專利名稱：快速溶液合成肽的方法
技術領域：
本發明涉及快速溶液合成肽的多用途新方法，其中在完成對期望序列的組裝之前無需分離生長中的肽。
另一方面，經典的溶液相方法更易于擴大規模，并且就試劑和材料而言較便宜。因為可以通過間歇純化除去由于未保護側鏈的副反應導致的副產物，所以通常無需對氨基酸進行全部保護。然而，溶液相方法需要序列特異的方案，并且完全序列的產生極為費時。
由于這些方法的缺陷，因此需要一種結合了這兩種經典方法的優點，尤其是用于肽的大規模合成的方法。新的方法應當快速、易于擴大規模并且通用。
在溶液相合成中，優選在每個偶聯步驟中使用稍過量的活化羧基成分，以保證與氨基成分定量偶聯；由此，可以避免終產物中出現缺失序列。通常認為，在間歇水操作過程中殘余的活化羧基成分被破壞和除去。然而，通常會遇到作為終產物的雜質的插入肽序列，原因是偶聯步驟后不能完全去除殘余(活化)羧基成分，這些成分在去保護后又隨之發生偶聯。為了避免所述副反應的發生，可以直接在偶聯步驟后引入清除步驟以清除(失活)殘余的活化羧基官能團。胺通常被用作清除劑。使用多胺作為清除劑導致被清除的化合物可以根據它們的極性被有效地抽提至-優選酸性的-水相中[例如Kisfaludy，L.等(1974)Tetrahedron Lett.19，1785-1786]。該抽提通常在去保護步驟前進行，以避免生長中的肽流失到水相中。然而，已發現該程序在許多情況下由于被清除化合物的疏水性(羧基成分的氨酰基部分固有的疏水性被仍存在的氨基保護基團加強)導致間歇的純化不徹底。因此，水相抽提并不十分有效。
近來，Carpino，LA.等[(1999)J.Org.Chem.64，4324-4338]報道了對此清除方法的改進。除了使用多胺作為清除劑外，還在該方法中使用氨基保護基團1，1-雙氧代苯并[b]噻吩-2-基甲氧基羰基(Bsmoc)。Bsmoc官能團對堿有極高的不穩定性。其結果是，使用多胺在一個相同步驟中清除殘余的活化羧基官能團和除去Bsmoc官能團。Bsmoc官能團的使用被描述為使用快速連續溶液相技術制備(寡)肽的一個顯著進步，這使得可以在單個系列步驟中在相對短的時間內組裝肽。
根據本發明的新方法是在有機溶劑或有機溶劑混合物中快速溶液合成肽的方法，包括步驟(a)-(b)的重復循環(a)偶聯步驟，使用過量的活化羧基成分酰化氨基成分，(b)淬滅步驟，在該步驟中使用清除劑除去殘余的活化羧基官能團，其中該清除劑還可以用于使生長中的肽(即正在形成的肽)去保護，(c)一或多個水抽提(aqueous extraction)，和任選地，(d)獨立的去保護步驟，可能地，之后進行一或多次水抽提，其特征在于該方法包括至少一個步驟(b)，稱作步驟(b’)，在該步驟中使用包含自由陰離子或潛陰離子的胺作為殘余活化羧基官能團的清除劑。
在本發明方法中，在獲得最終的肽序列(即本發明方法的終產物)前，無需分離生長中的肽。因此，該方法比經典的溶液相方法耗費的時間顯著少并易于擴大規模。本發明方法使得可以高效除去殘余的活化羧基成分，而且不會遇到使用多胺作為清除劑的其它現有技術方法的疏水問題。因此，獲得高純度的肽。
優選地，本發明方法步驟(a)中，所用試劑的摩爾量按遞減順序排列羧基成分、偶聯添加物＞偶聯試劑＞氨基成分。而且優選其中步驟(a)使用預先活化的羧基成分的方法。
在另一優選實施方案中，步驟(b’)中使用包含潛陰離子的胺作為清除劑。優選地，清除性胺中的潛陰離子帶有暫時性保護基團，該基團可以在與生長中的肽連接的任何持久保護基團存在時選擇性地去除。在一個尤其優選的實施方案中，清除性胺中潛陰離子的保護基團表現出與生長中的肽N端存在的暫時性保護基團相似的不穩定性。這就允許在一個工藝步驟中使清除劑去保護產生陰離子并使生長中的肽的N端去保護。尤其優選以下本發明方法，其中存在于生長中的肽N端的和任選地存在于清除劑中的暫時性保護基團是可氫解去除的基團，而持久保護基團是可酸解去除的保護基團。優選地，所述暫時性保護基團是芐基類的，例如(取代的)芐基和芐氧基羰基基團。優選的清除劑是包含自由陰離子或潛陰離子的伯胺，尤其是C端被保護的氨基酸的衍生物。除了羧酸根外，清除性胺可以包含其它陰離子官能團，例如-但不限于-磺酸根、硫酸根、膦酸根、磷酸根、或酚鹽陰離子。極為優選用作清除劑的氨基酸是β-丙氨酸或其衍生物(例如酯或甲硅烷基酯衍生物)。最優選的清除劑是β-丙氨酸芐基酯或其鹽。
根據本發明方法，包含自由陰離子或潛陰離子的硫醇也可以用作清除劑替代含有自由陰離子或潛陰離子的胺。
該清除劑優選以相對于需要清除的殘余活性成分2至6倍摩爾的過量使用。
根據本發明清除劑的使用導致親水性的被清除化合物的產生，這些化合物可以在去保護步驟后有效地被抽提至堿性水相中在去保護(如果適用的話)后，被清除物中自由氨基官能團和自由羧基官能團的同時存在增強了親水性。因此，由于可以有效地抽提親水的被清除化合物，本發明方法導致極為有效的間歇純化。此外，同時可以從反應混合物中抽提出未被活化的、去保護過程中其暫時性保護基團也被去除了的、可能存在的過量羧基成分。
根據本發明方法，該方法的至少一個循環，但也可能更多個循環，包含步驟(b’)，在該步驟中使用自由陰離子或潛陰離子作為殘余的活化羧基官能團的清除劑。然而，根據本發明的其它實施方案，該方法還包括一或多個循環，其中步驟(b)中使用多胺例如3-二甲基氨基-1-丙胺作為清除劑。
本發明另一優選方法包含一或多個循環，其中步驟(b)中不發生去保護(由此對情況進行選擇以便僅使用清除劑進行淬滅，例如使用Z保護基團和包含潛陰離子的胺作為清除劑)，而且隨后的步驟(c)包括順序的堿性、酸性和堿性抽提，這些抽提優選在氯化鈉或硝酸鉀存在時進行。該方法包含隨后的步驟(d)，該步驟包括去保護和順序的堿性和中性抽提；這些抽提優選在氯化鈉或硝酸鉀存在時進行。
本發明另一優選方法包含一或多個循環，其中步驟(b)中發生淬滅和去保護兩者(例如使用Bsmoc保護基團和多胺作為清除劑)，而且隨后步驟(c)包括順序的堿性和中性抽提，這些抽提優選在氯化鈉或硝酸鉀存在時進行。
而且優選以下方法，其中在最后一個循環，步驟(a)中的羧基成分保護基團表現出與氨基成分的持久保護基團相似的不穩定性，并且步驟(b)中的清除劑是多胺。
根據本發明的方法可以在幾種常用于肽制備的有機溶劑中進行。極為優選的有機溶劑是乙酸乙酯。而且優選乙酸乙酯和其它有機溶劑如二氯甲烷、1-甲基-2-吡咯烷酮(pyrrolidinone)、N，N-二甲基甲酰胺或四氫呋喃的混合物。
本發明方法可以在本領域熟知的用于經典溶液相肽合成的這些步驟中的溫度下進行。然而，優選該方法在0-50℃的溫度范圍內進行，尤其是在環境溫度下進行。
部分方法非常適于使用分開和混合方法(split and mix method)組合合成(combinatorial synthesis)肽文庫。單獨進行偶聯，而將單個的偶聯混合物合并用于抽提和去保護。
因為使用了標準方法，本發明方法極為適于自動化。
本發明的新方法是一種極為有效的方法，可以方便地用于制備高純度的寡肽和多肽。
根據本發明的適當方法是使過量羧基成分與氨基成分偶聯，其中羧基官能團是預先活化的或是使用偶聯試劑以及(如果期望的話)添加劑在原位活化的。偶聯步驟后，通過在反應混合物中加入清除劑清除殘余的活化羧基官能團，之后通常進行水抽提。隨后或在清除過程中，使用本領域已知的適當方法去除暫時性保護基團，之后通常通過水抽提除去被清除的化合物。同時，未活化的、其暫時性保護基團在去保護過程中也被除去了的、可能存在的過量羧基成分、以及其它水溶性試劑和副產物也從反應混合物中被抽提出去。接著，之后可以根據期望肽的長度進行另一循環的偶聯、淬滅、去保護和抽提步驟。
術語氨基成分是指含有自由氨基官能團的分子。具體地，該氨基成分可以是帶有自由氨基官能團的、而且其它官能團以一定方式被保護以致它們不會干擾期望的偶聯反應的任何胺、氨基酸或寡肽。所用氨基酸或寡肽的C端官能團可以被保護以取代的或未取代的酰胺或以酯的形式存在；后者的例子包括-但不限于-甲基、乙基、叔丁基、芐基、苯甲酰甲基、3-(3-甲基)戊基(Mpe)、2-(2-苯基)丙基(Pp)、2-氯三苯甲基(Clt)、二苯基(4-吡啶基)甲基(PyBzh)、二環丙基甲基(Dcpm)、9-芴基甲基(Fm)、烯丙基(All)、2-(三甲基甲硅烷基)乙基(Tmse)、4-{N-[1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亞環己基)-3-甲基丁基]-氨基}芐基(Dmab)酯和酶促可切割的酯[Roeske，R.W. ，《肽》(The Peptides’)，第3卷(Gross，E.和Meienhofer，J.編)Academic Press，New York，第101-136頁；對于MpeKarlstrom，A.和Unden，A.(1996)TetrahedronLett.37，4343-4262；對于PpYue，C.等(1993)Tetrahedron Lett.34，323-326；對于CltAthanassopoulos，P.等(1995)Tetrahedron Lett.36，5645-5648；對于PyBzhMergler，M.等(2001)P154，第2屆國際肽研討會和第17屆美國肽討論會；對于DcpmCarpino，L.A.等(1995)J.Org.chem.60，7718-7719；對于FmAl-Obeidi，F.等(1990)Int.J.Peptide Protein Res.35，215-218；對于AllKunz，H.等(1985)Int.J.Peptide Protein Res.26，493-497；對于TmseSieber，P.(1997)Helv.Chim.Acta60，2711-2716；對于DmabChan，W.C.等(1995)J.Chem.Soc.，Chem.Commun.，2209-2210]。對于氨基成分中其它官能團的持久保護，優選叔丁基類官能團或具有類似不穩定性的官能團；這些包括-但不限于-叔丁基(tBu)用于保護Asp、Glu、Ser、Thr和Tyr側鏈；叔丁氧基羰基(Boc)用于保護Lys和Trp側鏈；三苯甲基(Trt)用于保護Asn、Gln和His側鏈；和2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺酰基(Pmc)或2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)用于保護Arg側鏈[Barany，G.和Merrifield，R.B.(1980)，《肽》第2卷(Gross，E.和Meienhofer，J.編)Academic Press，New York，第1-284頁；對于Trp(Boc)Franzen，H.等(1984)J.Chem.Soc.Chem.Commun.，1699-1700；對于Asn(Trt)和Gln(Trt)Sieber，P.和Riniker，B.(1991)Tetrahedron Lett.32，739-742；對于His(Trt)Sieber，P.和Riniker，B.(1987)Tetrahedron Lett.28，6031-6034；對于PmcRamage，R.和Green，J.(1987)Tetrahedron Lett.28，2287-2290；對于PbfCarpino，L.A.等(1993)Tetrahedron Lett.34，7829-7832]。
術語羧基成分是指包含自由羧基官能團的分子。具體地，該羧基成分可以是帶有自由羧基端官能團、且其它官能團以一定方式被保護以致它們不干擾期望的偶聯反應的任何羧酸、氨基酸或寡肽。在一個優選實施方案中，所用氨基酸或寡肽的氨基基團被芐氧基羰基(Z)官能團暫時性保護；其它例子包括-但不限于-Boc、Trt、芴-9-基甲氧基羰基(Fmoc)、2-(甲基磺酰基)乙氧基羰基(Msc)、烯丙基氧基羰基(Alloc)官能團、芳基磺酰基類如鄰硝基苯磺酰基(o-NBS)官能團、和酶促可切割的官能團[Geiger，R.和Konig，W.(1981)《肽》第3卷(Gross，E.和Meienhofer，J.編)Academic Press，New York，第1-99頁；對于AllocKunz，H.和Unverzagt，C.(1984)Angew.Chem.96，426-427；對于芳基磺酰基Fukuyama，T.等(1997)Tetrahedron Lett.38，5831-5834]。與上述用于氨基成分的相同，對于羧基成分中其它功能基團的持久保護，優選叔丁基類的官能團或具有類似不穩定性的官能團。可以預先將羧基成分活化為活性酯、優選N-羥基琥珀酰亞胺、苯并三唑-1-基、五氟苯基或4-硝基苯基酯、鹵化物、N-羧基酐(N-carboxyanhydride)，或活化為對稱的酐。或者，可以將羧基成分原位活化為混合酐，或者可以使用偶聯試劑如碳二亞胺、優選N，N’-二環己基碳二亞胺(DCC)或1-(3’-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸(EDC)、脲鎓(uronium)或磷鎓鹽，在可能存在偶聯添加劑，優選N-羥基琥珀酰亞胺(HONSu)、1-羥基苯并三唑(HOBt)、3-羥基-4-氧代-3，4-二氫-1，2，3-苯并三嗪(HOOBt)、1-羥基-7-氮雜苯并三唑(HOAt)或6-氯-1-羥基苯并三唑(Cl-HOBt)的情況下以及如果需要的話在存在叔胺的情況下原位活化該羧基成分[《肽》，第1卷(1979)(Gross，E.和Meienhofer，J.編)Academic Press，New York；Li，P.和Xu，J.-C.(2000)Chin.J.Chem.18，456-466]。
可以根據本領域已知方法(參閱上文)，除去暫時性保護基團。可以使用應用如氫氣或甲酸鹽(formiate)作為氫供體的(標準)方法通過氫解作用除去Z官能團。在該方法中，除去所有芐基類保護基團，并保持叔丁基類保護基團或具有類似不穩定性的保護基團。后者可以根據本領域已知方法通過酸解除去。
本領域技術人員將明了術語堿性水抽提的意義。然而，堿性水抽提優選使用碳酸氫鈉或碳酸鈉的水溶液，如果期望的話在氯化鈉或硝酸鉀存在下進行。術語有效水抽提是指以下抽提，其中在酸性條件下以質子化形式(銨)抽提氨基成分，或在堿性條件下以脫質子化形式(羧酸鹽)抽提羧基成分。
本發明通過以下實施例作進一步舉例說明，這些實施例不應解釋為對本發明的限制。
在存在活性炭上的鈀時，對含有被保護的二肽Z-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-OtBu的有機層進行催化氫解。反應完成后，加入5％ Na2CO3/10％ NaCl并過濾所獲懸浮液。用乙酸乙酯和二氯甲烷的混合物洗滌該殘余物，并用5％Na2CO3/10％ NaCl和30％ NaCl抽提此合并的有機過濾物。
第2個循環20℃下向含有二肽H-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-OtBu的有機層，加入3.24g1-羥基苯并三唑、7.18gZ-Phe-OH、4.20g 1-(3’-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸化物和2.42ml 4-甲基嗎啉。攪拌所獲溶液直至反應完成，之后加入1.21ml 4-甲基嗎啉和3.51g β-丙氨酸芐基酯對甲苯磺酸鹽。再攪拌混合物30分鐘并用5％ Na2CO3/10％ NaCl，5％ KHSO4/10％NaCl和5％Na2CO3/10％NaCl抽提。
在存在活性炭上的鈀時，對含有被保護的三肽Z-Phe-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-OtBu的有機層進行催化氫解。反應完成后，加入5％ Na2CO3/10％ NaCl并過濾所獲懸浮液。用乙酸乙酯和二氯甲烷的混合物洗滌該殘余物，并用5％ Na2CO3/10％ NaCl和30％ NaCl抽提此合并的有機過濾物。
第3循環20℃下向含有三肽H-Phe-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-OtBu的有機層，加入3.24g 1-羥基苯并三唑、4.21g Boc-Gly-OH、4.20g1-(3’-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸化物和2.42ml 4-甲基嗎啉。攪拌所獲溶液直至反應完成，之后加入1.25ml 3-二甲基氨基-]-丙胺。再攪拌混合物30分鐘并用5％ Na2CO3/10％ NaCl、5％ KHSO4/10％NaCl、5％Na2CO3/10％NaCl、30％ NaCl和水抽提。蒸干有機層并用甲基叔丁基醚研制殘余物，并干燥產生期望的被保護四肽，基于起始物質H-Ser(tBu)-OtBu有95％產率。該方法在6小時內完成。
純度通過反向HPLC(0.1％三氟乙酸中24-68％乙腈，220nm下29分鐘、2.0ml/min、5微米C18柱)檢測為98.1％。鑒定m/z425.4[M-Boc-3tBu+H]+，469.4[M-4tBu+H]+，525.4[M-3tBu+H]+，581.4[M-2tBu+H]+，637.4[M-tBu+H]+，693.4[M+H]+，電噴射MS；1H NMR(CDCl3)δ1.16(s，9H)，1.44(m，27H)，2.59(dd，1H)，2.79(dd，1H)，3.09(m，2H)，3.51(dd，1H)，3.69-3.86(m，3H)，4.47(m，1H)，4.67-4.78(m，2H)，5.20(bs，1H)，6.68(d，1H)，7.12-7.34(m.7H).
在存在活性炭上的鈀時，對含有被保護的二肽Z-Orn(Boc)-Pro-OtBu的有機層進行催化氫解。反應完成后，加入5％ Na2CO3/10％ NaCl并過濾所獲懸浮液。用乙酸乙酯洗滌殘余物，并用5％Na2CO3/10％NaCl和30％NaCl抽提此合并的有機過濾物。用乙酸乙酯重新抽提此分離的水相層。
第2個循環20℃下向含有二肽H-Orn(Boc)-Pro-OtBu的合并有機層，加入1014g 1-羥基苯并三唑、1993g Z-Leu-OH、1320g 1-(3’-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸化物和754ml 4-甲基嗎啉。攪拌所獲溶液直至反應完成，之后加入377ml 4-甲基嗎啉和1105g β-丙氨酸芐基酯對甲苯磺酸鹽。再攪拌混合物30分鐘并用5％ Na2CO3/10％ NaCl，5％KHSO4/10％NaCl和5％Na2CO3/10％NaCl抽提。
在存在活性炭上的鈀時，對含有被保護的三肽Z-Leu-Orn(Boc)-Pro-OtBu的有機層進行催化氫解。反應完成后，加入5％Na2CO3/15％ NaCl并過濾所獲懸浮液。用乙酸乙酯洗滌該殘余物，并用5％Na2CO3/10％ NaCl和30％ NaCl抽提此合并的有機過濾物。
第3循環20℃下向含有三肽H-Leu-Orn(Boc)-Pro-OtBu的有機層，加入1014g 1-羥基苯并三唑、1993gZ-D-Leu-OH、1320g 1-(3’-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸化物和754ml 4-甲基嗎啉。攪拌所獲溶液直至反應完成，之后加入377ml 4-甲基嗎啉和1105g β-丙氨酸芐基酯對甲苯磺酸鹽。再攪拌混合物30分鐘并用5％ Na2CO3、5％ KHSO4和5％Na2CO3抽提。
在存在活性炭上的鈀時，對含有被保護的四肽Z-D-Leu-Leu-Orn(Boc)-Pro-OtBu的有機層進行催化氫解。反應完成后，加入5％ Na2CO3并過濾所獲懸浮液。用乙酸乙酯洗滌該殘余物，并用5％Na2CO3和10％ NaCl抽提此合并的有機過濾物。
第4個循環至第7個循環在第3個循環過程后進行這些循環，分別用Z-Try(tBu)-OH(從4497g相應的二環己基銨鹽釋放出來的)、2218gZ-Ser(tBu)-OH、2538g Z-Trp-OH和2172g Z-His-OH替代1993gZ-D-Leu-OH。然而，從第5個循環向前，清除步驟中4-甲基嗎啉和β-丙氨酸芐基酯對甲苯磺酸鹽的量加倍。在第5個循環，清除后35℃進行抽提。在第7個循環，偶聯在3℃進行，用2561g 6-氯-1-羥基苯并三唑代替1014g 1-羥基苯并三唑，并在1小時偶聯后加入補充部分的132g1-(3’-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸化物。而且，在第7個循環，氫解后在35℃進行抽提。第7個循環末，蒸干有機層產生期望的被保護九肽，基于起始物質H-Pro-OtBu.HCl有73％產率(即，每個化學步驟平均98％)。
純度通過反向HPLC(0.1％三氟乙酸中24-68％乙腈，220nm下29分鐘、2.0ml/min、5微米C18柱)測得為90.6％。鑒定
m/z543.6[M-Boc-2tBu+2H]2+，571.6[M-Boc-tBu+2H]2+，599.6[M-Boc+2H]2+，649.8[M+2H]2+，1298.0[M+H]+，采用電噴射MS.
結論不經間歇分離中間體，產生了該被保護的肽。第一個實施例的所獲產物的純度和鑒定證明，在該方法的所有步驟中均完全地除去了過量的(活化)羧基成分，而且使用本發明方法未形成插入序列。而且，第二個實施例的合成證明，根據本發明方法的合成可以容易地擴大規模。這兩個實施例中均在相對短時間內獲得了高產率高純度的產物。
權利要求
1.在有機溶劑或有機溶劑混合物中快速溶液合成肽的方法，該方法包括步驟(a)-(b)的重復循環(a)偶聯步驟，使用過量的活化羧基成分酰化氨基成分，(b)淬滅步驟，在該步驟中使用清除劑除去殘余的活化羧基官能團，其中該清除劑還可以用于使生長中的肽去保護，(c)一或多個水抽提，和任選地，(d)獨立的去保護步驟，之后進行一或多次水抽提，其特征在于該方法包括至少一個步驟(b)，稱作步驟(b’)，在該步驟中使用包含自由陰離子或潛陰離子的胺作為殘余活化羧基官能團的清除劑。
2.權利要求1的方法，其中步驟(a)中所用試劑的摩爾量按以下遞減順序排列羧基成分、偶聯添加劑＞偶聯試劑＞氨基成分。
3.權利要求1的方法，其中步驟(a)中使用預先活化的羧基成分。
4.權利要求1至3之任一項的方法，其中步驟(b’)中使用包含潛陰離子的胺作為所述清除劑。
5.權利要求4的方法，其中該清除性胺中的潛陰離子帶有在與生長中的肽連接的任何持久保護基團存在時能被選擇性地去除的暫時性保護基團。
6.權利要求4或5的方法，其中清除性胺中的潛陰離子帶有暫時性保護基團，該暫時性保護基團表現出與生長中的肽N端存在的暫時性保護基團類似的不穩定性。
7.權利要求5或6的方法，其中暫時性保護基團是可氫解去除的基團，而持久保護基團是可酸解去除的基團。
8.權利要求7的方法，其中暫時性保護基團是芐基類的。
9.權利要求4-8之任一項的方法，其中清除劑是包含自由陰離子或潛陰離子的伯胺。
10.權利要求9的方法，其中伯胺是C端被保護的氨基酸的衍生物。
11.權利要求10的方法，其中氨基酸是β-丙氨酸或其衍生物。
12.權利要求11的方法，其中清除劑是β-丙氨酸芐基酯或其鹽。
13.權利要求1-8之任一項的方法，其中使用包含自由陰離子或潛陰離子的硫醇代替包含自由陰離子或潛陰離子的胺作為清除劑。
14.權利要求1-13之任一項的方法，其中該方法包含一或多個循環，在所述循環中步驟(b)中使用多胺作為清除劑。
15.權利要求1-14之任一項的方法，包含一或多個循環，在該循環中步驟(b)中不發生去保護，而且隨后的步驟(c)包含順序的堿性、酸性和堿性抽提。
16.權利要求15的方法，其中在存在氯化鈉或硝酸鉀時進行抽提。
17.權利要求15或16的方法，包括隨后的步驟(d)，該步驟包含去保護和順序的堿性和中性抽提。
18.權利要求17的方法，其中在存在氯化鈉或硝酸鉀時進行抽提。
19.權利要求1-14之任一項的方法，包含一或多個循環，在該循環中步驟(b)中發生淬滅和去保護兩者，而且隨后的步驟(c)包含順序的堿性和中性抽提。
20.權利要求19的方法，其中在存在氯化鈉或硝酸鉀時進行抽提。
21.權利要求1-20之任一項的方法，其中在最后一個循環，步驟(a)中的羧基成分保護基團表現出與生長中的肽的持久保護基團相似的不穩定性，而且步驟(b)中清除劑是多胺。
22.權利要求1-21之任一項的方法，其中有機溶劑或有機溶劑混合物是乙酸乙酯或乙酸乙酯和二氯甲烷的混合物、乙酸乙酯和1-甲基-2-吡咯烷酮的混合物、乙酸乙酯和N，N-二甲基甲酰胺的混合物或乙酸乙酯和四氫呋喃的混合物。
23.權利要求1-22之任一項的方法，其中該方法在0至50℃的溫度范圍內進行。
24.權利要求23的方法，其中該方法在環境溫度下進行。
25.使用分開和混合方法組合合成肽文庫的方法，其中應用權利要求1-24之任一項的方法。
26.自動化溶液合成肽的方法，其中應用權利要求1-25之任一項的方法。
27.根據包含權利要求1-26之任一項的方法的方法制備的肽或肽混合物。
全文摘要
本發明涉及快速溶液合成肽的方法，該方法包括步驟(a)－(b)的重復循環(a)偶聯步驟，使用過量的活化羧基成分酰化氨基成分，(b)淬滅步驟，在該步驟中使用清除劑除去殘余的活化羧基官能團，其中該清除劑還可以用于使生長中的肽去保護，(c)一或多個水抽提和任選地，(d)獨立的去保護步驟，之后進行一或多次水抽提，其特征在于該方法包括至少一個步驟(b)，稱作步驟(b’)，在該步驟中包含自由陰離子或潛陰離子的胺或硫醇用作殘余活化羧基官能團的清除劑。在本發明方法中，在獲得最終肽序列之前，無需分離生長中的肽。此高效方法對于制備高純度的寡肽和多肽是有用的。
文檔編號C07K2/00GK1398876SQ0212619
公開日2003年2月26日 申請日期2002年7月18日 優先權日2001年7月19日
發明者I·F·艾根, P·B·W·坦, 科特納爾, C·A·G·哈斯努特 申請人:阿克佐諾貝爾公司