2-基)苯基]-l,4，7,10，13-五氧十 三烷(35f):在硅膠上快速柱層析后得到作為白色固體的標題化合物(45 mg, 28%): m.p.: 147-148°C; & NMR (CDC13) 3.70 - 3.76 (m， 8H), 3.90 (t, 4.8 Hz, 4H), 4.18 (t, /= 4.4 Hz, 4H)， 6.71 (s, 2H), 7.00 (d, 8.8他，4H), 7.67 (d， /= 2.4 Hz， 2H), 7.85 (d， 8.8 Hz, 4H)， 8.03 (d, 7= 2.8 Hz， 2H); 13C NMR (CDC13) 5 67.7， 69.5， 70.7， 70.8， 105.6， 115.1， 123.1， 123.8， 124.2, 125.6, 128.1， 130.7， 133.5, 150.2, 162.0， 163.3， 176,2; LRMS (ESI) m/z 111 (M+ + H， 29)， 795 (M+ + Na， 100); HRMS (ESI) C38H3109C14 + H)的計算值為771.0722， 測定值為771.0730。
1,13-二[4，-(7-甲基-4/f-苯并吡喃-4-酮-2-基)苯基]-l,4，7,10,13-五氧十三 烷(35g):在硅膠上快速柱層析后得到作為白色固體的標題化合物(0.12 g, 33%): m.p.: 128-129°C; jH NMR (CDC13) 2.45 (s, 6H), 3.68 - 3.75 (m, 8H),
493.87 (t， 《/= 4.4 Hz， 4H), 4.16 (t， 4,4 Hz, 4H)， 6.66 (s， 2H)， 6.98 (d, /= 8.8 Hz, 4H), 7.16 (d, /= 8.0 Hz, 2H), 7.28 (s， 2H), 7.79 (d, /= 8.4 Hz， 4H), 8.03 (d， J = 8.0 Hz， 2H); 13C NMR (CDC13) S 21.8, 67.6， 69.5, 70.7, 70.8, 105.9, 114.9， 117.7， 121.5， 124.1， 125,2， 126.5， 127,8, 144.9, 156.2， 161.5， 163.0, 178.3; L腹S (ESI) m/z 663 (Nf + H， 97), 685 (M十+ Na, 100); HRMS (ESI) C40H39O9 (]Vr + H)的計算值為663.2594，測定值為663.2588。
U3-二[4，-(6-甲基-4/f-苯并吡喃-4-酮-2-基)苯基]-i，4，7，10，13-五氧十三 烷(35h):在硅膠上快速柱層析后得到作為白色固體的標題化合物(47 mg, 360/0): m.p.: 139-140°C; !HNMR(CDCl3) 2.42 (s, 6H), 3.69-3.75 (m， 8H), 3.88 (t, J= 4.4 Hz, 4H), 4， 16 (t， 4.4 Hz， 4H)， 6.69 (s, 2H), 6.98 (d, /= 8.4 Hz， 4H), 7.38 (d， /= 8.4 Hz, 2H), 7.44 (dd, /= 1.6, 8.4 Hz, 2H), 7.80 (d， /= 8.4 Hz， 4H), 7.94 (s， 2H); 13C NMR (CDC13) 5 20.9, 67.6， 69.5， 70.6， 70.8, 105.9, 114.9, 117.6, 123.4， 124.1, 124.9, 127.8， 134.8, 135.0, 154.3， 161.5， 163.1, 178.4; LRMS (ESI) m/z 663 (M+ + H, 79), 685 (M+ + Na, 100); HRMS (ESI) C40H39O9 (IvT + H)的計算值為663.2594，測定值為663.2586。
1,13-二[4，-(7-甲氧基-4界苯并吡喃-4-酮-2-基)苯基]-1,4,7,10，13-五氧十 三垸(35i):在硅膠上快速柱層析后得到作為黃色固體的標題化合物(95mg, 33%): m.p.: 128-130。C; & NMR (CDC13) 3.69 - 3.75 (m， 8H), 3.88 (t, J= 4.4 Hz， 4H), 3.90 (s， 6H)， 4.17 (t, </= 4.4 Hz， 4H)， 6.65 (s， 2H)， 6.89 (d, J= 2.0 Hz, 2H)， 6.93 (dd， /= 2.0， 8.4 Hz， 2H)， 6.99 (d， > 8.8 Hz， 4H)， 7.79 (d， 8.4 Hz, 4H), 8.07 (d， 《/= 8.8 Hz, 2H); 13C NMR (CDC13) 5 55.8, 67.6, 69.5， 70.7， 70.8， 100.3， 105.9， 114.2， 114.9， 117.6, 124.1， 126.9， 127.7, 157.8, 161.4, 162.9， 164.0, 177.8; LRMS (ESI) m/z 695 (M+ + H， 63)， 717 (MT + Na， 100); HRMS (ESI) C40H39O + H)的計算值為695.2492，測定值為695.2495。
1,13-二[4'-(6-甲氧基-4i7-苯并吡喃-4-酮-2-基)苯基]-l,4，7,10,13-五氧十三垸(35j):由丙酮結晶后得到作為白色固體的標題化合物(0.17 g， 45°/。) m.p.: 129畫130。C; & NMR (CDC13) 3.70-3.74 (m, 8H)， 3.87 (s, 6H)， 3.88 (t, /= 4.4 Hz， 4H), 4.16 (t, 4.4 Hz, 4H) 6.70 (s， 2H)， 6.98 (d, J= 8.8 Hz, 4H)， 7.24 (dd， /= 2.8， 8.8 Hz， 2H), 7.43 (d, /= 9.2 Hz, 2H), 7.53 (d， 《/= 2.8 Hz, 2H)， 7.80 (d， 7= 8.8 Hz， 4H); 13C NMR (CDC13) S 55.9, 67.6， 69.5, 70.7, 70.8, 104,7， 105.3, 114.9， 119.3, 123.5， 124.3, 127.8, 150.9, 156.8， 161.5， 163.1， 178.1; LRMS (ESI) m/z 695 (]VT + H， 47)， 717 + Na， 100); HRMS (ESI) C40H39O (^ + H)的計算值為695.2492，測定值為695.2493。
1,13-二[4，-(5-甲氧基-4界苯并吡喃-4-酮-2-基)苯基]-l,4，7，10,13-五氧十 三烷(35k):在硅膠上快速柱層析后得到作為白色固體的標題化合物(O.llg, 390/o): m.p.: 60-61°C; !HNMR(CDCl3) 3.68-3.72 (m, 8H)， 3.86 (t, 4.8 Hz, 4H)， 3.95 (s， 6H), 4.14 (t， J= 4.4 Hz, 4H)， 6.61 (s, 2H)， 6.77 (d， 8.0 Hz, 2H), 6.96 (d, 8.8 Hz， 4H), 7.05 (d， J= 8.4 Hz， 2H), 7.51 (dd, /= 8.0， 8.0 Hz, 2H), 7.77 (d， /= 8.8 Hz, 2H); 13C雇R (CDC13) S 56.4, 67.5, 69.5, 70.6, 70.8， 106.3， 107.5, 110.0， 114.8， 123.6， 127.6， 133.5， 158.1, 159.6， 161.0, 161,3， 178.2。
1，13-二[4，-(6,7-二甲氧基-4//-苯并吡喃-4-酮-2-基)苯基]-1,4,7,10，13-五 氧十三垸(357):由丙酮結晶后得到作為白色固體的標題化合物(O.ll g, 39%): m.p.: 71-72。C; & NMR (CDC13) 3.67-3.71 (m, 8H), 3.85 (t, /= 4.8 Hz， 4H)， 3.89 (s， 6H)， 3.95 (s, 6H), 4.12 (t, /= 4.4 Hz, 4H)， 6.60 (s, 2H)， 6.85 (s， 2H), 6.92 (d， 8.8 Hz, 4H), 7.40 (s， 2H), 7.71 (d， J= 8.8 Hz, 4H); 13C NMR (CDC13) 5 56.1， 56.3, 67,5， 69.4, 70.6, 70.7， 99.5, 104.0， 105.3， 114.8, 116.9, 124.0, 127.5, 147.3， 151.9, 154.1, 161.2, 162.5， 177.3; LRMS (ESI) m/z 755 + H, 48)， 777 (ivf + Na, 100); HRMS (ESI) C42H42013Na (M4 + Na)的計算值為 777.2523，測定值為777.2512。聚乙二醇連接的斧菜素二聚物的效力
評價以1至13個乙二醇單元連接的一系列芹菜素二聚物9a至9k在增 強不同的MDR癌癥細胞的敏感性時的效力。將它們的活性與芹菜素自身以 及單體10a和10b的活性比較。還評價了它們逆轉P-gp介導的藥物流出的 能力。
近來的證據表明某些P-gp和MRP轉運體與原生動物寄生蟲利什曼原 蟲中的藥物耐受性有關(Chemosensitizers in drug transport mechanisms involved in protozoan resistance. Curr. Drug Targets Infect. Disord. 2005, 5， 411-31)。在tarentolae利什曼原蟲中對五價銻葡萄糖酸銻鈉(SSG)的耐受性 是由MRP成員(LtPGPA)引起的。據報道，噴他脒耐受性可能是由于噴他脒
豐皮其革巴標-線粒體所排斥(Pentamidine uptake in Leishmania donovani and
Leishmania amazonensis promastigotes and axenic amastigotes. Biochem. J. 1996， 315 (Pt 2), 631-4)。由于在癌癥中的P-gp型MDR的調節中已考慮某些 類黃酮，并且這些類黃酮己能夠抑制諸如質膜ATP酶、環AMP-依賴型蛋 白激酶和蛋白激酶C等各種ATP-結合蛋白，因此，在本發明中，可認為本 發明的類黃酮二聚物會增強芹菜素結合至NBD的功效，從而使P-gp失活， 由此調節對噴他脒和SSG具耐受性的利什曼原蟲細胞中的MDR活性。
材料和方法 材料
DMSO，維拉帕米、阿霉素、柔紅霉素、長春新堿、長春堿、紫杉醇(taxol) 和米托蒽醌購自Sigma-Aldrich。 Dulbecco改良Eagle培養基(Dulbecco，s Modified Eagle's Medium, DMEM)、 RPMI 1640培養基、胰蛋白酶-EDTA和 青霉素/鏈霉素來自Gibco BRL。胎牛血清(FBS)來自HyClone Laboratories. MTS、吩嗪硫酸甲酯(PMS)和具有P-糖蛋白的Pgp-GloTM檢測系統購自 Promega。人乳腺癌細胞系MDA435/LCC6和MDA435/LCC6 MDR由RobertClarke博士(喬治敦大學，華盛頓哥倫比亞特區)友情提供。鼠類白血病細胞 系P388和P388/ADR來自美國國家癌癥研究所(馬里蘭州，美國)。
癌癥化學治療中的藥物耐受性
細胞培養
在分別補充了 10%FBS的DMEM和RPMI 1640培養基中供養 MDA435/LCC6和P388(均為親本和MDR亞型)。RPMI 1640培養基還包含 100單位/ml的青霉素和100嗎/ml的鏈霉素。在含有5%C02的潮濕環境中 于37匸培養細胞。用0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液使MDA435/LCC6 (均為 野生型和MDR亞型)細胞脫附。
細胞增殖測試
將MDA435/LCC6和P388 (均為親本和MDR亞型)細胞分別以每孔 2000至5000個細胞接種在96孔板中。添加含有或不含有類黃酮二聚物的 不同濃度的抗癌藥物(阿霉素、柔紅霉素、長春新堿、長春堿、紫杉醇， 米托蒽醌)至最終體積為200 jil， MDA435/LCC6和P388(均為親本和MDR 亞型)細胞分別生長4天和3天。對于MDA435/LCC6(均為親本和MDR亞 型)，在細胞附著后(培育24小時)添加相應的藥物。為了測量細胞增殖， 根據生產商的說明書使用cell Titer 96 Aqueous Assay (Promega)。簡言之， 將MTS(2 mg/ml)和PMS(0.92 mg/ml)以20:1的比例混合。每孔添加30(^1的 MTS/PMS混合物，并在37匸培育2小時。然后采用ELISA微量滴定板讀 數儀(Bio-Rad)記錄490 nm處的光吸收。各實驗以至少一式三份的方式進行， 重復兩次。將抗癌藥物的細胞毒性表示為存活的細胞相對于未處理的 DMSO(0.05。/。)溶劑對照組的分數。抗癌藥物的IC5。或IC6。分別表示抑制50。/。 或60%的細胞生長的藥物濃度。
53阿霉素累積
在6孔板的每個孔中接種2.5 ml (1()S細胞/ml) MDA435/LCC6 (均為親 本和MDR亞型)。細胞匯合后，除去培養基。添加2ml含有調節劑的新鮮 DMEM，并在37。C培育細胞30分鐘。然后添加阿霉素(最終濃度為20 ^M)， 并在37。C培育2小時。然后通過胰酶消化法收集細胞。
對于P388(均為親本和MDR亞型)細胞，將1 ml (105細胞)匯合細胞分 裝在Eppendorf管中，并在37。C與黃酮二聚物一起預培育30分鐘。然后添 加阿霉素(最終濃度lOpM)，并以10piM的最終濃度在37匸培育2小時。 通過利用Eppendorf微離心機以冷PBS洗滌細胞團塊三次，在50%乙醇中 以0.3NHC1裂解細胞，并超聲粉碎30秒。以10000 rpm/分鐘離心3分鐘后， 保留上清液。采用分光熒光計測量阿霉素的熒光(X激發=470腿，人飾=585 nm)。
ATP酶檢測
根據制造商的說明書，采用具有人P-gp膜的Pgp-GlQTM檢測系統測量
P-gp APT酶活性。該檢測所依靠的是螢火蟲熒光素酶的發光反應的ATP依 賴性。簡言之，將25 pgP-gp膜與Na3VO4(100 pM)、溶劑對照(0.P/。DMSO)、 9d(100 ^M)、維拉帕米(IOO jiM)或者維拉帕米(100 pM)加9d(100 ^M)—起在 37。C培育。通過添加5 mM MgATP來引發ATP酶反應，然后在37C培育 40分鐘。終止反應，并通過添加ATP檢測試劑以熒光素酶產生的發光信號 檢測殘留的未代謝ATP。經過20分鐘的室溫信號穩定期后，在BMG Fluostar 板發光計上讀出發光值。P-gp ATP酶活性表示為樣品發光值相對于以 Na3 V04處理過的樣品的發光值的下降。
結果
單獨的芹菜素二聚物9a至9k在5pM濃度以下對所測試的MDR細胞系無抗癌活性，單體10a和10b在10pM濃度以下對所測試的MDR細胞系 也無抗癌活性。因此，選擇5pM的芹菜素二聚物和10pM的單體來評價它 們在下述檢測中的化學增敏作用。
類黃酮二聚物在MDA435/LCC6 MDR細胞中逆轉紫杉醇耐受性的作用 MDA435/LCC6是雌激素-非依賴型人乳腺癌細胞系。其MDR亞型 (MDA435/LCC6 MDR)通過轉換引導人MDR1 cDNA的組成型表達的逆轉
錄病毒載體，形成具有典型MDR1耐藥性模式的細胞系而產生 (MDA435/LCC6 and MDA435/LCC6MDR1: ascites models of human breast cancer, Br J Cancer 1996， 73, 154-161)。測定了本發明的齊菜素二聚物在 MDA435/LCC6 MDR細胞中逆轉紫杉醇耐受性的能力。紫杉醇是選擇用于 治療乳腺癌的一線藥物之一，己證實紫杉醇耐受性是通過P-gp介導的。釆 用5 MM的維拉帕米作為陽性對照。采用10pM的芹菜素單體10a和10b作 為陰性對照。如圖3A所示，不同的二聚物不同程度地加強了紫杉醇的毒性。 間隔基長度為4個PEG的化合物9d顯示最顯著的逆轉活性，將紫杉醇的 ICso從115nM降低到4.4nM，降低了約26相對倍數(relative fold, RF)。其 效力與維拉帕米(ICM) = 5.2 nM)相當。間隔基長度為2個和3個PEG的化合 物9b和9c也顯著逆轉紫杉醇耐受性，分別將IC5Q降低到19.9 nM和21.5 nM， RF分別為5.8和5.4。不過，間隔基短于2個PEG的二聚物(9a)或間 隔基長于5個PEG的二聚物(9e， 9f, 9h， 9j， 9k)在5 顯示很小或不顯示逆 轉作用。在這些實驗中采用具有3個和4個PEG的芹菜素單體(10a和10b) 作為陰性對照以確定抗癌耐藥性逆轉活性是否僅僅是由于合成的調節劑的 二聚性質，據發現，即使以具有相同數目的乙二醇單元的二聚物9c和9d 的濃度(5 MM)的兩倍濃度(10pM)使用所述陰性對照物，其也僅具有很小的 逆轉作用。這些結果表明9d、 9c和9b的調節活性是由于它們的二元結構， 而不是由于所存在的芹菜素部分的數目的簡單增加。
559d在MDA435/LCC6 MDR細胞中對紫杉醇耐受性的逆轉也具有濃度 依賴性(圖3B)。濃度為1 pM的9d能使IC5Q降低約1.9RF。增加9d的濃度 進一步增加逆轉活性，當其為5^M時，達到平臺區。
開菜素二聚物在MDA435/LCC6 MDR細胞中逆轉對其他抗癌藥物的耐 受性的作用
觀察到不同的芹菜素二聚物在長春堿耐受性發面具有相似的化學增敏 作用趨勢(圖4A)。圖4A顯示9d在加強長春堿的細胞毒性方面顯示最大 效力，使IC5Q從4.8 nM下降至0.36 nM，降低約13 RF。 9d的效力與維拉 帕米的效力(IC5。 = 0.25 Nm)相似。與9d相比，化合物9b和9c的效力較低， 但仍具有非常高的活性，分別使IC50降至0.61 nM和0.87 nM，分別降低 了 7.9 RF和5.5 RF。具有較短間隔基(9a)或具有較長間隔基(9e， 9f, 9h， 9j，9k) 的其他二聚物具有很小的活性或不具有活性。單體10a和10b即使以雙倍 濃度(IO )iM)使用也是無效的。化合物9d還在加強長春堿的細胞毒性方面顯 示出劑量依賴效應(圖4B)。同樣，9d在加強阿霉素細胞毒性方面比其他 化合物更有效，使IC6。從4.7pM降至0.73pM，下降了約6 RF (圖5)。化 合物9c (IC60 = 1.3jiM)和9b (IC60 = 1.3liM)也顯示較高的效力，使1(36()分別 降低了約3.6 RF禾[13.1 RF。具有較短PEG(9a)或具有較長PEG(9e, 9f， 9h， 9j,9k)的芹菜素二聚物具有很小的阿霉素敏感性或不具有阿霉素敏感性。單 體(10a和10b)也是無效的逆轉劑。
化合物ld可以將MDA435/LCC6 MDR的MRD逆轉至接近親本水平 由于化合物9d—直顯示最高的對紫杉醇、長春堿和阿霉素的調節活性， 因此我們著力于研究9d是否能將MDA435/LCC6 MDR的耐藥性逆轉至親 本水平(MDA435/LCC6)。圖6A至6E表明5pM的9d可將MDA435/LCC6 MDR對長春堿、紫杉醇、阿霉素、長春新堿、柔紅霉素的耐受性逆轉至接
56近于親本(MDA435/LCC6)水平的水平。在米托蒽醌中沒有觀察到作用(圖 6F)。逆轉能力[由存在或不存在9d時藥物的IC5()的相對倍數變化(relative fold change)確定]總結于表1中。范圍為7.6 RF至41 RF。對于長春堿和紫 杉醇的逆轉活性特別顯著，因為其ICso可降低到幾乎與在敏感對應物中的 水平相同的水平。
序菜素二聚物對阿霉素在MDA435/LCC6和MDA435/LCC6 MDR細胞 中的細胞累積的作用
為了理解不同的二聚物對各種抗癌藥物的調節活性是否是由于它們對 調節P-gp介導的藥物流出的不同能力所致，研究了它們在MDA435/LCC6 敏感性和耐受性細胞中對阿霉素的累積的作用。阿霉素是P-gp的熒光藥物 底物，在本實驗中用于監控P-gp介導的藥物流出。測定在存在或不存在芹 菜素二聚物(10pM)和單體(2(^M)的情況下阿霉素在這些細胞中的累積。采 用維拉帕米作為陽性對照。
結果示于圖7A中。阿霉素在LCC6中的累積(以P-gp表達作為基準 水平)不受溶劑對照(DMSO)或各種芹菜素單體、芹菜素二聚物或維拉帕米 的處理的影響。對于LCC6MDR細胞而言，發現當以DMSO對照處理時， 阿霉素的累積水平為LCC6的約20%。這是由于在LCC6MDR細胞中發現 的P-gp介導的阿霉素流出所致。不過，這樣的低水平累積通過以9d進行共 處理而被完全逆轉。在10pM時，9d使LCC6MDR細胞的阿霉素累積增加 5.8倍。阿霉素的累積現在與以9d處理過的LCC6細胞的阿霉素累積幾乎 相同(97%)。該效力與維拉帕米的效力(6.2倍)相當。化合物9c和9d在LCC6 MDR中也具有對紫杉醇、長春堿和阿霉素的藥物耐受性逆轉活性，其也分 別使阿霉素累積增強了對照的4.5倍和4倍。 一般而言，調節劑的阿霉素累 積的逆轉效力與它們在LCC6 MDR中逆轉阿霉素耐受性的效力非常類似。表l: 9d在MDR細胞中對化學治療藥物的細胞毒性的作用。如"材料
和方法"中所示，將各個細胞系與使用/不使用5 的9d的一系列濃度的 藥物接觸后，確定各個細胞系的IQc值。RF代表藥物敏感性的倍數變化。 VP-維拉帕米。
細胞系
藥劑處理LCC6 MDRLCC6P388/ADRP388
ICso(nM)RFaICso(nM)ICs。(nM)IC50(nM)
藥物4.410.349514.1
長春堿藥物+9d0.42104.322
藥物+VP0,2915N.D.
藥物10512.91636122
紫杉醇藥物+9d4,8223055
藥物+VP5.220N.D.
藥物4690
阿霉素藥物+9d550912314
藥物+VP30016N.D.
藥物2610.2929912.2
長舂新堿藥物+9d0.63414.566
藥物+VPN.D.N.D.
藥物9771792111125
柔紅霉素藥物+9d1297.610620
藥物+VPN.D.b4053
藥物144210.3539514.3
米托蒽醌藥物+9d6462.21942
藥物+VPN.D.N.D.
aR.F.相對倍數=(無調節劑的IC5o)與(有調節劑的IC5())的比值。該值用作 調節劑的逆轉活性的強度指標。bN.D.未檢測
然后研究了9d在P-gp陽性細胞和陰性細胞中對阿霉素累積的劑量依賴 效應，并示于圖7B中。發現9d以劑量依賴方式顯著增加阿霉素在 MDA435/LCC6 MDR細胞中的累積，但在敏感MDA435/LCC6細胞中則無 此現象。當9d的濃度從0^M增加至lO(iM時，LCC6的細胞內阿霉素濃度 逐漸由17%增加至88%。"菜素二聚物逆轉P388/ADR細胞中的抗癌毒性的作用 上述數據顯示芹菜素二聚物(尤其是9d)有望在人乳腺癌細胞中逆轉 藥物耐受性。如果這些芹菜素二聚物可通過抑制P-gp流出而調節MDR， 則它們應當也能夠調節其他MDR癌癥。為了證實該推斷，測試了另一個對 ADR(adriamycin，阿霉素的品牌名)有耐受性的、經充分表征的癌癥MDR 體系P388/ADR鼠類白血病細胞系。P388/ADR已廣泛用作MDR調節劑的 臨床前評價標準。
與前述觀察結果一致，具有不同間隔基長度的芹菜素二聚物在 P388/ADR細胞中顯示不同的調節活性(圖8A和9A)。而且，9d是最有效的 調節劑，使阿霉素和柔紅霉素的ICs。分別由1.5!iM和2.1pM降至0.15pM 和O.lOpM，分別下降了約10RF和21RF(圖8A和9A)。化合物9d還在逆 轉對于阿霉素(圖8B)和柔紅霉素(圖9B)的耐受性方面顯示出劑量依賴效 應，飽和濃度為約5pM。發現具有較短的間隔基長度的9c和9b顯示適度 的抑制性，分別使阿霉素的IC5o下降約3RF和2RP，使柔紅霉素的IC5o下 降4.6RF和2.5RF。具有比9d長的間隔基或者比9b短的間隔基的調節劑具 有很小或不具有加強阿霉素和柔紅霉素在P388/ADR細胞中的細胞毒性的 作用。單體lOa和10b即使以9c和9b所用濃度的兩倍添加，也僅顯示較小 的調節活性。不過，與MDA435/LCC6MDR細胞不同，9d的逆轉活性不如 維拉帕米好，維拉帕米在P388/ADR細胞中幾乎能完全逆轉阿霉素和柔紅 霉素耐受性(IC5Q分別為0.06pM和0.0^iM)。上述結果表明芹菜素二聚物 在LCC6 MDR和P388/ADR細胞中均可抑制P-gp。藥物耐受性逆轉活性和 芹菜素二聚物的間隔基長度之間的關系在這兩種細胞系中幾乎完全相同。
化合物9d可將P388/ADR細胞的藥物耐受性逆轉至與敏感性親本細胞 系P388幾乎相同的水平化合物9d也可以以不同程度加強其他P-gp底物對P388/ADR細胞的作 用，所述P-gp底物包括阿霉素、柔紅霉素、紫杉醇、長春新堿和長春堿(圖 10A至IOE)。在紫杉醇、長春新堿和長春堿的情況中，5jliM的9d將 P388/ADR的耐藥性完全逆轉至敏感水平(圖IOC、 10D和IOE)，表明抗 癌藥物的流出被9d完全抑制。對米托蒽醌耐受性沒有作用。這表明 P388/ADR對米托蒽醌采取另外的對9d不敏感的MDR機制。通過IC5()的 相對倍數變化確定的逆轉能力總結于表1中。所述逆轉能力在14RF至66RF 范圍內變化。
齊菜素二聚物對阿霉素在P388和P388/ADR細胞中的細胞累積的作用 研究了芹菜素二聚物影響阿霉素在P388和P388/ADR細胞中的累積的 能力。在經DMSO處理的對照中，阿霉素在P388/ADR細胞中的累積為在 P388細胞中的約33V。，表明阿霉素流出(圖IIA)。在MDR細胞中添加不同 的芹菜素二聚物可不同程度地抑制阿霉素的P-gp流出。與前面的結果一致， 9d顯示最高效力，使得阿霉素累積增長至對照的阿霉素累積的約2倍。化 合物9b和9c也顯示與9d相當的活性。另一方面，單體i0b (濃度為二聚 物濃度的兩倍)或具有較長間隔基(9e， 9k)或具有較短間隔基(9a)的其他斧菜 素二聚物顯示較小的活性或根本不顯示活性。在P388/ADR中的藥物耐受 性逆轉活性和芹菜素二聚物的間隔基長度之間的關系與在LCC6 MDR細胞 中所觀察到的類似。相反，在親本敏感P388細胞中的阿霉素累積幾乎不受 任何芹菜素二聚物、單體或維拉帕米的影響。當以各種濃度的9d將所述細 胞預培育30分鐘時，9d以劑量依賴方式顯著增加P388/ADR細胞中的阿霉 素累積，但在敏感P388細胞中則無此現象(圖IIB)。雖然9d顯示最佳活性， 但不能將耐受性P388/ADR細胞中的細胞阿霉素水平恢復至在敏感細胞中 的水平，而維拉帕米則可以實現這一點(圖IIA)。這表明9d不能完全抑制 P388/ADR中的阿霉素的P-gp流出。這與其細胞毒性調節作用不如維拉帕
60米高相一致(圖IOA)。
9d對P-gp ATP酶活性的作用
為了進一步研究9d和P-gp之間的相互作用，檢測了 9d(100)iM)對P-gp ATP酶活性和維拉帕米誘導的ATP酶活性的作用。有趣的是，9d(100pM) 可將P-gpATP酶活性增加至基準水平的3.3倍(PO.0001)(圖12)。如同所預 期的，維拉帕米(一種通過結合至底物結合點而起作用的眾所周知的P-gp ATP酶刺激劑)可將P-gp ATP酶水平增加至基準水平的7.4倍(P0.0001)。 當也存在9d時，這樣的維拉帕米誘導的P-gp ATP酶活性從7.4倍降低至6.1 倍(P0.0001)。該結果表明9d與維拉帕米一樣可剌激P-gpATP酶活性，并 且可能與維拉帕米的作用方式一樣，也通過結合至P-gp的相同位點起作用。 維拉帕米和9d(10(^M)對非P-gpATP酶活性均無顯著的作用(數據未示出)。
聚乙二醇(n-4)連接的芹菜素類似物二聚物的生物活性
由于化合物9d顯示出良好的對MDR細胞的逆轉活性，因此還研究了 具有相同的聚乙二醇(n-4)接頭的各種芹菜素類似物二聚物的生物活性。研 究了在存在5pM各種合成的類黃酮類似物二聚物35a至35/的情況中紫杉 醇對LCC6 MDR的IC5Q，結果總結于表2中。許多這些類似物二聚物(35a, 35b, 35f， 35g， 35h)顯示出比維拉帕米更強的逆轉活性。
總而言之，上述結果已經明確地證明了通過不同長度的間隔基連接的 類黃酮二聚物能夠擔當用于癌癥的化學療法治療的共藥(co-dnig)。確定了具 有最優間隔基長度的芹菜素二聚物(9d)， 9d通過顯著增強抗癌藥物的細胞 內藥物累積而在體外的乳腺和白血病MDR細胞中均顯示出對抗癌藥物的 細胞毒性的6RF至50RF的提高。類黃酮二聚物的類似物也顯示顯著的抗 癌藥物的細胞毒性的提高。
表2:類似物二聚物35a至35/對于紫杉醇對LCC6MDR細胞的細胞毒
61性的作用。如"材料和方法"中所示，將LCC6MDR細胞與使用5 pM所 述化合物的一系列濃度的紫杉醇接觸后，確定IC50值。
在存在5jiM濃度的各種合成的類黃酮二聚物類似物的情況下紫杉醇對 LCC6MDR的IC50
所添加的類似物 無(對照)
維拉帕米(陽性對照)
35a(均為H)
35b (7畫F)
35c (6畫F)
35d(6-Cl)
35e (6-Br)
35f(6,8-二氯)
35g(7-甲基)
35h (6-甲基)
35i(7-甲氧基)
35j(6-甲氧基)
35k(5-甲氧基)
351 (6，7-二甲氧基)
紫杉醇的平均IC5Q(nM)
128.2
8.1
2.7
3.1
12.2
32.8
20.9 3.4 2.4
32.0 37.7 7.4 16.4
在治療寄生性疾病中通過類黃酮二聚物降低藥物耐受性 細胞系和細胞培養
在該研究中采用豚鼠利什曼原蟲(LePentR50， Le野生型,LeMDA/ -/-和 丄eMDi 厶過度表達的LeV160突變體)和杜氏利什曼原蟲(LdAG83, Ld2001 和Ld39)的前鞭毛體。前者是豚鼠的天然感染菌株，后者是臨床菌株，可能 導致人的內臟利什曼病。兩種菌株均在Schneider的果蠅細胞(Dmsop/n7a) 培養基(Invitrogen)中于27。C培養4天，所述培養基的pH為6.9，其中補加 有含4 mM谷氨酰胺(Sigma)的10。/c)(體積/體積)熱失活胎牛血清(Hyclone)和 25 j^g/mL慶大霉素溶液(Invitrogen) (Cloning and functional analysis of an
62extrachromosomally amplified multidrug resistance-like gene in Leishmania enriettii. Mol. Biochem. Parasitol 1993， 60， 195-208)。
在存在50 pg/mL噴他脒(Sigma)和3.5 mg/mL葡萄糖酸銻鈉(SSG)的情 況下分別培養LePentR50 (噴他脒耐受型，噴他脒的IC5。 = 117 pg/mL), Ld2001 (葡萄糖酸銻鈉耐受型，SSG的IC5q = 4.1 mg/mL)和Ld39 (葡萄糖酸 銻鈉耐受型，SSG的IQ(^6.4mg/mL)的前鞭毛體。沒有葡萄糖酸銻鈉添加 到野生型杜氏利什曼原蟲(LdAG83， SSG的ICso = 1.5 mg/mL)中。在存在 160ng/mL長春堿的情況下培養LeV160的前鞭毛體。不將噴他脒和長春堿 (Sigma)添加到Le野生型和Z^MDi / -a突變體中。
通過短暫離心(spin down)50 mL的四日齡前鞭毛體(對數生長期后期)制 備杜氏利什曼原蟲的無鞭毛體，并將其轉移到含M199培養基(Gibco)、 0.5% 的Trypto大豆酪蛋白、3mML-半胱氨酸、15mMD-葡萄糖、5mML-谷氨 酰胺、4mM NaHC03 、 25mM HEPES 、 O.OlmM浴銅靈二磺酸 (bathocuproine-disulfomc acid)和0.023mM氯化血紅素的無菌培養基中。然 后將細胞在37X:培育24小時。無鞭毛體變成卵形，可用于藥物累積檢測。
細胞活力檢測
釆用四嗖化合物(MTS)和電子偶合劑吩嗪硫酸甲酯(PMS)通過Cell Titer 96 Aqueous Assay(Promega)測定前鞭毛體的活力。將前鞭毛體以1 x105細胞 /每孔接種在96孔平底微量滴定板中，每孔中培養基的最終體積為100)iL。 為了測定類黃酮二聚物對寄生蟲的細胞毒性作用，將各種濃度的類黃酮二 聚物添加到前鞭毛體中。為了測定具有不同間隔基長度的類黃酮二聚物的 逆轉作用，將各種濃度的抗利什曼原蟲藥物(噴他脒或SSG、長春堿和嘌呤 毒素中的一種)添加到含有或不含有類黃酮二聚物的孔中。將寄生蟲在27°C 培育72小時。各實驗中以一式三份的方式測試含有或不含有類黃酮二聚物的各種濃度的抗利什曼原蟲藥物。將2 mg/mL MTS和0.92 mg/mL PMS以 20:1(MTS:PMS)的比例混合。培育72小時后，將10|iLMTS:PMS混合物添 加到微量滴定板的各個孔中。然后在27。C將所述板培育4小時以顯色。培 育4小時后，采用自動微量滴定板讀數儀(Bio-Rad)在490 nm測定OD值。 結果以存活％(含有測試化合物的各孔的OD值除以未處理的對照孔的OD 值)表示。
通過HPLC檢測噴他脒累積
研究了類黃酮二聚物對噴他脒累積的作用。將lmL的四日齡前鞭毛體 (對數生長期后期，細胞密度為約2xl()8細胞/mL)與0.84mM噴他脒和各 種濃度(包括OpM、 15juM、 30juM和60jliM)的類黃酮二聚物(9d)—起于 27。C在暗處培育3小時。在獨立的實驗中，以一式三份的方式檢測各濃度 的9d并重復兩次。培育3小時后，以pH7.4的冷PBS洗滌寄生蟲三次。然 后將細胞團溶于350)iL的75%乙腈中，并通過反復的冷融循環使細胞團裂 解。細胞裂解后，將裂解的細胞懸浮物于4。C在14,000g離心10分鐘。收 集上清液，準備用于采用HPLC(Agilent 1100系列)測定噴他脒濃度。在保 持在40。C的ZorbaxODS C18柱(4.6mmx25cm， 5微米)上分析噴他脒蓄積。 流動相由用于泵A的水(IO mM四甲基氯化銨(TMAC)、 10 mM庚烷磺酸鈉 (SHS)、 4.2 mM磷酸(PA))和用于泵B的含75。/o乙腈(ACN)的水(10 mM TMAC、 10mMSHS、 4.2mMPA)組成。分析前將所述柱在4(TC過夜以使 之達到平衡。采用1.0 mL/分鐘的流速和265 nm處的信號，以58%泵A和 42%泵B進行分析。噴他脒的保留時間為3.2分鐘。化合物9d在這些條件 下不會流出。為了繪制標準曲線，將2.5mg噴他脒羥乙基磺酸鹽溶解在21 mL 75%的ACN(10 mM TMAC、 10 mM SHS、 4.2mMPA)中，從而配制出 噴他脒羥乙基磺酸鹽的200pM儲備溶液。然后通過連續稀釋得到100pM、 50pM、 25jiM和13]aM的濃度，使得能夠繪制標準曲線。采用ICP-MS檢測總銻[Sb(m)和Sb(V)]累積
研究了類黃酮二聚物對葡萄糖酸銻鈉(SSG)的累積的作用。由于無鞭毛 體對SSG更敏感，因此與前鞭毛體相比，無鞭毛體累積更多的SSG。因此， 選擇無鞭毛體用于研究Sb累積檢測。將lmL的四日齡無鞭毛體(2"08細 胞/mL)與0.05mM SSG和不同濃度的類黃酮二聚物(9d)(包括OpM、 30pM 和60jiM) —起在37。C培育3小時。在獨立的實驗中，以一式三份的方式 檢測各濃度的9d并重復兩次。培育3小時后，以pH7.4的冷PBS洗滌寄生 蟲三次。然后于室溫將細胞團在200pL濃硝酸中溶解24小時。以蒸餾水將 樣品稀釋至3 mL，使得總Sb溶液的最終濃度為約5 ppb。然后將其注入 ICP-MS(Perkin-Elmer)以進行定量。以銦(In，m/z: 115)作為內標來測定銻， 其m/z比為121和123。用于樣品預處理的所有化學品都至少是分析級的， 蒸餾水按原樣直接使用，未經進一步純化。
結果
噴他脒耐受型豚鼠利什曼原蟲(LePentR50)和SSG耐受型杜氏利什曼原 蟲(Ld39和Ld2001)
采用三種藥物耐受型利什曼原蟲細胞系，即，LePentR50(噴他脒耐受型 豚鼠利什曼原蟲)、Ld39和Ld2001(SSG耐受型杜氏利什曼原蟲)來研究本發 明合成的類黃酮二聚物對藥物耐受性的調節活性。LePentR50是在發明人的 實驗室中通過逐步選擇方式(未發表)得到的噴他脒耐受型豚鼠利什曼原蟲 細胞系。將其保存于存在50(ig/mL噴他脒的條件下，IC5o為約117pg/mL， 而野生型豚鼠利什曼原蟲(Le)的ICso為約8.7pg/mL (圖13A)。 Ld39和 Ld2001是兩種對五價銻葡萄糖酸銻鈉(SSG)(2)具耐受性的杜氏利什曼原蟲 細胞系。Ld39和Ld2001保存于存在3.5ng/mLSSG的條件下，1<:5()分別為 約6.1 mg/mL和4.1 mg/mL，而野生型杜氏利什曼原蟲(LdAG83)的IC50為 約2.4mg/mL (圖13B)。合成的類黃酮二聚物對利什曼原蟲寄生蟲的體外細胞毒性 通過基于MTS的細胞增殖法測定本發明的類黃酮二聚物在各利什曼原
蟲細胞系中的細胞毒性。表3總結了各合成調節劑對LePentR50、 LdAG83 和L39的ICsQ值。噴他脒耐受型LePentR50對一些類黃酮二聚物(9a至9f,10a 和10b)相對更具耐受性，IC5o范圍是40jiM 大于200(^vI。除9c和9d夕卜， 杜氏利什曼原蟲LdAG83和Ld39對合成的類黃酮二聚物的敏感性與豚鼠利 什曼原蟲相當。發現LdAG83(9c的ICso為8士0.3mM， 9d的ICso為7±0.4MM) 和Ld39(9c的ICso為11土0.7piM， 9d的IC5()為10士0.9pM)對9c和9d比 LePentR50更敏感。豚鼠利什曼原蟲和杜氏利什曼原蟲之間的物種差異僅限 于芹菜素二聚物9c和9d。這兩個物種對芹菜素單體和具有3個乙二醇單元 (10a)或4個乙二醇單元(10b)的芹菜素具有相等的敏感性(表3)。杜氏利什曼 原蟲(LdAG83和Ld39)對9c和9d的超敏性可能意味著這兩個序菜素二聚物 可用作抗杜氏利什曼原蟲劑。
表3.杜氏利什曼原蟲(LdAG83和Ld39)對9c和9d的超敏性可能意味 著這兩個芹菜素二聚物可用作抗杜氏利什曼原蟲劑
表3.合成的類黃酮對利什曼原蟲寄生蟲的IC
IC50(,
LePentR50LdAG83Ld39
>200a95±3.2117±10
9b>200a>200a>200a
9c>200a8±0.311±0.7
9d>200a7±0.410±0.9
9e70±3.030±1.242±2.3
9f40±5.311±2.013±0.6
9h陽lND12±0.214±0.1
9iND10±0.314±0.1
9jND>200a>200a
9k-1ND50±760±3
10a>200a>200a>200a
10b>200a>200a>200a
芹菜素55±2.632±4.143±5.9
通過基于MTS的增殖檢測測定了各合成黃酮的ICso值。各IC5o值通過至少兩次獨
立的實驗獲得，每次實驗中測定一式三份。
66a因為這些調節劑在所測試的最高濃度(200nM)不具有任何細胞毒性作用，所以無
法測定IC50值。
ND:沒有測定這些調節劑的ICso值，但觀察到在12nM沒有細胞毒性作用，12pM 是用于研究藥物耐受性調節活性的濃度的兩倍。
合成的類黃酮二聚物對調節LePentR50的噴他脒耐受性的作用 經DMSO處理的LePentR50對噴他脒的ICso為約117.0士3.0)ig/ml (圖 14A)。 6岸的化合物9c (n=3) (IC50=40.0±2.7ng/mL， P〈0.01)和9d (n=4) (IC50=39.2rh2.1|ag/mL, PO,01)顯著降低LePentR50的IC50，降低了約3倍(圖 14A)。具有更短的接頭(9a(IC5tr90土4.8^g/mL)和9b(IC5o=89.2±8.92pg/mL》 或具有更長的接頭長度(9e(IC5(T90士7.88iig/mL)、 9f(IC50=75±10.99ng/mL)、 9h-l(IC50=106±2.7|ig/mL)、 9i(IC50=73±3.54ng/mL)、 9j(IC50=134±5.4(ig/mL) 和9k-l (IC5。=130±6.1pg/mL))的其他類黃酮二聚物具有小于一半的調節活 性或沒有調節活性(圖14A)。類黃酮二聚物的接頭長度和調節活性之間的 "U"型關系可能表明芹菜素部分的靶標之間存在相對確定的間隔。具有三 個或四個乙二醇單元的芹菜素單體對照化合物(10a和lOb)即使以兩倍濃度 (12pM)使用也不顯示任何調節活性(圖14A; IC5。分別為100.0士5.0(ig/mL和 98.5±8.5pg/mL)。這可能表示9c和9d的調節活性實際上是由于它們的二聚 性質。芹菜素部分的簡單的摩爾數增加不導致任何顯著的調節活性。作為 對照，n=3和4(三PEG接頭和四PEG接頭)的接頭不具有任何逆轉作用(圖 14A)。
合成的類黃酮二聚物對調節Ld39和Ld2001的SSG耐受性的作用 還研究了本發明的類黃酮二聚物對調節Ld39和Ld2001前鞭毛體的 SSG耐受性的作用。在所述類黃酮二聚物中(以6pM使用)，9c和9d在調 節杜氏利什曼原蟲Ld39前鞭毛體的SSG耐受性方面是最有效的。Ld39的 SSG IC50由6.4±0.7 mg/mL(經DMSO處理)降至2.3±0.2 mg/mL(經9c處理)和2.3士0.3 mg/mL(經9d處理)(圖14B)。與在LePentR50中的噴他脒耐受性 相似，具有較短接頭(9a和9b)或具有較長接頭(9e至9j)的化合物不顯示實 質的SSG耐受性調節活性(圖14B)。芹菜素10a和10b即使以12pM使用也 不顯示任何顯著的調節活性(圖14B)。 n=3 (三PEG接頭)或n4(四PEG接 頭)的對照接頭也無效果C圖14B)。
實質上，當研究其他SSG耐受型杜氏利什曼原蟲Ld2001時，觀察到 相似的模式(圖14C)。化合物9c和9d是最有效的，可將Ld2001的SSG IC50 由6.6 mg/mL(DMSO對照)分別降至1.5 mg/mL(9c)和1.0 mg/mL(9d)(圖 14C)。
不過，所有的合成類黃酮調節劑(包括9c和9d)對SSG敏感型的野 生型杜氏利什曼原蟲LdAG83均不具有調節作用。含有或不含有任何調節 劑時，ICs。值都保持幾乎相同(圖14D)。這可能表明9c和9d特異性靶向 在SSG耐受型寄生蟲中唯一存在或足量存在的蛋白質，而該蛋白質在SSG 敏感型寄生蟲中不存在或很少表達。
合成的類黃酮二聚物9c和9d對LePentR50中的噴他脒耐受性和噴他 脒累積顯示劑量依賴性調節活性
根據上述結果研究了兩種最有效的調節劑，即9c(含3個乙二醇單元) 和9d(含4個乙二醇單元)對調節LePentR50的噴他脒耐受性的劑量作用。 當單獨以60)ag/ml噴他脒處理時，LePentR50的存活率僅略微下降(是未處 理的94.0±2.3%)。不過，以60 )ig/ml的噴他脒和漸增濃度的9c 一起處理時， 導致LePentR50的存活率的逐漸降低，表明9c可以以劑量依賴方式調節 LePentR50的噴他脒耐受性(圖15A)。 9c的ECs。(在存在60ng/ml噴他脒時， 導致LePentR50存活率為50%的9c有效濃度)為約1.85pM。對于化合物9d也進行了類似的觀察(圖15B)。對于9d，濃度高達6pM時仍未觀察到毒性。 9d的EC5。為約0.94pM。因此化合物9d在調節LePentR50的噴他脒耐受性 方面的效果是9c的約兩倍。
也研究了 9d對LePentR50的噴他脒累積的作用。采用更高濃度的 9d(15fiM、 30liM和60jiM)和更短的培育時間(3小時)以測定噴他脒累積。 化合物9d可以以劑量依賴方式增加LePentR50的噴他脒累積(圖16)。當 9d的濃度由O增加至15(iM、 30jiM和60pM時，LePentR50的分子內噴他 脒濃度由2.0士0.2pM噴他脒/mg蛋白質分別逐漸增加至2.95±0.01 |iM噴他脒 /mg蛋白質、4.69士0.51^iM噴他脒/mg蛋白質和26.6±0.6|iiM噴他脒/mg蛋白 質(圖16)。這表明9d通過增加噴他脒累積調節LePentR40的噴他脒耐受 性。以60mM的9d培育LePentR50 3小時不產生任何細胞毒性(數據未示 出)。因此，據信噴他脒累積的劑量依賴性增加是由于9d的調節作用，而 不是由于其對LePentR50的細胞毒性作用。
合成的類黃酮二聚物9c和9d對Ld39細胞中的SSG耐受性和SSG累 積顯示劑量依賴性調節活性
與LePentR50類似，9c和9d均對Ld39前鞭毛體的SSG耐受性顯示劑 量依賴性調節作用(圖17A和17B)。 4pM的9c或9d可將Ld39的SSG耐 受性水平恢復至LdAG83敏感菌株的水平(圖17A和17B)。據信9d的調 節作用對僅存在于Ld39上的靶蛋白具有特異性，這是因為即使以高達6pM 的濃度使用，9d對LdAG83的SSG敏感性也不具任何調節作用(圖17C)。
已研究了 9d對杜氏利什曼原蟲無鞭毛體的SSG累積的作用。通過使寄 生蟲在37。C適應24小時來產生無菌無鞭毛體。光學顯微鏡顯示細胞已圓起 (roundup)(數據未示出)。
69在SSG累積實驗中，采用了更高濃度的9d(30pM和60jiM)和更短的培 育時間(3小時)以測定SSG累積。不存在9d時，Ld39和Ld2001的SSG累 積分別是LdAG83的SSG累積的28%和15% (圖17D)。以30pM的9d處 理時，Ld39和Ld2001的SSG累積分別增加至LdAG83的SSG累積的74% 和83% (圖17D)。當9d的濃度進一步增加至60pM時，Ld39和Ld2001 的SSG累積分別是LdAG83的SSG累積的90%和69% (圖17D)。相反， 以9d (30|iM或60pM)處理的SSG敏感性LdAG83中的SSG累積與不經 任何處理的細胞中的SSG累積沒有明顯區別，表明二聚物9d似乎可以特異 性地抑制僅存在于SSG耐受型菌株中的ABC轉運體的功能(圖17D)。當 處理3小時，化合物9d在60|iM對杜氏利什曼原蟲不具有任何細胞毒性(數 據未示出)，證實了SSG累積的增加是由于9d的調節作用，而不是由于其 細胞毒性作用。
9c和9d的調節活性與其他傳統MDR調節劑的調節活性的比較 比較了 9c和9d的調節活性與維拉帕米、利血平、奎寧、米帕林、奎 尼丁的調節活性。對于LePentRiO而言，調節劑9c(IC5o = 47土l.^g/mL)禾口 9d(IC5Q = 35土2.3pig/mL)的調節活性與利血平(IC5。 = 40土1.3嗎/mL)和米帕林 (ICso-28.7士1.3嗎/mL)的調節活性相似，分別是約2.7、 3.7、 3.2禾n 4.5倍噴 他脒增敏性(圖18A)。相反，當采用維拉帕米、奎寧和奎尼丁時，僅顯示 小于半倍的增敏性(圖18A)。關于Ld39中的SSG耐受性調節活性，只有 9c和9d是有效的(ICso分別為2.3±0.1 mg/mL和1.8±0.05 mg/mL)，呈現3,1 倍和3.9倍的SSG增敏性(圖18B)。其他傳統的MDR化學增敏劑均不顯 示任何調節作用(維拉帕米、利血平、奎寧、米帕林、奎尼丁的IQ。分別 為7.2士0.54 mg/mL、 7.2±0.3 mg/mL、 7.0±0.21 mg/mL、 6.7士0.11 mg/mL禾口 7.2逸04mg/mL)(圖18B)。本發明的類黃酮二聚物也可能通過兩個NBD結合至ABC轉運體。已 通過研究合成的類黃酮二聚物對三種豚鼠利什曼原蟲細胞系[即，野生型 Le，丄eMDW敲除型(ZeMDi^-/-)和hMZ^/過度表達型(LeV160)]的調節 作用，研究了豚鼠利什曼原蟲中的ABC轉運體、LeMDRl是否是合成的類 黃酮二聚物的耙標的可能性。發現噴他脒耐受性與Z^kTDi 7的復制數負相 關。ZeMDi 7 -/-、Le和LeV160的噴他脒ICso分別是18.9±0.8ng/mL、 12.0士0.8 lig/mL和9.0士0.1 |ug/mL (表4)。當測試合成的類黃酮二聚物組對LeMZ)7 / -/-的噴他脒耐受性的調節活性時，發現9c和9d是有效的，分別將噴他脒的 IC50降低至5±0.3 pg/mL和4.6±0.4嗎/mL，呈現3.8倍和4.1倍的增敏性(表 4)。化合物9b(IC50=9.4±0.4 fig/mL)和9h-l(IC50=8.2±0.5 pg/mL)分別顯示2.0 倍和2.3倍的增敏性。不過，9a (IC50=18±1.0 jig/mL)、 9e (IC50=12.5±0.1 Hg/mL) 、 9f (IC50=12.5±0.8 |ng/mL) 、 9i (IC50=13.8±0.7 jig/mL) 、 9j (IC50=20.9±1.3 pg/mL)和9k-l (IC5 =20.9±3 lig/mL)提供小于一半或很小的 增敏作用(表4)。對所有的類黃酮二聚物進行分析時，發現乙二醇接頭長 度和噴他脒耐受性調節活性之間存在"U"型關系。這與在LePentR50中所 發現的(圖14A)相似。
在Le野生型細胞中，9d(IC^4士0.3嗎/mL)顯著降低噴他脒的IC50，由 l2.0+0.8|ig/mL降低至傘0士0.8iig/mL(降低約3倍)(表4)。在￡eMDi^過度 表達型LeV160中，9c (IC5o=5.0±0.4 pg/mL)和9d (IC5()=4.7±0.1嗎/mL)略微 降低噴他脒的IC50，由9.0±0.1 pg/mL分別降低至5.0±0.4 pg/mL和4.7±0.1 昭/mL(降低約1.8倍禾卩1.9倍)(表4)。不過，化合物9e (IC50=7.5±0.3叫/mL)、 9f (IC50=7.2±0.3 )ig/mL)和9i (IC50=6.8±0.2 pg/mL)不提供增敏作用。
表4.合成的類黃酮二聚物對LeMDRl突變體的噴他脒耐受性的作用
71噴他脒的ICso(嗎/ml)長春堿的 IC50Og/ml)嘌呤毒素 IC50(pg/ml)
ZeMDi 7 -/-Le LeV160LeV160LeV160
無調節劑18.9±0.812.0±0.8 9.0±0.1167.0±3.616,0±1.0
18.0±1.0- -170.0±7.0-
9b9.4±0.4- -跳0±6.0-
9c5細.3- 5.0±0.4134.0±6.013.0±0.5
9d4.6±0.44.0±0.3 4.7±0.1140.0±2.315.0±0.6
9e12.5±0.1- 7.5±0,3170.0±2.319.0±0.4
9f12.5±0.8- 7.2±0.3165.0±2.317.0±1.0
9h-l8.2±0.5- -160.0±8.0-
9i13.8±0.7- 6.8±0.2165.0±2.319.0±0.8
9j20.9±1.3- -170.0±4.0-
9k-120.9±3.0- -150.0±6.0-
通過基于MTS的增殖檢測測定各藥物的IC5o值。
各IC5Q值由至少三次獨立的實驗獲得，各實驗中測定一式三份。
"-"表示未測定。
本發明的類黃酮二聚物可調節噴他脒耐受性而與LeMDRl的復制數無 關，這一觀察結果表明LeMDRl不是所述合成的類黃酮二聚物的耙標，已 知LeMDRl是造成豚鼠利什曼原蟲中的長春堿和嘌呤毒素耐受性的原因 (Sequence requirements of the ATP-binding site within the C-terminal nucleotide-binding domain of mouse P-glycoprotein: structure-activity relationships for flavonoid binding. Biochemistry 2001， 40， 10382-91)。發現各 類黃酮二聚物對長春堿和嘌呤毒素的耐受性均不具有任何顯著的調節活性 (表4),進一步表明合成的類黃酮二聚物并非耙向LeMDRl 。
討論
利什曼原蟲中的各種ABC轉運體與介導藥物耐受性有關 (Chemosensitizers in drug transport mechanisms involved in protozoan resistance, Curr. Drug Targets Infect Disord 2005, 5, 411-31)。這些ABC轉運 體包括杜氏利什曼原蟲中的Ldmdrl、亞馬遜利什曼原蟲中的Lamdrl和 Lamdr2、 tarentolae利什曼原蟲中的LtpgpA、熱帶利什曼原蟲中的Ltmdrl 、 豚鼠利什曼原蟲中的Lemdrl、墨西哥利什曼原蟲中的LmepgpA、碩大利什
72曼原蟲中的LmpgpA和碩大利什曼原蟲中的PEN。根據結構，可將其分成 ABCB型(Ldmdrl, Lamdrl， Lamdr2, Ltrmdrl， Lemdrl和PEN)和ABCC型 (LtpgpA, LmepgpA和LmpgpA)。 ABCB和ABCC轉運體均具有兩個NBD， 因此是類黃酮的潛在靶標。
受到MDR調節劑缺乏特異性以及對ABC轉運體的藥物結合點的親合 力較低的限制，目前無法成功地戰勝MDR。
上述結果顯示出本發明的類黃酮二聚物可抑制并逆轉寄生性疾病中的 噴他脒耐受性，特別是由利什曼原蟲類導致的那些寄生性疾病。具有兩個 通過三個或四個乙二醇單元連接的芹菜素的化合物9c或9d對噴他脒耐受 性和SSG耐受性均顯示最高的調節活性，IC5o降低約3倍。具有更長或更 短的接頭長度的本發明的其他類黃酮二聚物也顯示較低的調節活性或不顯 示調節活性。即使以兩倍濃度(12)iM)使用，接頭中具有相同數目的乙二醇 的芹菜素單體(10a和10b)也不具有任何調節活性。這證明本發明的類黃酮 二聚物(特別是9c和9d)的調節活性不是由于結合至ABC轉運體上的類 黃酮的濃度加倍，而是由于這兩個芹菜素之間的乙二醇單元的鏈長度的作 用。在逆轉噴他脒耐受性和SSG耐受性方面具有最佳性能的鏈長度是3至 4個乙二醇單元。以9c和9d處理使得噴他脒和SSG的累積以劑量依賴性 的方式增加。該結果可能間接表明流出物轉運體正通過降低藥物累積來介 導噴他脒和SSG耐受性。
與其他傳統MDR調節劑相比，9c和9d顯示與利血平和米帕林相當的 噴他脒耐受性逆轉活性。在SSG耐受性的情況中，9c和9d具有顯著的調 節活性，而傳統MDR調節劑均不起作用。
雖然已通過實施例詳細描述了本發明的優選實施方式，但本發明的修改和調整對本領域技術人員是顯而易見。此外，不應將本發明的實施方式 解釋為僅限于實施例或附圖。不過，特別應當理解的是，這樣的修改和調 整都在下面的權利要求所限定的本發明的范圍內。例如，作為一個實施方 式的一部分列舉或描述的特征可用于其他實施方式以得到另一個實施方 式。因此，本發明意圖涵蓋包含在權利要求范圍內的這樣的修改和調整以 及它們的等同物。
權利要求
1. 一種式I化合物類黃酮-接頭-類黃酮I其中，所述類黃酮選自由查耳酮、黃酮、黃酮醇、黃烷酮、花色素苷和異類黃酮組成的組；并且所述接頭是具有至少一個碳原子的基團。
2. 如權利要求1所述的化合物，其中，所述接頭選自由亞烷基、具有 多個乙二醇單元的基團、具有多個丙二醇單元的基團、具有多個鄰亞苯基 二氧基、間亞苯基二氧基或對亞苯基二氧基單元的基團或它們的組合組成 的組。
3. 如權利要求2所述的化合物，其中，所述接頭是具有多個乙二醇單 元的基團。
4. 如權利要求3所述的化合物，其中，所述接頭具有1至13個乙二醇 單元。
5. 如權利要求4所述的化合物，其中，所述接頭具有2至6個乙二醇 單元。
6. 如權利要求5所述的化合物，其中，所述接頭具有2至4個乙二醇 單元。
7. 如權利要求6所述的化合物，其中，所述接頭具有4個乙二醇單元。
8. 如權利要求1所述的化合物，其中，所述類黃酮是黃烷酮。
9. 如權利要求1所述的化合物，其中，所述黃烷酮是斧菜素。
10. —種合成式I化合物的方法，所述式I化合物是類黃酮-接頭-類黃酮其中，所述類黃酮是黃烷酮；并且所述接頭是具有多個乙二醇單元的基團；所述方法包括下述步驟a)使對羥基苯甲醛與式II化合物反應以形成式III化合物，所述式n 和式III化合物如下所示 其中，E^選自-H、-甲苯磺酰基和-甲磺酰基；和b)使式III化合物與式IV化合物反應以形成式I化合物，所述式IV化合物如下所示g中，所述類黃酮是黃烷酮；并且所述接頭是具有多個乙二醇單元的基團；所述方法包括下述步驟a)使對羥基苯甲醛與式IV化合物反應以形成式V化合物，所述式IV其中，R2選自由-H、芐基和甲氧基甲基組成的組。
11. 一種合成式I化合物的方法，所述式I化合物是類黃酮-接頭-類黃酮和式V化合物如下所示:<formula>formula see original document page 4</formula>其中，R2選自由-H、芐基和甲氧基甲基組成的組；禾口b)使式V化合物與式II化合物反應以形成式I化合物，所述式II化合物如下所示<formula>formula see original document page 4</formula>II其中，R,選自-H、-甲苯磺酰基禾口-甲磺酰基。
12. —種降低基于P-糖蛋白的多藥耐藥性的方法，所述方法包括施用有效量的式I化合物的步驟，所述式I化合物是類黃酮-接頭-類黃酮<formula>formula see original document page 4</formula>I其中，所述類黃酮選自由查耳酮、黃酮、黃酮醇、黃烷酮、花色素苷和異類黃酮組成的組；并且所述接頭是具有至少一個碳原子的基團。
13. 如權利要求12所述的方法，其中，所述接頭選自由亞烷基、具有 多個乙二醇單元的基團、具有多個丙二醇單元的基團、具有多個鄰亞苯基 二氧基、間亞苯基二氧基或對亞苯基二氧基單元的基團或它們的組合組成的組。
14. 如權利要求13所述的方法，其中，所述接頭是具有多個乙二醇單 元的基團。
15. 如權利要求14所述的方法，其中，所述接頭具有1至13個乙二醇 單元。
16. 如權利要求15所述的方法，其中，所述接頭具有2至6個乙二醇 單元。
17. 如權利要求16所述的方法，其中，所述接頭具有2至4個乙二醇 單元。
18. 如權利要求17所述的方法，其中，所述接頭具有4個乙二醇單元。
19. 如權利要求12所述的方法，其中，所述類黃酮是黃烷酮。
20. 如權利要求12所述的方法，其中，所述黃烷酮是芹菜素。
21. 如權利要求12所述的方法，其中，所述式I化合物的濃度為5 ^M 30 nM。
22. —種降低寄生性疾病中的藥物耐受性的方法，所述方法包括施用有 效量的式I化合物的步驟，所述式I化合物是類黃酮-接頭-類黃酮I其中，所述類黃酮選自由査耳酮、黃酮、黃酮醇、黃烷酮、花色素苷和異類黃酮組成的組；并且所述接頭是具有至少一個碳原子的基團。
23. 如權利要求22所述的方法，其中，所述接頭選自由亞烷基、具有 多個乙二醇單元的基團、具有多個丙二醇單元的基團、具有多個鄰亞苯基 二氧基、間亞苯基二氧基或對亞苯基二氧基單元的基團或它們的組合組成 的組。
24. 如權利要求23所述的方法，其中，所述接頭是具有多個乙二醇單元的基團。
25. 如權利要求24所述的方法，其中，所述接頭具有1至13個乙二醇 單元。
26. 如權利要求25所述的方法，其中，所述接頭具有2至6個乙二醇 單元。
27. 如權利要求26所述的方法，其中，所述接頭具有2至4個乙二醇 單元。
28. 如權利要求27所述的方法，其中，所述接頭具有4個乙二醇單元。
29. 如權利要求22所述的方法，其中，所述類黃酮是黃烷酮。
30. 如權利要求22所述的方法，其中，所述黃烷酮是芹菜素。
31. 如權利要求22所述的方法，其中，所述式I化合物的濃度為4 pM 60 )uM。
32. 如權利要求22所述的方法，其中，所述寄生性疾病是由利什曼原 蟲屬導致的。
33. 如權利要求29所述的方法，其中，所述寄生性疾病是由選自由杜 氏利什曼原蟲、亞馬遜利什曼原蟲、to /7totoe利什曼原蟲、熱帶利什曼原 蟲、豚鼠利什曼原蟲、墨西哥利什曼原蟲和碩大利什曼原蟲組成的組中的 一種寄生蟲引起的。
34. 如權利要求22所述的方法，其中，所述藥物選自由葡萄糖酸銻鈉 和噴他脒組成的組。
35. 如權利要求34所述的方法，其中，所述藥物的濃度為1 mg/mL至 6.4 mg/mL。
36. 有效量的式I化合物在制備用于降低基于P-糖蛋白的多藥耐藥性的藥劑方面的用途，所述式I化合物是類黃酮-接頭-類黃酮I其中，所述類黃酮選自由査耳酮、黃酮、黃酮醇、黃烷酮、花色素苷和異類 黃酮組成的組；并且所述接頭是具有至少一個碳原子的基團。
37. 有效量的式I化合物在制備用于降低藥物在寄生性疾病中的耐受性 的藥劑方面的用途，所述式I化合物是類黃酮-接頭-類黃酮 I其中，所述類黃酮選自由查耳酮、黃酮、黃酮醇、黃垸酮、花色素苷和異類 黃酮組成的組；并且所述接頭是具有至少一個碳原子的基團。
38. —種用于降低基于P-糖蛋白的多藥耐藥性或用于降低寄生性疾病 中的藥物耐受性的藥劑，所述藥劑包含權利要求1至8中任一項所述的化
39. 如權利要求38所述的藥劑，其中，所述藥物用于治療癌癥。
全文摘要
多藥耐藥性(MDR)是癌癥化學治療中的主要問題。最好的特征性耐藥機制是由將各種抗癌藥物泵出細胞、導致細胞內藥物累積量降低的藥物流出轉運體——滲透性糖蛋白(P-gp)的過度表達所介導的機制。本發明開發了一系列通過各種長度的連接基團連接在一起的類黃酮二聚物。發現這些類黃酮二聚物是增加抗癌藥物的體外細胞毒性并大大增強它們的細胞內藥物累積的有效的P-gp調節劑。發現本發明的類黃酮二聚物也可用于在治療寄生性疾病時降低藥物耐受性。
文檔編號C07D311/30GK101454305SQ200780018290
公開日2009年6月10日 申請日期2007年5月9日 優先權日2006年5月19日
發明者周銘祥, 陳德恒 申請人:香港理工大學;麥吉爾大學