專利名稱：用于鑒定黃瓜黑斑病抗性的引物序列及其鑒定方法
技術領域：
本發明涉及生物技術中的DNA序列，及其利用DNA序列鑒定黃瓜黑斑病抗性的方法。
背景技術：
黃瓜漂斑病[Cucumber alternaria leaf spot，Alternaria cucumerina]俗稱“黃點病”，是由瓜鏈格孢菌引起的真菌性病害，目前已成為為害黃瓜保護地栽培的重要病 害之一。該病主要危害葉片，一般先從黃瓜的中、下部葉片開始發生，而后逐漸向上蔓延，病 斑沿葉脈兩側的葉肉組織發展，主脈一般不受害。最后僅剩下頂端幾片綠葉，病株似火烤 狀。重病株除心葉外，均可染病。病斑初為褪綠色近圓形斑點，后為邊緣清晰的圓形或近圓 形病斑，中央灰白色，邊緣淡黃色。葉面病斑稍突起，表面粗糙，葉背面病斑常呈水浸狀，周 圍常有褪綠暈圈。病斑多在葉脈之間，在高溫高濕條件下，病斑上生稀疏的灰褐色霉層(典 型癥狀)。病斑直徑一般為5 6毫水，最大的約10毫米，發病嚴重時，常數個病斑連片匯 合，嚴重時葉肉組織枯死，病斑連片，葉緣向上卷起，導致葉片焦枯，似火烤狀，但不脫落。黃 瓜黑斑病一般在4月中旬至5月上、中旬發生，發病率高達60%以上，減產10 20%。黃瓜黑斑病是黃瓜生產上的重要病害。查閱國內外文獻，迄今為止，有關黃瓜黑 斑病的抗性遺傳規律和分子標記輔助育種研究尚缺乏系統的研究和報道。因而將黃瓜抗 黑斑病基因與不抗黑斑病的其它品種的優良品質基因相結合，培育優良抗病的黃瓜新品 種和創造黃瓜新種質是生產實踐中亟需解決的實際問題。近年來，我國黃瓜遺傳育種取 得很大成績，通過常規育種已經育成許多優良品種在生產上推廣應用。與常規育種相比， 分子標記可以直接以DNA的形式表現，在生物體的各個組織、各個發育階段均可檢測到， 不受季節、環境限制，不存在表達與否等問題。因此，加強分子標記輔助選擇技術在作物 育種上的應用研究具有重要的實踐意義。它使育種學家能直接從分子水平了解物種間的 差異，也使育種過程更直觀，目的性更強。這將推動傳統的“經驗育種”向高效的“精確育 種”轉變，將會大幅度提升育種效率和技術水平。利用“分子標記輔助選擇”(Molecular marker-assistedselection, MAS)，則可在早代對表現優良的基因型進行鑒定，從而大大提 高育種效率。將分子遺傳技術應用于抗病遺傳育種的研究上，為材料的選擇提供了全新的 手段，苗期即可在DNA水平上對目標性狀進行選擇，而且穩定可靠，不受環境因素及季節的 限制，增強選擇的準確性和可靠性，加快育種進程，因此具有廣闊的應用前景。病害對作物的影響在諸多自然逆境因素中占首位，其危害往往造成產量和經濟的 巨大損失。推廣種植抗病品種是安全、環保和高效的控制策略。常規育種實踐中，對于抗黑 斑病材料的選擇比較困難一方面選育周期長；另一方面黑斑病的發生極易受環境等多種 因素的干擾(溫度、濕度、病菌等)，鑒定抗性材料的過程不容易控制。分子標記技術在尋找 與目標性狀連鎖的分子標記方面已有諸多報道，但與黃瓜黑斑病抗性相關基因緊密連鎖的 分子標記目前尚未見報道。在利用分子標記進行抗性鑒定的過程中，特異性的引物序列是 關鍵。

發明內容
本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種用于鑒定黃瓜黑斑病抗性的引物 序列；本發明的另一個目的是提供一種鑒定黃瓜黑斑病抗性的方法；本發明的第三個目的是提供另一種用于鑒定黃瓜黑斑病抗性的引物序列；本發明的最后一個目的是提供另一種鑒定黃瓜黑斑病抗性的方法。
本發明的技術方案概述如下一種用于鑒定黃瓜黑斑病抗性的引物序列，其特征是它由上游引物和下游引物組 成，上游引物是序列表中SEQ ID Nol所述的核苷酸序列，下游引物是序列表中SEQ ID No2 所述的核苷酸序列。一種鑒定黃瓜黑斑病抗性的方法，包括如下步驟(1)提取黃瓜基因組DNA ；(2)進行PCR擴增在PCR擴增專用薄壁管中放入所述黃瓜基因組DNA15 30ng、 序列表中SEQ ID Nol所述的核苷酸序列20 40ng、序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸 序列 20 40ng、dNTP0. 15 0. 25mM、Mg2+l. 2 2. 0mM、l 倍的 PCR 緩沖液、Taq DNA 聚合酶 0. 8 1. 2單位，加無菌重蒸餾水至20 μ 1，將所述PCR擴增專用薄壁管放入PCR儀中擴增， 擴增條件為94°C預變性180 300秒，94°C變性60秒，54 60°C退火40 60秒，72°C延 伸60 120秒，25 35個循環，再72 °C延伸300 420秒，擴增完成；(3)PCR擴增產物的凝膠電泳分析將擴增產物采用5%變性聚丙烯酰胺凝膠進行 電泳分離；在擴增產物中加入變性凝膠上樣緩沖液，上樣于經30分鐘預電泳的變性聚丙烯 胺凝膠上，70W恒功率電泳至溴酚蘭剛剛到達凝膠的另一端，凝膠經硝酸銀染色后在可見光 下觀察、照相；(4)依據各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對位置，鑒定黃瓜黑斑病的抗性。第二種用于鑒定黃瓜黑斑病抗性的引物序列，其特征是它由上游引物和下游引物 組成，上游引物是序列表中SEQ ID No3所述的核苷酸序列，下游引物是序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列。第二種鑒定黃瓜黑斑病抗性的方法，包括如下步驟(1)提取黃瓜基因組DNA ；(2)進行PCR擴增在PCR擴增專用薄壁管中放入所述黃瓜基因組DNA15 30ng、 序列表中SEQ ID No3所述的核苷酸序列20 40ng、序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸 序列 20 40ng、dNTP0. 15 0. 25mM、Mg2+l. 2 2. 0mM、l 倍的 PCR 緩沖液、Taq DNA 聚合酶 0. 8 1. 2單位，加無菌重蒸餾水至20 μ 1，將所述PCR擴增專用薄壁管放入PCR儀中擴增， 擴增條件為94°C預變性180 300秒，94°C變性60秒，55 58°C退火40 60秒，72°C延 伸60 120秒，25 35個循環，再72°C延伸300 420秒，擴增完成；(3)PCR擴增產物的凝膠電泳分析將擴增產物采用5%變性聚丙烯酰胺凝膠進行 電泳分離；在擴增產物中加入變性凝膠上樣緩沖液，上樣于經30分鐘預電泳的變性聚丙烯 胺凝膠上，70W恒功率電泳至溴酚蘭剛剛到達凝膠的另一端，凝膠經硝酸銀染色后在可見光 下觀察、照相；
(4)依據各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對位置，鑒定黃瓜黑斑病的抗性。利用本發明的鑒定黃瓜黑斑病抗性的引物序列對構建的F2代分離群體和黃瓜種 質資源進行黑斑病抗性評價，其結果與人工接種鑒定符合率分別達95. 04%和94. 74%，與 抗黑斑病基因的連鎖遺傳距離為4. 96cM，而且具有快速、準確、不受環境條件影響等優點， 在黃瓜育種中進行資源抗性篩選具有很大的應用價值。


圖1為第一種鑒定黃瓜黑斑病抗性的擴增產物的電泳圖·Λ為指示DNA標準條帶 的分子量217bp ；B為抗性帶，C為感性帶，1 3、7-9為抗病單株；4 6、10 12為感病單 株，M為DNA標準，純合抗性株僅有抗性帶，純合感性株僅有感性帶，雜合類型則同時具有抗 性帶和感性帶。圖2為第二種鑒定黃瓜黑斑病抗性的擴增產物的電泳圖A為指示DNA標準條帶 的分子量217bp ；B為抗性帶，C為感性帶，1 3、7-9為抗病單株；4 6、10 12為感病單 株，M為DNA標準，純合抗性株僅有抗性帶，純合感性株僅有感性帶，雜合類型則同時具有抗 性帶和感性帶。圖3為利用第二種鑒定黃瓜黑斑病抗性的方法，獲得的黃瓜感黑斑病母本 P62-1-1和抗黑斑病父本W43-1-2雜交后代F2代分離情況圖譜5，9，11，12，16，25，26，29， 36,38,43,44,47 為抗病單株；7，8，13-15，18-20，27，31，33，42，45，46 為感病單株；1_4，6， 10，17，21-24，28，30，32，34，35，37，39，40，41為雜合類型單株；M為DNA標準，純合抗性株僅 有抗性帶，純合感性株僅有感性帶，雜合類型則同時具有抗性帶和感性帶。
具體實施例方式下面結合附圖及具體實施例對本發明作進一步的說明，下面的實施例可以使本專 業技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。實施例1一種鑒定黃瓜黑斑病抗性的方法(1)提取黃瓜基因組DNA ；(2)進行PCR擴增，在PCR擴增專用薄壁管中放入所述黃瓜基因組DNA20ng、序列 表中SEQ ID Nol所述的核苷酸序列30ng、序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列30ng、 dNTPO. 2mM、Mg2+L 5mM、l倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶1. 0單位，加無菌重蒸餾水至 20 μ 1，將所述PCR擴增專用薄壁管放入PCR儀中擴增，擴增條件為94°C預變性200秒， 94°C變性60秒，57°C退火50秒，72°C延伸90秒，30個循環，再72°C延伸350秒，擴增完成；(3)PCR擴增產物的凝膠電泳分析將擴增產物采用5%變性聚丙烯酰胺凝膠進行 電泳分離；在擴增產物中加入變性凝膠上樣緩沖液，于95°C變性300秒，上樣于經30分鐘 預電泳的變性聚丙烯胺凝膠上，70W恒功率電泳至溴酚蘭剛剛到達凝膠的另一端，凝膠經硝 酸銀染色后在可見光下觀察、照相；(4)依據各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對位置，鑒定黃瓜黑斑病的抗性。由于抗 病單株、感病單株或中間類型單株經擴增以后產生不同分子量的DNA片段，在凝膠上分離 時其在凝膠上的遷移速率不同，從而形成位置上存在差異的條帶，通過條帶在凝膠上的相對位置就可對黃瓜黑斑病材料的抗性進行快速鑒定。實施例2一種鑒定黃瓜黑斑病抗性的方法(1)提取黃瓜基因組DNA ；(2)進行PCR擴增在PCR擴增專用薄壁管中放入所述黃瓜基因組DNA15ng、序列 表中SEQ ID Nol所述的核苷酸序列20ng、序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列20ng、 dNTPO. 15mM、Mg2+L 2mM、l倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶0. 8單位，加無菌重蒸餾水至 20 μ 1，將所述PCR擴增專用薄壁管放入PCR儀中擴增，擴增條件為94°C預變性180秒， 94°C變性60秒，60°C退火40秒，72°C延伸60秒，25個循環，再72°C延伸300秒，擴增完成；
(3)PCR擴增產物的凝膠電泳分析將擴增產物采用5%變性聚丙烯酰胺凝膠進行 電泳分離；在擴增產物中加入變性凝膠上樣緩沖液，于95°C變性300秒，上樣于經30分鐘 預電泳的變性聚丙烯胺凝膠上，70W恒功率電泳至溴酚蘭剛剛到達凝膠的另一端，凝膠經硝 酸銀染色后在可見光下觀察、照相；(4)依據各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對位置，鑒定黃瓜黑斑病的抗性。實施例3一種鑒定黃瓜黑斑病抗性的方法(1)提取黃瓜基因組DNA ；(2)進行PCR擴增在PCR擴增專用薄壁管中放入所述黃瓜基因組DNA30ng、序列 表中SEQ ID Nol所述的核苷酸序列40ng、序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列40ng、 dNTPO. 25mM、Mg2+2. 0mM、l倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶1. 2單位，加無菌重蒸餾水至 20 μ 1，將所述PCR擴增專用薄壁管放入PCR儀中擴增，擴增條件為94°C預變性300秒， 94°C變性60秒，54 °C退火60秒，72 °C延伸120秒，35個循環，再72 °C延伸420秒，擴增完 成；(3)PCR擴增產物的凝膠電泳分析將擴增產物采用5%變性聚丙烯酰胺凝膠進行 電泳分離；在擴增產物中加入變性凝膠上樣緩沖液，于95°C變性300秒，上樣于經30分鐘 預電泳的變性聚丙烯胺凝膠上，70W恒功率電泳至溴酚蘭剛剛到達凝膠的另一端，凝膠經硝 酸銀染色后在可見光下觀察、照相；(4)依據各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對位置，鑒定黃瓜黑斑病的抗性。實施例4第二種鑒定黃瓜黑斑病抗性的方法(1)提取黃瓜基因組DNA ；(2)進行PCR擴增，在PCR擴增專用薄壁管中放入所述黃瓜基因組DNA20ng、序列 表中SEQ ID No3所述的核苷酸序列30ng、序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列30ng、 dNTPO. 2mM、Mg2+L 5mM、l倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶1. 0單位，加無菌重蒸餾水至 20 μ 1，將所述PCR擴增專用薄壁管放入PCR儀中擴增，擴增條件為94°C預變性200秒， 94°C變性60秒，57°C退火50秒，72°C延伸90秒，30個循環，再72°C延伸350秒，擴增完成；(3)PCR擴增產物的凝膠電泳分析將擴增產物采用5%變性聚丙烯酰胺凝膠進行 電泳分離；在擴增產物中加入變性凝膠上樣緩沖液，于95°C變性300秒，上樣于經30分鐘 預電泳的變性聚丙烯胺凝膠上，70W恒功率電泳至溴酚蘭剛剛到達凝膠的另一端，凝膠經硝酸銀染色后在可見光下觀察、照相；(4)依據各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對位置，鑒定黃瓜黑斑病的抗性。由于抗病單株、感病單株或中間類型單株經擴增以后產生不同分子量的DNA片段，在凝膠上分離 時其在凝膠上的遷移速率不同，從而形成位置上存在差異的條帶，通過條帶在凝膠上的相 對位置就可對黃瓜黑斑病材料的抗性進行快速鑒定。實施例5第二種鑒定黃瓜黑斑病抗性的方法(1)提取黃瓜基因組DNA ；(2)進行PCR擴增在PCR擴增專用薄壁管中放入所述黃瓜基因組DNA15ng、序列 表中SEQ ID No3所述的核苷酸序列20ng、序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列20ng、 dNTPO. 15mM、Mg2+L 2mM、l倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶0. 8單位，加無菌重蒸餾水至 20 μ 1，將所述PCR擴增專用薄壁管放入PCR儀中擴增，擴增條件為94°C預變性180秒， 94°C變性60秒，60°C退火40秒，72°C延伸60秒，25個循環，再72°C延伸300秒，擴增完成；(3)PCR擴增產物的凝膠電泳分析將擴增產物采用5%變性聚丙烯酰胺凝膠進行 電泳分離；在擴增產物中加入變性凝膠上樣緩沖液，于95°C變性300秒，上樣于經30分鐘 預電泳的變性聚丙烯胺凝膠上，70W恒功率電泳至溴酚蘭剛剛到達凝膠的另一端，凝膠經硝 酸銀染色后在可見光下觀察、照相；(4)依據各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對位置，鑒定黃瓜黑斑病的抗性。實施例6第二種鑒定黃瓜黑斑病抗性的方法(1)提取黃瓜基因組DNA ；(2)進行PCR擴增在PCR擴增專用薄壁管中放入所述黃瓜基因組DNA30ng、序列 表中SEQ ID No3所述的核苷酸序列40ng、序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列40ng、 dNTPO. 25mM、Mg2+2. 0mM、l倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶1. 2單位，加無菌重蒸餾水至 20 μ 1，將所述PCR擴增專用薄壁管放入PCR儀中擴增，擴增條件為94°C預變性300秒， 94°C變性60秒，40°C退火60秒，72°C延伸120秒，35個循環，再72°C延伸420秒，擴增完 成；(3)PCR擴增產物的凝膠電泳分析將擴增產物采用5%變性聚丙烯酰胺凝膠進行 電泳分離；在擴增產物中加入變性凝膠上樣緩沖液，于95°C變性300秒，上樣于經30分鐘 預電泳的變性聚丙烯胺凝膠上，70W恒功率電泳至溴酚蘭剛剛到達凝膠的另一端，凝膠經硝 酸銀染色后在可見光下觀察、照相；(4)依據各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對位置，鑒定黃瓜黑斑病的抗性。利用本發明的鑒定黃瓜黑斑病抗性的引物序列對構建的F2代分離群體和黃瓜種 質資源進行黑斑病抗性評價，其結果與人工接種鑒定符合率分別達95. 04%和94. 74%，與 抗黑斑病基因的連鎖遺傳距離為4. 96cM，而且具有快速、準確、不受環境條件影響等優點， 在黃瓜育種中進行資源抗性篩選具有很大的應用價值。
權利要求
一種用于鑒定黃瓜黑斑病抗性的引物序列，其特征是它由上游引物和下游引物組成，所述上游引物是序列表中SEQ ID No1所示的核苷酸序列，所述下游引物是序列表中SEQ IDNo2所示的核苷酸序列。
2.一種鑒定黃瓜黑斑病抗性的方法，它包括如下步驟(1)提取黃瓜基因組DNA；(2)進行PCR擴增在PCR擴增專用薄壁管中放入所述黃瓜基因組DNA15 30ng、序 列表中SEQ ID Nol所示的核苷酸序列20 40ng、序列表中SEQ ID No2所示的核苷酸序 列 20 40ng、dNTPO. 15 0. 25mM、Mg2+L 2 2. OmM, 1 倍的 PCR 緩沖液、Taq DNA 聚合酶 0.8 1.2單位，加無菌重蒸餾水至20μ 1，將所述PCR擴增專用薄壁管放入PCR儀中擴增， 擴增條件為94°C預變性180 300秒，94°C變性60秒，54 60°C退火40 60秒，72°C延 伸60 120秒，25 35個循環，再72°C延伸300 420秒，擴增完成；(3)PCR擴增產物的凝膠電泳分析將擴增產物采用5%變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳 分離；在擴增產物中加入變性凝膠上樣緩沖液，上樣于經30分鐘預電泳的變性聚丙烯胺凝 膠上，70W恒功率電泳至溴酚蘭剛剛到達凝膠的另一端，凝膠經硝酸銀染色后在可見光下觀 察、照相；(4)依據各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對位置，鑒定黃瓜黑斑病的抗性。
3.一種用于鑒定黃瓜黑斑病抗性的引物序列，其特征是它由上游引物和下游引物組 成，所述上游引物是序列表中SEQ ID No3所述的核苷酸序列，所述下游引物是序列表中SEQ IDNo2所述的核苷酸序列。
4.一種鑒定黃瓜黑斑病抗性的方法，它包括如下步驟(1)提取黃瓜基因組DNA；(2)進行PCR擴增在PCR擴增專用薄壁管中放入所述黃瓜基因組DNA15 30ng、序 列表中SEQ ID No3所示的核苷酸序列20 40ng、序列表中SEQ ID No2所示的核苷酸序 列 20 40ng、dNTPO. 15 0. 25mM、Mg2+L 2 2. OmM, 1 倍的 PCR 緩沖液、Taq DNA 聚合酶 0.8 1.2單位，加無菌重蒸餾水至20μ 1，將所述PCR擴增專用薄壁管放入PCR儀中擴增， 擴增條件為94°C預變性180 300秒，94°C變性60秒，55 58°C退火40 60秒，72°C延 伸60 120秒，25 35個循環，再72°C延伸300 420秒，擴增完成；(3)PCR擴增產物的凝膠電泳分析將擴增產物采用5%變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳 分離；在擴增產物中加入變性凝膠上樣緩沖液，上樣于經30分鐘預電泳的變性聚丙烯胺凝 膠上，70W恒功率電泳至溴酚蘭剛剛到達凝膠的另一端，凝膠經硝酸銀染色后在可見光下觀 察、照相；(4)依據各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對位置，鑒定黃瓜黑斑病的抗性。
全文摘要
本發明公開一種用于鑒定黃瓜黑斑病抗性的引物序列及其鑒定方法，引物序列是由序列表中SEQ ID No1、SEQ ID No2所述的核苷酸序列組成；鑒定黃瓜黑斑病抗性的方法，步驟是(1)提取黃瓜基因組DNA；(2)用序列表中SEQ ID No1、SEQ ID No2所述的核苷酸序列為引物進行PCR擴增；(3)擴增產物的凝膠電泳分析；(4)依據各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對位置，鑒定黃瓜黑斑病的抗性。利用本發明的引物序列對構建的F2代分離群體和黃瓜種質資源進行黑斑病抗性評價，其結果與人工接種鑒定符合率分別達95.04％和94.74％，與抗黑斑病基因的連鎖遺傳距離為4.96cM，而且具有快速、準確、不受環境條件影響等優點，在黃瓜育種中進行資源抗性篩選具有很大的應用價值。
文檔編號C12N15/11GK101845504SQ20101019795
公開日2010年9月29日 申請日期2010年6月11日 優先權日2010年6月11日
發明者李淑菊, 楊瑞環, 王惠哲, 管煒 申請人:天津科潤農業科技股份有限公司