專利名稱：用來自枯草芽孢桿菌的α-淀粉酶從淀粉產生葡萄糖的制作方法
用來自枯草芽孢桿菌的α-淀粉酶從淀粉產生葡萄糖交叉引用本申請要求2008年6月6日提交的美國臨時專利申請系列號61/059，535的優先 權，該專利申請在此引用作為參考。序列表包含SEQ ID NO 1~24的序列表作為附件，并在此以其整體引入作為參考。 發明領域提供來自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的α -淀粉酶(AmyE)、其變體、編 碼AmyE或其變體的核酸以及含有該核酸的宿主細胞。公開了使用AmyE或其變體的方法， 其包括淀粉液化和/或糖化等。此類方法可以產生例如用于乙醇產生或高果糖玉米糖漿產 生的糖類。
背景技術：
植物淀粉，例如玉米淀粉被廣泛用于工業制備諸如糖漿和生物燃料的產物。例如， 高果糖玉米糖漿(HFCQ是加工形式的玉米糖漿，其具有高果糖含量和與糖相當的甜度，使 得HFCS可在軟飲料和其他加工食物中用作糖替代物。HFCS生產目前代表了十億美元的產 業。生產乙醇作為生物燃料也是不斷增長的產業。可以通過催化淀粉降解為葡萄糖的酶促方法從淀粉產生糖漿和生物燃料。此酶促 方法通常涉及一系列酶催化的反應(1)液化α -淀粉酶(EC 3. 2. 1. 1)首先催化可含有30-40% w/w干固體(ds)的 淀粉懸液降解為麥芽葡聚糖(maltodextran)。α -淀粉酶是催化隨機切割內部的α_1， 4-D-糖苷鍵的內水解酶(endohydrolase)。因為通常在高溫，例如90-100°C下進行液化， 所以優選將熱穩定的α-淀粉酶，如來自芽孢桿菌屬物種(Bacillus sp.)的α -淀粉酶 用于此步驟。目前用于此步驟的α -淀粉酶，例如來自地衣芽孢桿菌(B. Iicheniformis)、 解淀粉芽孢桿菌(B. amyloliquefaciens)和嗜熱脂肪芽孢桿菌(B. stearothermophilus) (AmyS)的α-淀粉酶不產生顯著量的葡萄糖。相反，產生的液化產物(Iiquefact)具有低 葡萄糖當量(DE)且含有麥芽糖和高聚合度(DPn)糖類。(2)糖化葡糖淀粉酶和/或產麥芽糖(maltogenic) α -淀粉酶催化液化后形成 的麥芽葡聚糖的非還原端水解，釋放D-葡萄糖、麥芽糖和異麥芽糖。糖化產生富含葡萄糖 的糖漿或高麥芽糖糖漿。在前者的情況下，葡糖淀粉酶通常于升高的溫度在酸性條件下 催化糖化，例如在60°C、pH 4. 3下。用于此方法中的葡糖淀粉酶通常獲自真菌，例如用于 Optidex L400中的黑曲霉(Aspergillus niger)葡糖淀粉酶或灰腐質霉(Humicula grisea)葡糖淀粉酶。脫支酶，如支鏈淀粉酶可以輔助糖化。備選地，產麥芽糖α -淀粉酶可以催化糖化來形成高麥芽糖糖漿。產麥芽糖α -淀 粉酶通常具有比葡糖淀粉酶更高的最適PH和更低的最適溫度，且產麥芽糖淀粉酶通常需 要Ca2+。目前用于此應用中的產麥芽糖α-淀粉酶包括枯草芽孢桿菌α-淀粉酶、植物淀 粉酶以及來自米曲霉(Aspergillusoryzae)的α -淀粉酶(Clarase L的活性成分)。
權利要求
1.使用枯草芽孢桿菌α-淀粉酶(AmyE)從寡糖或淀粉底物溶液產生葡萄糖的方法，其 包括(i)使AmyE與寡糖或多糖底物接觸；并(ii)將底物溶液轉化為含有葡萄糖的溶液，其中所述AmyE包含與SEQID NO :1的AmyE 具有至少約85%序列同一性的氨基酸序列。
2.權利要求1的方法，其中所述寡糖溶液主要含有麥芽七糖(DP7)或高級寡糖。
3.權利要求1的方法，其中所述淀粉溶液是未蒸煮的玉米淀粉。
4.權利要求1的方法，其中在所述轉化期間，所述底物溶液的pH是約pH5.6至約pH5. 8。
5.權利要求1的方法，其中所述轉化不包括使底物溶液與葡糖淀粉酶接觸。
6.權利要求1的方法，其中步驟(i)進一步包括使淀粉底物與葡糖淀粉酶接觸。
7.權利要求6的方法，其中添加所述葡糖淀粉酶至低于約0.5GAU/gds的濃度。
8.權利要求7的方法，其中添加所述葡糖淀粉酶至低于約0.02GAU/gds的濃度。
9.權利要求1的方法，其中所述含有葡萄糖的溶液包含至少約0.2g/L葡萄糖。
10.權利要求9的方法，其中所述含有葡萄糖的溶液包含至少約0.4g/L葡萄糖。
11.權利要求10的方法，其中所述含有葡萄糖的溶液包含至少約1.4g/L葡萄糖。
12.權利要求1的方法，其中所述AmyE選自包含SEQID NO U SEQID NO :2、SEQ ID NO 3, NCBI 檢索號 ABW75769、NCBI 檢索號 ABK54355、NCBI 檢索號 AAF14358、NCBI 檢索號 AATO1440, NCBI 檢索號 AAZ30064、NCBI 檢索號 NP_388186、NCBI 檢索號 AAQ83841 和 NCBI 檢索號BAA315^所示的氨基酸序列的AmyE。
13.權利要求1的方法，其進一步包括(iii)發酵所述含有葡萄糖的溶液來產生乙醇。
14.權利要求13的方法，其中所述乙醇濃度為至少約6%ν/ν乙醇。
15.權利要求14的方法，其中所述乙醇濃度為至少約14%ν/ν乙醇。
16.權利要求1的方法，其進一步包括(iii)使所述含有葡萄糖的溶液與葡萄糖異構酶 接觸來產生高果糖玉米糖漿。
17.脫漿紡織品的方法，其包括(i)使紡織品與AmyE接觸，和(ii)脫漿所述紡織品，其 中所述AmyE包含與SEQ ID NO 1的AmyE具有至少約85%序列同一性的氨基酸序列。
18.洗滌物品的方法，其包括(i)使待洗滌的物品與含有AmyE的洗滌劑組合物接觸，和(ii)洗滌所述物品，其中所述AmyE包含與SEQID NO :1的AmyE具有至少約85%序列 同一性的氨基酸序列。
19.權利要求18的方法，其中所述待洗滌的物品是餐具或衣服。
20.權利要求18的方法，其中所述洗滌劑組合物是無粉塵顆粒或穩定的液體。
21.權利要求18的方法，其中所述洗滌劑組合物還含有纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶或其 組合。
22.權利要求21的方法，其中所述淀粉酶是α-淀粉酶、β-淀粉酶或葡糖淀粉酶。
23.權利要求18的方法，其中所述洗滌劑組合物還含有脂肪酶、過氧化物酶、甘露聚糖 酶、果膠酸裂合酶或其組合。
24.權利要求18的方法，其中所述洗滌劑組合物是手洗或機洗餐具洗滌洗滌劑組合物。
25.權利要求對的方法，其中所述洗滌劑組合物還含有蛋白酶、脂肪酶、過氧化物酶、 淀粉酶、纖維素酶、甘露聚糖酶、果膠酸裂合酶或其組合。
全文摘要
來自枯草芽孢桿菌的α-淀粉酶(AmyE)從包括植物淀粉、麥芽七糖和麥芽三糖的多種糖類底物產生顯著量的葡萄糖。此有利特性允許將AmyE或其變體用于具有減少的或消除的對葡糖淀粉需要的糖化反應中等。例如，減少或消除葡糖淀粉酶的需要顯著改善乙醇或高果糖玉米糖漿的產生效率。
文檔編號D06L1/00GK102112621SQ200980130315
公開日2011年6月29日 申請日期2009年6月4日 優先權日2008年6月6日
發明者A·R·托波扎達, A·肖, C·A·里夸德特, D·A·埃斯特爾, L·G·卡斯康-佩雷拉, L·華萊士, M·J·佩珀森, R·金, S·D·鮑爾, S·W·拉默, S-K·李, W·A·奎瓦斯 申請人:丹尼斯科美國公司