專利名稱：生長激素融合蛋白的制作方法
技術領域：
本發明涉及嵌合多肽，所述的多肽含有與生長激素受體的受體結合區連接的經修飾的生長激素結合區；本發明還涉及所述修飾的生長激素結合區的串連物/低聚物。
GH是一種與調節哺乳動物生長和發育有關的激素大家族中的一員。人GH是一種22kDa的多肽，其與眾多生物學過程有關，例如，細胞生長，乳汁分泌，巨噬細胞活化以及能量新陳代謝調控。GH通過GH上稱為位點1和位點2的兩個獨立位點依次與膜結合的兩個GHR反應。位點1為高親和性結合位點，而位點2為低親和性位點。單獨的GH分子通過位點1與第一個GHR結合。隨后第二個GHR通過位點2加入從而形成GHR:GH:GHR復合體。該復合體隨后被內化，并活化信號傳導級聯從而導致基因表達改變。
GHR的胞外區存在兩個相連區域，每個大約100個氨基酸(SD-100)。其中C-末端SD-100區域(b)最接近細胞表面，而N-末端SD-100區域(a)離得最遠。一旦激素與形成的三聚復合體GHR-GH-GHR結合，這兩個區域的構象就會發生改變。
美國專利5849535公開了經修飾的GH，在此引為參考。對GH的該修飾發生在位點1和位點2結合位點。對位點1的修飾產生出一種對GHR親和力高于野生型GH的GH分子，這種修飾的GH分子具有激動劑活性。該文獻還公開了對位點2的修飾，該修飾產生GH拮抗劑。美國專利US5854026、US6004931、US6022711、US6057292和US6136563公開修飾GH而改變GH位點1的親和力的其它例子，其中的每一篇在此均引為參考。表1中列出了對位點1進行修飾的情況。對位點2的修飾也有公開，特別是當將氨基酸殘基G120修飾為精氨酸，賴氨酸，色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸或谷氨酸中的任何一種時，會產生一種具有拮抗特性的GH分子。
此外，通過已知的“聚乙二醇化”方法將經修飾的GH包裹在聚乙烯乙二醇(PEG)中能產生許多有益效果。首先，PEG包裹使GH的有效分子量從22kD增大至大約40kD，這產生的效果降低了GH的血管小球濾過，從而增加了GH在體內的半衰期，進而減少達到預期效果的給藥劑量。此外，認為聚乙二醇化既降低了用這種方式處理過的蛋白的免疫原性，還降低了其毒性，參見Abuchowski et al J Biol Chem.，252，3578-3581，(1977)。
然而，聚乙二醇化降低了經修飾的GH分子對GHR的親和性，這意味著必須增加所需的劑量來克服親和性的降低。由于它抵消了聚乙二醇化帶來的修飾GH的半衰期增加的有益效果，因此這種結果不盡人意。人們期望獲得一種經修飾的GH分子，該分子不需要聚乙二醇化，但也具有增加的半衰期并具有降低的免疫原性和無毒性的附加優點。
本發明的第一方面提供了一種嵌合多肽，該多肽包括i)至少一個經修飾的生長激素結合區，其中所述的修飾為插入、缺失或取代至少一個氨基酸殘基；和ii)生長激素受體的生長激素結合區。
在本發明的優選實施方案中，所述多肽在生長激素的位點1結合區被修飾。
在本發明進一步優選的實施方案中，所述多肽在生長激素的位點2結合區被修飾。
在本發明進一步優選的實施方案中，所述多肽在生長激素的位點1和位點2被修飾。
如上文所述，位點1的突變是本領域公知的，其能提高生長激素與生長激素受體上的其結合區的親和性，這種修飾的生長激素作為促效劑。如果位點1修飾與位點2修飾相結合，則后一修飾會使位點2結合位點失活或部分失活，因此該分子作為拮抗劑。屏蔽掉野生型位點1結合位點僅對位點2進行修飾也同樣產生拮抗劑。
在本發明進一步的優選實施方案中提供了一種多肽，該多肽含有經氨基酸取代修飾的位點1結合區，所述的修飾選自對

圖13所示的序列用丙氨酸或天門冬氨酸取代組氨酸18，用天門冬酰胺取代組氨酸21，用丙氨酸取代谷酰胺22，用丙氨酸取代苯丙氨酸25，用丙氨酸取代天門冬氨酸26，用丙氨酸取代谷酰胺29，用丙氨酸取代谷氨酸167，用絲氨酸取代天門冬氨酸171，用絲氨酸或丙氨酸取代賴氨酸172和用酪氨酸取代異亮氨酸179。
優選地，所述增加位點1與GHR中的其結合區的親和性的修飾包括如下氨基酸取代對圖13中的GH氨基酸序列用天門冬氨酸取代組氨酸18，用天門冬酰胺取代組氨酸21，用天門冬酰胺取代精氨酸167，用精氨酸取代天門冬氨酸171，用絲氨酸取代谷氨酸174和用蘇氨酸取代異亮氨酸179。
在本發明進一步優選的實施方案中，所述的增加位點1與GHR中的其結合區的親和性的修飾包括如下氨基酸取代對圖13中的GH氨基酸序列用丙氨酸取代組氨酸18，用丙氨酸取代谷胺酰22，用丙氨酸取代苯丙氨酸25，用丙氨酸取代天門冬氨酸26，用丙氨酸取代谷氨酰29，用丙氨酸取代谷氨酸65，用丙氨酸取代賴氨酸168和用丙氨酸取代谷氨酸174。
在本發明進一步的優選實施方案中，所述的位點2修飾是對圖13所示序列的氨基酸殘基120進行修飾。優選地，所述位點2修飾與位點1修飾相結合，如同本文的公開。可選擇地，GH僅在氨基酸殘基甘氨酸120處被修飾。
在本發明的優選實施方案中，所述的位點2修飾是用下列的氨基酸取代甘氨酸精氨酸、丙氨酸、賴氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸。優選地，所述取代是用精氨酸或賴氨酸或丙氨酸取代甘氨酸120。
在本發明進一步的優選實施方案中，GHR的生長激素結合區為GHR的胞外區域。更優選地，該結合區為GH的C-末端SD-100結構域。
可選的，所述結合區為全長GHR。
在本發明的優選實施方案中，所述嵌合多肽是融合蛋白，其中經修飾的GH與GHR或GHR部分發生符合讀框的平移融合。優選地，所述融合多肽含有經修飾的GH和GHR的C-末端SD-100區域。
在本發明可選擇的進一步優選的實施方案中，GH經修飾的結合區通過連接子與GHR的GH結合區相連。該連接子是可變的。
所述的連接子可以是受體胞外區的任何殘基，其能使修飾的GH與細胞表面的自由受體發生可變結合。優選地，在靠近修飾的GH分子C-末端的殘基和靠近GHR N-末端的殘基之間形成連接子。更優選地，在靠近修飾的GH分子C-末端的殘基和靠近C-末端SD-100 N-末端的N-末端殘基之間形成連接子。更優選地，在GHR C-末端SD-100的N-末端位點126-128的任何殘基處形成連接子。在本發明的實施方案中，在C-末端SD-100的N-末端127殘基處形成連接子。優選地，所述連接子是肽。
GHR:GH:GHR復合體的晶體結構顯示GH的C-末端(殘基191)與C-末端SD-100的N-末端(殘基126-128)的距離為10A。這為設計連接子提供了有用的信息。
優選地，所述連接子是含有5到30個氨基酸殘基的多肽。更優選地，所述連接子含有10到20個氨基酸殘基。更優選地，所述連接子含有至少一個拷貝的下述肽Gly Gly Gly Gly Ser(在下文中稱為“Gly4Ser”)。
在本發明實施方案中，所述連接子長10個氨基酸，含有2拷貝的Gly4Ser連接子。在本發明的可選實施方案中，所述連接子長15個氨基酸，含有3拷貝的Gly4Ser連接子。在又一可選實施方案中，所述連接子長20個氨基酸，含有4拷貝的Gly4Ser連接子。
在本發明的優選實施方案中，所述多肽來源于人GH和人GHR。
本發明的另一方面提供了編碼本發明所述多肽的核酸分子，該核苷酸分子選自i)圖13的核酸序列所示的核酸分子；和ii)能與(i)中的核酸序列雜交的核酸分子。
編碼本發明的經修飾的生長激素的核酸分子，可以典型地用本領域公知的分子技術來合成，包括重組法和使用寡核苷酸合成儀的核酸分子合成法。
在本發明的優選實施方案中，所述的核酸分子在嚴格雜交條件下雜交。
本文所采用的術語“嚴格雜交條件”是指所用的本領域熟知的參數。在記載了這種方法的參考文獻中可以找到這類核酸雜交參數，例如，Molecular CloningA Laboratory Manual，J.Sambrook等編，第二版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989，或Current Protocols in Molecular biology，F.M.Ausubel等編，John Wiley &Sons，Inc.，New York。更詳細地，本文所用的嚴格雜交條件的例子是指，65℃在雜交緩沖液(3.5×SSC，0.02％Ficoll，0.02％聚乙烯吡咯烷酮，0.02％牛血清白蛋白，2.5mM NaH2PO4(pH7)，0.5％SDS，2mM EDTA)中雜交。SSC為0.15M的氯化鈉/0.015M的檸檬酸鈉，pH7；SDS為十二烷基硫酸鈉；同時EDTA為乙二胺四乙酸。雜交后，將DNA轉移到膜上，室溫下，用2×SSC漂洗該膜，隨后將溫度升高到68℃在0.1-0.5×SSC/0.1×SDS中漂洗。
本發明的另一方面提供了一種含有本發明所述核酸分子的載體。
在本發明的優選實施方案中，所述的載體是適于重組基因表達的表達載體。
典型地，所述適于的例子包括，但不僅限于提供介導細胞/組織特異表達的轉錄調控序列(啟動子序列)。這些啟動子序列可以是細胞/組織特異性的、誘導型的或組成型的。
啟動子是本領域公知的術語，但為了清楚的目的，描述為具有下列特征，這些特征僅僅是舉例，并不產生任何限制。增強子元件是順式作用核酸序列，通常位于基因轉錄起始位點的5′端(增強子也可位于基因序列的3′端或甚至位于內含子序列中，因而其位置獨立)。增強子的功能是增強與其連接的基因的轉錄速率。增強子的活性受與增強子元件特異結合的反式作用轉錄因子的影響。轉錄因子的結合/活性(參見EukaryoticTranscription，by David S Latchman，Academic Press Ltd，San Diego)受許多環境因素的影響，這些因素的例子包括，但不限于中間代謝物和/或環境效應器。
啟動子元件還含有所謂的TATA盒和具有轉錄起始位點選擇功能的RNA聚合酶起始選擇(RIS)序列。這些序列還與多肽結合，該多肽具有有利于RNA聚合酶轉錄起始選擇的功能。
所述的適于還包括提供選擇性標記和有助于在真核細胞或原核宿主中保持所述載體的自主復制序列。自主保持的載體被稱為游離型載體。由于這類分子可整合大的DNA片段(30-50kb DNA)，因此游離型載體是理想的。這類游離型載體記載于W098/07876中，在此引為參考。
所述的有助于載體表達編碼基因的適于還包括提供轉錄終止子/聚腺苷酸化序列，還包括提供內部核糖體進入位點(IRES)，該IRES具有使排列在雙順反子或多順反子表達盒中的基因編碼載體最大化表達的功能。
所述的適于是本領域公知的，有大量的公開文獻涉及到表達載體的構建和通用的重組DNA技術。參見Sambrook等(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory，Cold Spring Harbour，NY；Marston，F(1987)DNA Cloning TechniquesA Practical Approach，第3卷，IRL Press，Oxford UK；DNA CloningF M Ausubel等，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.(1994)。
本發明的另一方面提供了本發明的多肽作為藥物的用途。在本發明的優選實施方案中，所述多肽用于制備藥物以治療下述疾病巨人癥，肢端肥大癥，癌癥(例如，腎胚細胞腫瘤，成骨肉瘤，乳腺癌，結腸癌，前列腺癌，甲狀腺癌)，糖尿病引起的視網膜病，糖尿病引起的腎病以及糖尿病和GH過量引起的其他并發癥。
本發明的多肽和組合物可以采用任何常規的方式給藥，包括注射或在一段時間內逐漸灌輸的方式。所述給藥的例子包括口服、靜脈內、腹膜內、肌內、體腔內、眼內、皮下或腦內給藥。所述的藥物組合物可以方便地制成單位劑量形式，并用制藥領域公知的任何方法來制備。
當給藥時，本發明所述的藥物制劑以藥學上可接受的劑量和藥學上可接受的組分形式給藥。術語“藥學上可接受”是指不妨礙活性成分的生物學活性效果的非毒性物質。所述的制劑通常可以含有鹽、緩沖劑、防腐劑、相容性載體和可選擇的其他治療藥劑。
如果需要，所述的組合物可以與藥學上可接受的載體結合。術語“藥學上可接受的載體”是指一種或多種適于向人給藥的相容性固體或液體填充劑、稀釋劑或膠囊物質。術語“載體”是指天然或合成的有機或無機成分，活性成分與其結合可使應用方便。所述的藥物組合物可以含有合適的緩沖劑，如乙酸鹽、硼酸鹽和磷酸鹽。所述的藥物組合物可選擇地還可以含有合適的防腐劑，如苯扎氯銨、氯丁醇、羥基苯甲酸酯類和噻汞撒。
本發明的另一方面提供了用本發明所述核酸或載體轉化或轉染的細胞。
在本發明的優選實施方案中，所述的細胞是真核細胞。優選地，所述的細胞選自粘液菌(例如網柄菌)，酵母細胞(例如啤酒酵母、畢赤氏酵母(Pichia spp))，哺乳動物細胞(例如中國倉鼠卵巢細胞)，植物細胞和昆蟲細胞(例如秋粘蟲(Spodoptera spp))。
在可選擇的優選實施方案中，所述細胞是原核細胞，優選為大腸桿菌屬(Escherchia coli)或芽孢桿菌屬(Bacillus spp.)的細胞。
本發明的另一方面提供了制造本發明所述多肽的方法，該方法包括i)制備本發明所述的細胞；ii)在有利于本發明所述多肽產生的條件下培養所述細胞；和任選地iii)從細胞或細胞培養基中分離所述多肽。
在本發明的優選方法中，所述多肽攜帶有方便從所述細胞中純化該多肽的分泌信號。更優選地，所述多肽攜帶有方便從所述細胞或細胞培養基中純化該多肽的親和標記。
本發明的另一方面提供了治療哺乳動物，優選治療人的方法，該方法包括向所述哺乳動物給予本發明所述多肽。
本發明的另一方面提供了嵌合多肽，該多肽具有兩個以上經修飾的生長激素結合位點，其中所述修飾為插入、缺失或取代至少1個氨基酸殘基。
在本發明的優選實施方案中，提供了大多數生長激素結合區被修飾的嵌合多肽。
在本發明的優選實施方案中，提供了至少含有兩個經過修飾的位點2生長激素結合區的嵌合多肽。
在本發明的另一優選實施方案中，提供了含有3、4、5、6、7、8、9、10個經修飾的位點2生長激素結合區的嵌合多肽。
如本發明的另一優選實施方案中，所述的嵌合多肽含有兩個以上通過連接子分子連接在一起的經修飾的生長激素結合區。優選地所述的連接子分子為上文所公開的連接子分子。
本發明的另一方面，所述的嵌合多肽含有兩個以上經修飾的生長激素結合區，該多肽還含有至少一個生長激素受體的生長激素結合區。
優選地，所述嵌合多肽含有兩個經修飾的生長激素結合區和一個生長激素受體的生長激素結合區。
優選地，所述嵌合多肽含有至少兩個經修飾的位點2生長激素結合區。
與含有與受體結合區相連的生長激素結合區的嵌合多肽相關的方面和實施方案也適用于含有多個或多數生長激素結合區的嵌合多肽。例如，含有編碼所述嵌合多肽的核酸的載體，含有所述多肽的藥物組合物，表達所述嵌合多肽的細胞系，制備所述多肽的方法和利用所述多肽進行治療的方法都在與這種嵌合多肽有關的本發明的范圍內。
現在，將通過具體例子并結合下述表和附圖對本發明的具體實施方案作進一步的描述表1簡要顯示了對人GH位點1和位點2進行的氨基酸取代；圖1是pHEAT.GH.G120R的質粒圖譜，該質粒通過連接PCR合成的位于BamHI和NotI限制性酶切位點間的GH.G120R基因構建。該質粒的選擇標記為AmpR；圖2是pTrcHis-TOPO.1A7的質粒圖譜，該質粒通過連接pTrcHis 1A1的BamHI和NotI位點間的GH.G120R基因構建，其連接子為(G4S)4，質粒上的選擇標記為AmpR；圖3是pTrcHis-TOPO.1B2的質粒圖譜，該質粒通過連接pTrcHis 1B1的BamHI和NotI位點間的GH.G120R基因構建，其連接子為(G4S)4，質粒上的選擇標記為AmpR；圖4是pTrcHis-TOPO.1C3的質粒圖譜，該質粒通過連接pTrcHis 1A7的EcoRI和HinDIII位點間的GH.G120R基因構建，其連接子為(G4S)4，質粒上的選擇標記為AmpR；圖5是GH.G120R基因的序列，其中標明了起始密碼子、6×His標記、相關的限制性酶切位點、終止子和G120R突變(CGC)。實際的GH.G120R組成用大寫字母表示，序列區域用黑體顯示；圖6是1A7基因的序列，其中標明了起始密碼子、6×His標記、相關的限制性酶切位點、終止子和G120R突變(CGC)。實際的GH.G120R-(G4S)4-GHR(b)組成用大寫字母表示，序列區域用黑體顯示；圖7是1B2基因的序列，其中標明了起始密碼子、6×His標記、相關的限制性酶切位點、終止子和G120R突變(CGC)。實際的GH.G120R-(G4S)4-GHR(flec)組成以大寫字母表示，序列區域以黑體顯示；圖8是1C3基因的序列，其中標明了起始密碼子、6×His標記、相關的限制性酶切位點、終止子和G120R突變(CGC)。實際的GH.G120R-(G4S)4-GH.G120R組成以大寫字母表示，序列區域以黑體顯示；圖9是用抗人GH作為一抗，用15％SDS PAGE膠進行的Western印跡以研究G H.G120R、1A7、1B2和1C3的表達。表達由E.coli XL1 Blue或E.coli SURE中的pTrcHis載體產生，在加入1mM(終濃度)IPTG誘導后4小時取樣。印跡結果顯示GH.G120R和1C3產生單一的帶，而1A7和1B2的樣品含有裂解產物；圖10顯示了對純化GH.G120R、1A7和1C3的15％SDS PAGE膠進行的考馬氏亮藍染色[C]，和用抗人GH作為一抗對這些樣品進行的Western印跡[W]。考馬氏亮藍染色結果表明純化的蛋白樣品達＞95％的純度，然而western印跡結果表明只有GH.G120R和1C3產生單一的帶，而1A7樣品含有裂解的產物；圖11的圖表顯示了對GH.G120R、1A7和1C3進行GH生物測定的結果。每一圖表顯示了標準曲線、單獨采用不同濃度的構建體的試驗結果和采用不同濃度的構建體與25ng/ml hGH聯用的試驗結果。這些結果顯示沒有一種蛋白具有固有的激動活性，但其全部都具有拮抗活性。其中GH.G120R活性最強，1A7活性最弱。
圖12是未修飾的GH的氨基酸序列；圖13是未修飾的GH的核酸序列。
材料和方法制備位點1和/或位點2經修飾的GH的方法在US5849535、US5854026、US6004931、US6022711、US6057292和US6136563中公開，每篇文獻在此都引為參考。
DNA構建體位點2突變的GH拮抗劑(GHa)的制備從人腦垂體組織中通過PCR擴增出人GH的cDNA(圖1)，并克隆至載體pTircHis-Topo(pTrcHis-TOPO-GHstop)中。用PCR從人肝臟cDNA中擴增出GHR胞外區。
生長激素拮抗劑(G120R)構建體生長激素的G120R突變通過噬菌體介導的ssDNA突變方法使生長激素(GH)基因發生突變。首先將該GH基因從pTrcHisGH亞克隆至pT7T318的BamHI和HindIII位點間，從而產生pT7T318-GH。隨后將該質粒轉化至E.coli CJ236中，產生單鏈ssDNA。
然后，將Gly120的密碼子從GGC變為CGC，從而使pT7T318-GH的ssDNA發生突變，其中采用了GH.(G120R)上游引物(表1)。
突變過程后產生dsDNA的pT7T318-GH.G120R，隨后將其用于將GH.G120R亞克隆至pHEAT載體，從而產生了pHEAT.GH.G120R(圖1)。
GH.G120R構建體的制備χ1A7[GH.G120R-(G4S)4-GHR(b)]＝與GHR的b區域連接的GHa利用限制性酶切位點BamHI和NotI從pHEAT.GH.G120R(圖1)中剪切下GH.G120R基因。隨后將該基因連接至pTrcHisχ1A1[GH-(G4S)4-GHR(b)]的GH基因位置(圖2)。將得到的質粒轉化至Escherichiacoli XL1 Blue中，并涂布于LB(0.3％葡萄糖，50ug/ml胺芐青霉素，12.5ug/ml四環素)瓊脂糖平板上。
χ1B2[GH.G120R-(G4S)4-GHRflec]＝與全長GHR胞外區相連的GHa重復產生χ1A7基因的步驟，只將受體載體改為pTrcHisχ1B1[GH-(G4S)4-GHRflec](圖3)。將得到的質粒轉化至E.coli XL1 Blue中，并涂布于LB(0.3％葡萄糖，50ug/ml胺芐青霉素，12.5ug/ml四環素)瓊脂糖平板上。
χ1C3[GH.G120R-(G4S)4-GH.G120R]＝GHa串連子采用引物DiGHEcoF1和DiGHHinR1(表1)對pTrcHisGH進行PCR擴增反應。然后采用EcoRI和HindIII消化PCR產物，將該產物連接至pTrcHisχ1A1[GH-(G4S)4-GHR(b)](圖4)的GHR(b)區域。將得到的質粒轉化至重組缺陷型E.coli SURE中，并涂布于LB(0.3％葡萄糖，50ug/ml胺芐青霉素，12.5ug/ml四環素，50ug/ml卡那霉素)瓊脂糖平板上。
測序結果對含有構建基因的質粒進行測序。對GH.G120R、χ1A7、χ1B2和χ1C3進行測序所得的基因和區域序列分別如圖5-8所示。
表達研究將單個克隆分別接種于用于培養E.coli XL1 Blue細胞的LB(0.3％葡萄糖，50ug/ml胺芐青霉素，12.5ug/ml四環素)培養基和用于培養E.coliSURE細胞的LB(0.3％葡萄糖，50ug/ml胺芐青霉素，12.5ug/ml四環素，50ug/ml卡那霉素)培養基中。隨后在37℃下振蕩培養。
隨后將200ul的LB過夜培養物接種于含有合適抗生素的4ml 4YT培養基中。培養3小時后取出1ml樣品(T0樣品)。
隨后采用終濃度為1mM的IPTG誘導4YT培養物，并再培養4小時(T4樣品)。
取出To和T4樣品后立即對其進行處理。首先離心使其形成細胞顆粒沉淀，隨后棄去上清，將顆粒沉淀置于SDS PAGE膠上電泳。通過考馬氏亮藍染色或通過以抗GH作為一抗的western印跡來使該PAGE膠上的蛋白質顯色以檢測構建體存在。
在全部情形中，考馬氏亮藍染色的PAGE膠沒有表現出構建體的過度表達。但是在western印跡中卻觀察到構建體(圖9)。這表明在所有情形中，正確大小的蛋白都得到表達。
純化一般是從4×250ml的含有合適抗生素，并經終濃度為1mM的IPTG誘導4-5后獲得的4YT培養物中純化蛋白質。經離心收集細胞，超聲波處理后，用溶菌酶和脫氧膽酸鈉處理使細胞裂解。
離心裂解的細胞除去細胞碎片，并采用Invitrogen ProBond樹脂(Ni-純化柱)初步純化上清。采用5ml 0.5M的咪唑洗脫蛋白質。
將Ni-純化柱的洗脫液以合適的緩沖液10倍稀釋后使其通過MonoQ離子交換柱而使蛋白質樣品進一步純化。采用超過20ml的0-1MNaCl的鹽梯度，以0.5ml/min的速率洗脫蛋白質，收集0.5ml的部分。然后，對該部分進行分析以確定構建體的存在，結果表明該部分含有大量的構建體。
通過SDS PAGE(考馬氏亮藍染色和western印跡)(圖10)和濃度測量試驗來分析純化的蛋白質。隨后將蛋白質用于生物檢測。
對于在western印跡中顯示出裂解產物的χ1A7和χ1B2，將所述構建體置于快速翻譯系統(RTS)中，使其發生體外轉錄。以前對χ1A7和χ1B2的研究表明，RTS系統與蛋白酶抑制劑和表達的陪伴蛋白聯用時可以使裂解顯著減少。
生物測定采用Asterion標準GH生物測定來檢測純化的構建體。采用一定劑量范圍的構建體來刺激制備的、穩定表達生長激素受體的293Hi。同時還準備另一個完全相同的培養皿，但加入25ng/ml的GH處理30分鐘。在加入所述構建體后，觀察所述構建體的拮抗作用。
全部的GH.G120R構建體都具有拮抗活性(圖11)。
拮抗劑活性的篩選用一種確定的生物測定方法來篩選拮抗劑活性(9)。用與活化的Stat5結合的螢光素酶報告基因瞬時轉染表達全長GHR的永久細胞系(9)。24小時后，采用含有或不含有拮抗劑的GH刺激所述細胞6小時。隨后裂解細胞并測定螢光素酶的活性(9)。
測定體內新陳代謝清除率麻醉Sprague-Dawley小鼠，并在其大腿和頸靜脈血管處植入插管。兩天后，經靜脈或皮下注射方式用GH嵌合體或串連子給藥。經大腿插管處收集血液樣品，并通過放射免疫測定來檢測嵌合體和串連子或寡聚蛋白的水平。采用適合于計算激素濃度隨時間變化的可用計算機程序來預測藥動力學參數。
表1簡要顯示了GH位點1的氨基酸取代。對位點2的修飾包括采用精氨酸、丙氨酸、賴氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸或谷氨酸中的任何一種來取代G120。
權利要求
1.一種嵌合多肽，該多肽含有i)至少一個經修飾的生長激素結合區，其中所述的修飾為插入、缺失或取代至少一個氨基酸殘基；和ii)生長激素受體的配體結合區。
2.如權利要求1所述的多肽，其中所述的結合區在生長激素的位點1被修飾。
3.如權利要求1所述的多肽，其中所述的結合區在生長激素的位點2被修飾。
4.如權利要求1所述的多肽，其中所述的修飾同時發生于生長激素的位點1和位點2。
5.如權利要求1或2或4所述的多肽，其中所述的修飾選自對圖13所示的序列用丙氨酸或天門冬氨酸取代組氨酸18，用天門冬酰胺取代組氨酸21，用丙氨酸取代谷酰胺22，用丙氨酸取代苯丙氨酸25，用丙氨酸取代天門冬氨酸26，用丙氨酸取代谷酰胺29，用丙氨酸取代谷氨酸167，用絲氨酸取代天門冬氨酸171，用絲氨酸或丙氨酸取代賴氨酸172和用酪氨酸取代異亮氨酸179。
6.如權利要求5所述的多肽，其中所述的修飾包括如下氨基酸取代用天門冬氨酸取代組氨酸18，用天門冬酰胺取代組氨酸21，用天門冬酰胺取代精氨酸167，用精氨酸取代天門冬氨酸171，用絲氨酸取代谷氨酸174和用蘇氨酸取代異亮氨酸179。
7.如權利要求5所述的多肽，其中所述的修飾包括如下氨基酸取代用丙氨酸取代組氨酸18，用丙氨酸取代谷胺酰22，用丙氨酸取代苯丙氨酸25，用丙氨酸取代天門冬氨酸26，用丙氨酸取代谷氨酰29，用丙氨酸取代谷氨酸65，用丙氨酸取代賴氨酸168和用丙氨酸取代谷氨酸174。
8.如權利要求3所述的多肽，其中所述的位點2修飾是對如圖13所示序列的氨基酸殘基甘氨酸120進行修飾。
9.如權利要求8所述的多肽，其中所述的位點2修飾是用下列的氨基酸取代甘氨酸精氨酸、丙氨酸、賴氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸。
10.如權利要求9所述的多肽，其中所述的位點2取代是用精氨酸或賴氨酸或丙氨酸取代甘氨酸120。
11.如權利要求1-10中任意一項所述的多肽，其中GHR的生長激素結合區是GHR胞外區。
12.如權利要求11所述的多肽，其中的GHR胞外區是GHR的C-末端SD-100區域。
13.如權利要求1-12中任意一項所述的多肽，其中所述多肽為融合蛋白。
14.如權利要求13所述的多肽，其中所述融合多肽含有如權利要求1-10中任意一項所述的經修飾的GH和GHR的C-末端SD-100區域。
15.如權利要求1-14中任意一項所述的多肽，其中經修飾的GH結合區通過一連接子與GHR的GH結合區連接。
16.如權利要求15所述的多肽，其中所述的連接子是具有5到30個氨基酸殘基的多肽。
17.如權利要求16所述的多肽，其中所述的連接子是具有10到20個氨基酸殘基的多肽。
18.如權利要求16或17所述的多肽，其中所述的連接子至少含有一個Gly Gly Gly Gly Ser肽拷貝。
19.編碼如權利要求1-18中任意一項所述的多肽的核酸分子，該核酸分子選自i)圖13的核酸序列所示的核酸分子；和ii)能與(i)中的核酸序列雜交的核酸分子。
20.如權利要求19所述的核酸分子，該核酸分子在嚴格雜交條件下與圖13中的核酸序列雜交。
21.如權利要求19或20所述的核酸分子，該核酸分子由圖13的DNA組成。
22.含有如權利要求19-21中任意一項所述的核酸分子的載體。
23.如權利要求22所述的載體，其中所述載體為適于重組表達的表達載體。
24.如權利要求1-18中任意一項所述的多肽作為藥物的應用。
25.如權利要求1-18中任意一項所述的多肽在制備治療下列疾病的藥物中的應用巨人癥，肢端肥大癥，癌癥(例如，腎胚細胞腫瘤，成骨肉瘤，乳腺癌，結腸癌，前列腺癌，甲狀腺癌)，糖尿病引起的視網膜病，糖尿病引起的腎病，糖尿病并發癥和GH過量引起的其它疾病。
26.如權利要求25所述的多肽在治療肢端肥大癥中的應用。
27.含有如權利要求1-18中任意一項所述的多肽的藥物組合物。
28.經如權利要求19-23中任意一項所述的核酸或載體轉化或轉染的細胞。
29.如權利要求28所述的細胞，其中所述細胞是選自下列的真核細胞粘液菌(例如網柄菌)，酵母細胞(例如啤酒酵母、畢赤氏酵母(Pichiaspp))，哺乳動物細胞(例如中國倉鼠卵巢細胞)，植物細胞和昆蟲細胞(例如秋粘蟲(Spodoptera spp))。
30.如權利要求28所述的細胞，其中所述細胞為原核細胞。
31.制備如權利要求1-18中任意一項所述的多肽的方法，該方法包括i)制備如權利要求28-30中任意一項所述的細胞；ii)在有利于所述多肽產生的條件下培養所述細胞；和任選地iii)從細胞或細胞培養基中分離所述多肽。
32.如權利要求31所述的方法，其中所述多肽攜帶有方便從所述細胞中純化該多肽的分泌信號。
33.如權利要求31或32所述的方法，其中所述多肽攜帶有方便從所述細胞或細胞培養基中純化該多肽的親和標記。
34.一種治療哺乳動物，優選治療人的方法，該方法包括向所述哺乳動物用如權利要求1-18中任意一項所述的多肽給藥。
35.如權利要求34所述的方法，其中所述的治療為治療如下疾病巨人癥，肢端肥大癥，癌癥(例如，腎胚細胞腫瘤，成骨肉瘤，乳腺癌，結腸癌，前列腺癌，甲狀腺癌)，糖尿病引起的視網膜病，糖尿病引起的腎病核，糖尿病并發癥和GH過量引起的其它疾病。
全文摘要
本發明涉及嵌合多肽，所述的多肽含有與生長激素受體的受體結合區連接的經修飾的生長激素結合區。本發明還涉及所述修飾的生長激素結合區的串連物/低聚物。
文檔編號C07K19/00GK1604965SQ02824781
公開日2005年4月6日 申請日期2002年12月6日 優先權日2001年12月14日
發明者理查德·羅斯, 喬恩·塞耶斯, 彼得·阿蒂米克 申請人:埃斯特瑞恩有限公司