專利名稱：具有改變性質的TS23α-淀粉酶變體的制作方法
技術領域：
本發明公開了涉及TS-23阿爾法_淀粉酶(α -淀粉酶)的變體的組合物和方法， 相對于親本淀粉酶，所述變體具有改變的生化性質和有利的性能特性。此處公開的變體適 用于例如淀粉轉化、乙醇生產、衣物和餐具洗滌、硬表面清潔、紡織品退漿和/或增甜劑生產。
背景技術：
淀粉是直鏈淀粉(15-30% w/w)和支鏈淀粉(70-85% w/w)的混合物。直鏈淀粉 是由α-1，4連接的葡萄糖單位的線性鏈組成，具有分子量(MW)從約60，000至約800，000。 支鏈淀粉是分支多聚體，每24-30個葡萄糖單位其含有α_1，6分支點。其分子量可以高達 1億。目前是通過酶催化過程從淀粉產生濃縮的葡萄糖糖漿形式的糖，所述催化過程涉 及(1)用α -淀粉酶將固體淀粉液化(或稀薄化)為具有約7-10平均聚合度的糊精，和 (2)用淀粉葡糖苷酶(也稱為葡糖淀粉酶或GA)對產生的液化淀粉(即，淀粉水解物)的糖 化作用。產生的糖漿具有高的葡萄糖含量。商業生產的大部分葡萄糖糖漿隨后被酶促異構 化為右旋葡萄糖/果糖混合物，稱為異構糖漿(isosyrup)。α-淀粉酶(α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，Ε. C. 3.2. 1. 1)是一組酶，其通過 隨機切割內在的α-1，4-糖苷鍵水解淀粉、糖原和有關的多糖。這一組酶具有多種重要的 商業應用，例如在淀粉加工的初始階段(液化)中、在紡織品的退漿中、在再循環紙的脫墨 中、在紙和紙漿工業中的淀粉修飾、在濕玉米碾磨中、在乙醇生產中、在增甜劑(例如糖)生 產中、在飲料工業中、在釀造中、在油礦、在動物飼料和在去污劑基質中作為清潔劑。例如， 這些酶可以在餐具和洗衣過程中用于去除淀粉污漬。α-淀粉酶分離自多種細菌、真菌、植物和動物來源。工業上，許多重要的α-淀粉 酶分離自桿菌。一種表征過的α-淀粉酶是嗜堿性的桿菌物種TS-23菌株的α-淀粉酶，該 菌株產生至少五類呈現淀粉水解活性的酶。(Lin等人，1998，“Production and properties of a raw-starch-degrading amylase from the thermophilic and alkaliphilic Bacillus sp. TS-23, "Biotechnol. App 1. Biochem. 28 :61_68)。雖然其在寬范圍 pH 內(即， pH4. 7至10.8)穩定，桿菌物種TS-23菌株的α -淀粉酶的最適宜pH為9。雖然該酶在較 低溫度例如15-20°C也有活性，但是其最適宜溫度為45°C。還是需要α -淀粉酶變體，該變體具有改變的生化特征，并且在工業應用中提供 改善的性能。
發明內容
本發明公開了 TS-23 α _淀粉酶的變體(突變體)，該變體呈現改變了的性質，有利 于多種工業過程，例如，淀粉的加工(例如淀粉液化、糖化等)，紡織品的加工(例如退漿) 和作為洗滌劑的添加劑(例如用于清潔淀粉類污漬)。這種改變包括但不限于在比活性、底物特異性、底物結合、底物裂解模式、熱穩定 性、氧化穩定性、Ca2+依賴性、pH/活性譜、pH/穩定性譜和其他目的性質上的改變。一個示 例性改變的pH/穩定性譜是在低pH (例如pH < 6甚至pH < 5)和/或高pH (例如pH > 9) 下提高的穩定性。在本發明的一個方面，提供了親本AmyTS23 α -淀粉酶的變體，其具有與親本 α _ 淀粉酶有至少約 80 %、81 %、82%、83 %、84%、85 %、86%、87 %、88%、89%、90 %、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或甚至99%同一性的氨基酸序列，而且包含 下列特征中的至少兩個(a) C末端的平截，(b)氨基酸201的取代，或(C)RlSO和SlSlS 基的缺失，而且其中該變體具有α -淀粉酶活性(使用SEQ ID Ν0:1對氨基酸進行編號)。 在一些實施方式中，親本α-淀粉酶是SEQ ID Ν0:1。在一些實施方式中，親本α -淀粉酶 與SEQ ID NO 1有指定的同源性。本發明的另一方面涉及手洗或自動洗滌的餐具洗滌組合物，包括桿菌物種TS-23 菌株α-淀粉酶或其變體。該組合物可進一步包含表面活性劑、洗滌劑增效劑、絡合劑、聚 合物、漂白系統、穩定劑、發泡劑、泡沫抑制劑、防腐蝕劑、污物懸浮劑、防塵污再沉積劑、染 料、殺菌劑、水溶增溶劑、晦暗抑制劑和香味劑中的一種或多種。該餐具洗滌組合物可以是 用于手洗或自動洗滌餐具的組合物。本發明的一個相關方面涉及洗衣洗滌劑添加劑，包含桿菌物種TS-23菌株α _淀 粉酶或其變體。如上所述，該組合物可進一步包含表面活性劑、洗滌劑增效劑、絡合劑、聚合 物、漂白系統、穩定劑、發泡劑、泡沫抑制劑、防腐蝕劑、污物懸浮劑、防塵污再沉積劑、染料、 殺菌劑、水溶增溶劑、晦暗抑制劑和香味劑中的一種或多種。該組合物也可包含表面活性 齊U、洗滌劑增效劑、絡合劑、聚合物、漂白系統、穩定劑、發泡劑、泡沫抑制劑、防腐蝕劑、污物 懸浮劑、防塵污再沉積劑、染料、殺菌劑、水溶增溶劑、熒光增白劑、織物調節劑和香味劑中 的一種或多種。進一步的方面涉及編碼上述變體的核酸和包含這種核酸的載體。還涉及 其中插入了該核酸的細胞，例如通過載體、噬菌體或病毒插入。這種分離的宿主細 胞可以是微生物，例如細菌或真菌。細菌可以是革蘭氏陽性菌，選自下組中枯草 芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢桿菌(B. Iicheniformis)、遲緩芽孢桿菌 (B. Ientus)、短芽孢桿菌(B. brevis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(G. stearothermophilus,以 前稱作B. stearothermophilus)、嗜堿芽孢桿菌(B. alkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌 (B. amyIoliquefaciens)、凝固芽抱桿菌(B. coagulans)、環狀芽抱桿菌(B. circulans)、 燦爛芽孢桿菌(B. Iautus)、蘇云金芽孢桿菌(B. thuringiensis)、淺青紫鏈霉菌 (Streptomyces lividans)和鼠灰鏈霉菌(S. murinus)；或革蘭氏陰性細菌，其中所述革蘭 氏陰性細菌是大腸桿菌(Escherichia coli)和假單胞菌屬(Pseudomonas)物種。其他方面涉及制備該變體多肽的方法和該變體多肽在多種工業工藝中(例如淀 粉液化中)單獨使用或與其他酶聯合使用的用途，其他酶包括α-分解淀粉酶。一些方面涉及多種多肽用于洗衣或餐具洗滌的用途。還涉及用上述多種多肽清潔織物和/或其他硬 表面的方法。另一個方面涉及此處描述的α-淀粉酶或任何該α-淀粉酶變體在織物退漿 組合物中的用途，例如其中該組合物是水性溶液。還涉及用該組合物退漿織物的方法。該變體多肽可任選地以無塵顆粒、微粒、穩定化液體或受保護的酶的形式存在。另 一方面涉及洗滌劑添加劑或洗滌劑組合物，進一步包含選自下組的酶纖維素酶、蛋白酶、 酰基轉移酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、殼多糖酶、角質酶(cutinase)、環 糊精葡聚糖轉移酶(cyclodextrin glycotransferase)、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α -半乳糖 苷酶、β “半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α -葡糖苷酶、β -葡糖苷酶、鹵代過氧化物酶、轉化酶、 漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、肽谷氨酰胺酶、過氧化物酶、植酸酶、多酚 氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉谷氨酰胺酶、木聚糖酶、支鏈淀粉酶、異淀粉酶 、角叉菜 酶(Carrageenase)及其任意組合。用于該組合物的其他淀粉酶包括兩種或多種其他α -淀 粉酶、β-淀粉酶、異淀粉酶或葡糖淀粉酶。一些方面涉及水性溶液中的用于淀粉加工的組合物，包括桿菌物種TS-23菌株 α-淀粉酶或其變體。還涉及使用這種組合物加工淀粉的方法。該方法和組合物可進一步 包括葡糖淀粉酶、異淀粉酶、支鏈淀粉酶、植酸酶或其組合。又一個其他方面涉及在溶液或 凝膠中的生物膜降解(例如水解)組合物，包括桿菌物種TS-23菌株α-淀粉酶或其變體， 可選地進一步包括纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶、脂肪酶、蛋白酶、果膠酶、抗微生物劑 或其任意組合。還涉及用該組合物水解生物膜的方法。另一方面涉及溶液中的糖化淀粉的組合物，包括桿菌物種TS-23菌株α -淀粉酶 或其變體。所以，還涉及糖化淀粉的方法，包括將含有所述淀粉酶的組合物施用足以糖化淀 粉的一段時間。另一方面涉及在溶液中的液化淀粉的組合物，包括桿菌物種TS-23菌株α -淀粉 酶或其變體。還涉及液化淀粉的方法，包括將該組合物施用足以液化淀粉的一段時間。下面描述該組合物和方法的一些具體方面。在一方面，提供了親本AmyTS23 α -淀粉酶的變體，其中該變體具有與該親本 α -淀粉酶至少80%同一性的氨基酸序列，而且含有下列特征中的至少兩個(a) C-末端的平截，(b)殘基201的取代，或(c)殘基Rl8O和Sl8I的缺失，其中所述氨基酸殘基是指SEQ ID NO :1的氨基酸序列。在一些實施方式中，變體 具有α-淀粉酶活性。在一些實施方式中，該變體與親本α-淀粉酶具有至少90%同一性。在一些實 施方式中，該變體與親本α-淀粉酶具有至少95%同一性。在具體的實施方式中，該親本 α -淀粉酶具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列。在一些實施方式中，該變體進一步包括在選自下組中的一個或多個殘基處的取 代殘基87、殘基225、殘基272和殘基282。在另一方面，提供了親本AmyTS23 α-淀粉酶的變體，其中該變體具有與該親本 α-淀粉酶至少85%同一性的氨基酸序列，而且含有C-末端的平截。在一些實施方式中， 該變體具有SEQ ID NO :2的氨基酸序列。與親本淀粉酶相比，在冷水中該變體對淀粉污漬可以具有提高的清潔活性。在一些實施方式中，該變體進一步包含R180和S181位點殘基的缺失，其中氨基酸 殘基位點參考SEQ ID NO :1的氨基酸序列。與親本淀粉酶相比，該變體可具有提高的洗滌 劑穩定性。 在一些實施方式中，該變體進一步包含201位點殘基的取代，其中氨基酸殘基位 點參考SEQ ID NO :1的氨基酸序列。與親本淀粉酶相比，該變體可具有提高的氧化穩定性。 該變體可具有取代M201L。上述任何變體可進一步包括在選自下組中的一個或多個殘基處的取代殘基87、 殘基225、殘基272和殘基282，其中氨基酸殘基位點參考SEQ ID NO 1的氨基酸序列。在一個相關的方面，提供了編碼此處所述變體的核酸。在一些實施方式中，提供了 包含在適宜啟動子控制下的該核酸的表達載體。在一些實施方式中，提供了包含該表達載 體的宿主細胞。在一個相關的方面，提供了手洗或自動洗滌餐具的組合物，該組合物包含此處所 述的變體和下列物質中的一種或多種表面活性劑、洗滌劑增效劑、絡合劑、聚合物、漂白系 統、穩定劑、發泡劑、泡沫抑制劑、防腐蝕劑、污物懸浮劑、防塵污再沉積劑、染料、殺菌劑、水 溶增溶劑、晦暗抑制劑和香味劑。在一個相關的方面，提供了衣物洗滌劑添加劑，包含此處所述的變體和下列物質 中的一種或多種表面活性劑、洗滌劑增效劑、絡合劑、聚合物、漂白系統、穩定劑、發泡劑、 泡沫抑制劑、防腐蝕劑、污物懸浮劑、防塵污再沉積劑、染料、殺菌劑、水溶增溶劑、熒光增白 齊U、織物調節劑和香味劑。在另一方面，提供了從織物去除淀粉的方法，包括在親本AmyTS23 α-淀粉酶的 變體存在下孵育織物，其中該變體具有與該親本α-淀粉酶至少80%同一性的氨基酸序 列，并包含下列特征中的至少兩個(a) C-末端的平截，(b)殘基201的取代，或(c)殘基R180和S181的缺失，其中所述氨基酸殘基參照SEQ ID NO 1的氨基酸序列，而且其中該孵育從織物去 除了淀粉。在一個相關方面，提供了加工淀粉的方法，該方法包括在親本AmyTS23 α -淀粉酶 的變體存在下孵育織物，其中該變體具有與該親本α “淀粉酶至少80%同一性的氨基酸序 列，并包含下列特征中的至少兩個(a) C-末端的平截，(b)殘基201的取代，或(c)殘基Rl8O和Sl8I的缺失，其中所述氨基酸殘基參照SEQ ID NO 1的氨基酸序列，而且其中這種孵育水解了 該淀粉。本發明組合物和方法的這些和其他方面和實施方式將由于這里的公開和附圖而 變得明了。


圖1示出了親本AmyTS23 α -淀粉酶的氨基酸序列(全長、成熟的；SEQ ID NO 1)。圖2示出了 AmyTS23t平截多肽的氨基酸序列(成熟的；SEQ ID NO 2)。黑體和下 劃線表示的殘基表示SEQ ID NO 2位于R180、S181和M201的氨基酸殘基。圖3示出了經優化的amyTS23基因的DNA序列(SEQ ID NO :3)。圖4示出了經優化的amyTS23t基因的DNA序列(SEQ ID NO :4)。 圖5說明了 AmyTS23和AmyTS23t的表達框。圖6是描述使用全長AmyTS23淀粉酶(AmyTS23fl)和OxAm對照進行樣品清潔測 定的結果的圖。圖7是描述使用淀粉酶Amy TS23fl和OxAm對照進行的樣品清潔測定結果的圖。圖8是描述用淀粉酶AmyTS23t和OxAm對照進行的樣品清潔測定結果的圖。圖9是描述使用AmyTS23t和OxAm對照進行的樣品清潔測定結果的圖。圖10是描述在兩種不同的衣物洗滌劑中AmyTS23t和AmyTS23t Δ RS的經增加的 穩定性研究的圖。圖 11 是描述 AmyTS23t、AmyTS23tARS*AmyTS23t(M201L+ARS)的氧化穩定性的圖。圖12為描述AmyTS23t Δ RS在液體洗滌劑中對稻米淀粉樣品的性能的圖。圖13是描述作為電荷改變的函數的剩余活性的圖。圖14 描述了在本公開中引用的其它氨基酸和核苷酸序列。
具體實施例方式本文公開了涉及桿菌物種TS-23菌株的α -淀粉酶及其變體的組合物和方法。 TS-23的變體具有改變的生化特性并在例如洗衣和餐具洗滌劑應用中呈現高性能。下面將 詳細描述這些變體的這些和其他特征以及使用這些變體的應用。1.定義和縮寫在本詳述中，應用下面的縮寫和定義。除非上下文另有明確指明，否則單數形式 “一”、“一個”和“該”涵蓋對復數形式的提及。因此，例如，提到“酶”時包括多個此類酶，而 提到“該制劑”時包括一個或多個制劑以及本領域技術人員已知的其等價物，等等。除非另有定義，否則此處使用的所有技術和科學術語與本領域技術人員所通常理 解的含義相同。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY，第 二版，John Wiley 和 Sons，紐約(1994)和Hale&Markham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial，紐約(1991)為技術人員提供了許多此處使用術語的綜合 詞典。在某些方面，此處所述組合物和方法依賴于遺傳工程和分子生物學領域中使用 的常規技術和方法。下列資源包括了用于本發明組合物和方法的一般方法學的描述 Sambrook等人，MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL (第二版，1989) ；Kreigler, GENE TRANSFER AND EXPRESSION ；A LABORATORY MANUAL (1990)和 Ausubel 等人編輯，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(1994)。這些常用參考書提供了本領域公知的定義和方 法。但是，此本發明的組合物和方法不應限制于其描述的任何特定的技術、方案和試劑，因為這些都可以改變。雖然與此處描述的方法和材料相似或等價的任何方法和材料都能夠 用于實施或者檢測此處所公開的組合物和使用方法，但是在此仍然說明了優選的方法和材 料。當描述蛋白質和其編碼基因時，通常基因名字是斜體而且沒有大寫的，而蛋白質 名字通常不是斜體而且第一個字母大寫。此處引用的所有專利和公開，包括所有在這些專利和公開中公開的序列都明確地 合并于此作為參考。1. 1.定義如此處所用的術語“淀粉”指包含植物復雜多糖碳水化合物、包含具有通式 (C 6HltlO5)x (其中X可以是任意數)的直鏈淀粉和支鏈淀粉的任何材料。該術語特別涉及 包括但不限于谷物、草、塊莖類和根的任何植物類材料，更具體地，是指小麥、大麥、玉米、黑 麥、稻、高粱、糠、木薯、小米、馬鈴薯、甜馬鈴薯和木薯淀粉。此處使用的“淀粉酶”是能夠催化淀粉降解的酶。淀粉酶是斷裂淀粉中 α-D-(1 — 4)0-糖苷鍵的水解酶。通常，將α-淀粉酶(EC 3.2. 1. 1 ； α-D-(1 — 4)-葡聚 糖葡聚糖水解酶)定義為以隨機方式切開淀粉分子內α-D-(l —4)0-糖苷鍵的內切酶。與 此不同，諸如β-淀粉酶(EC 3.2. 1.2; a-D-(1 — 4)-葡聚糖麥芽糖水解酶)等外切淀粉 酶和如產麥芽糖(maltogenic) α-淀粉酶(EC 3.2. 1. 133)的一些產物特異性淀粉酶從底 物的非還原末端切割淀粉分子。β "淀粉酶、α -葡糖苷酶(EC 3. 2. 1.20； α -D-葡糖苷葡 糖水解酶)、葡糖淀粉酶(EC 3.2. 1.3 ;α -D-(1 — 4)-葡聚糖葡糖水解酶)，以及產物特異 性淀粉酶可以從淀粉產生特定長度的低聚麥芽糖。此處使用的“淀粉酶”包括任何/所有 淀粉酶，包括葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶和野生型α-淀粉酶、例如芽孢桿菌屬物 種(例如地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌)的淀粉酶。此處使用的“桿菌物種TS-23菌株α -淀粉酶”和相似的短語是指來源于桿菌物種 TS-23菌株的α-淀粉酶。編碼該α-淀粉酶的基因可以是野生型基因或者編碼該α-淀 粉酶的密碼子優化的多聚核苷酸。桿菌物種TS-23菌株成熟的α-淀粉酶為(氨基至羧基 方向)(SEQ ID NO 1 ；圖 1)ntapinetmm qyfewdlpnd gtlwtkvkne aanlsslgit alwlppaykg 50tsqsdvgygv ydlydlgefn qkgtirtkyg tktqyiqaiq aakaagmqvy 100advvfnhkag adgtefvdav evdpsnrnqe tsgtyqiqaw tkfdfpgrgn 150tyssfkwrwy hfdgtdwdes rklnriykfr stgkawdwev dtengnydyl 200mfadldmdhp evvtelknwg twyvnttnid gfrldavkhi kysffpdwlt 250yvrnqtgknl favgefwsyd vnklhnyitk tngsmslfda plhnnfytas 300kssgyfdmry llnntlmkdq pslavtlvdn hdtqpgqslq swvepwfkpl 350ayafiltrqe gypcvfygdy ygipkynipg lkskidplli arrdyaygtq 400rdyidhqdii gwtregidtk pnsglaalit dgpggskwmy vgkkhagkvf 450ydltgnrsdt vtinadgwge fkvnggsvsi wvaktsnvtf tvnnatttsg 500qnvyvvanip elgnwntana ikmnpssypt wkatialpqg kaiefkfikk 550dqagnviwes tsnrtytvpf sstgsytasw nvp583如此處使用的“桿菌物種TS-23菌株α -淀粉酶變體”和相似的短語是指野生型桿菌物種TS-23菌株α -淀粉酶的變體/突變體，包括對桿菌物種TS-23菌株淀粉酶親本 (野生型，參照)氨基酸序列的序列取代、插入和/或缺失。術語“變體”可以與術語“突變 體”互換使用。桿菌物種TS-23菌株α-淀粉酶變體可包括與親本信號序列相比在信號序 列中的突變。另外，桿菌物種TS-23菌株α-淀粉酶變體可以是包含異源α-淀粉酶信號 序列的融合蛋白的形式，例如來自地衣芽孢桿菌的信號序列(LAT)。此處使用的短語“桿菌物種TS-23菌株α -淀粉酶親本” “野生型桿菌物種TS-23 菌株α -淀粉酶” “桿菌物種TS-23菌株α -淀粉酶參照”和相似的短語，是指桿菌物種 TS-23菌株的多肽。為方便起見，該術語可以縮寫為“親本酶” “野生型酶” “親本多肽” “參 照多肽”等等。桿菌物種TS-23菌株α-淀粉酶親本可包括在親本多肽信號序列的突變。 并且，桿菌物種TS-23菌株α-淀粉酶親本可以是包含異源α-淀粉酶信號序列(例如來 自地衣芽孢桿菌的信號序列，LAT)的融合蛋白。“親本核酸/多核苷酸” “野生型核酸/多核苷酸”或“參照核酸/多核苷酸”是指 編碼所述親本多肽的核酸序列和與其互補的核酸。“變體核酸/多核苷酸”是指編碼 包括那些與參照序列具有指定程度同源性，或能夠與參照序列雜交的 核酸，例如，能夠在嚴緊條件(例如50°C和0.2 X SSC {IX SSC = O. 15M NaCl、0. 015M檸檬酸 三鈉，pH7. 0})或高嚴緊條件(例如 65°C和 0. IX SSC{IX SSC = 0. 15M NaCl、0. 015M 檸檬 酸三鈉，pH7.0})下雜交。變體核酸可以優化為反映對于特定宿主生物優選的密碼子的應 用，所述宿主生物例如甲基營養酵母(例如畢赤酵母屬(Pichia)、漢遜酵母屬(Hansenula) 等)或絲狀真菌(例如木霉菌屬(Trichoderma)(例如里氏木霉(T.reesei))等或其他表 達宿主(例如桿菌屬、鏈霉菌屬(Str印tomyces)等。在涉及細胞、核酸、蛋白質或載體時使用的術語“重組”，是指受試者已經通過引入 異源的核酸或蛋白質或改變天然核酸或蛋白質而被修飾，或者指的是該細胞源自這樣修飾 過的細胞。所以，例如重組細胞表達在天然(非重組的)形式的細胞中未發現的基因，或者 表達那些否則會異常表達、下調或者完全不表達的天然基因。此處術語“回收的”、“分開的”和“分離的”用于指從與其天然相關的和天然存在 的至少一種其它組分中分離出來的化合物、蛋白質、細胞、核酸或氨基酸。如本文使用的，術語“純化的”指物質(例如分離的多肽或多核苷酸)處于相對純 的狀態，例如至少約90%純，至少約95%純，至少約98%純，或甚至至少約99%純。術語“熱穩定的”和“熱穩定性”指該酶在暴露于升高的溫度之后保持活性的能力。 酶(例如α-淀粉酶)的熱穩定性通過其半衰期(t1/2)測量，半衰期(t1/2)是以分鐘、小時 或天計算的時間，其間在定義的條件下損失一半酶活性。半衰期通過在暴露于升高的溫度 (即用升高的溫度刺激)后測量殘余的α-淀粉酶活性來計算。 "ρΗ范圍”指酶呈現催化活性的能力的PH值范圍。此處使用的“ρΗ穩定的”和“ρΗ穩定性”指在預定時間段內酶在寬ρΗ范圍下保持 活性的能力(例如15分鐘、30分鐘、1小時等)。如本文所使用，“氨基酸序列”與術語“多肽” “蛋白質”和“肽”同義，可互換使用。 當這樣的氨基酸序列呈現活性時，可稱作“酶”。此處使用常規的單字母或三字母密碼來表示氨基酸殘基。術語“核酸”包括DNA、RNA、異源雙鏈核酸分子和能夠編碼多肽的合成分子。核酸 可以是單鏈或雙鏈，也可以是其化學修飾形式。此處術語“核酸”和“多核苷酸”可以互換 使用。因為遺傳密碼是簡并性的，多于一個密碼子可以用于編碼一個特定的氨基酸，所描述 的組合物和方法包括編碼具體氨基酸序列的核苷酸序列。
除非另外說明，核酸分別以5’至3’的方向從左寫到右，氨基酸序列分別以氨基到 羧基的方向從左寫到右。“同源物”應指與主題氨基酸序列和主題核苷酸序列具有一定程度同一性的實體。 用常規的序列比對工具(例如Clustal，BLAST等)比對，同源序列包括與主題序列具有 至少約 75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%或甚至99%同一性的氨基酸序列。除非另外說明，通常， 同源物包括與主題氨基酸序列相同的活性位點殘基。如本文所使用，“雜交”是指核酸的一個鏈與互補鏈堿基配對的過程，如在點雜交 技術和PCR技術中發生的。如此處所使用的，“合成的”分子是由體外化學或酶促合成制備的，而不是通過生 物制備。如本文所使用，在涉及細胞時的術語“轉化的” “穩定轉化的”和“轉基因的”意思 是該細胞具有非天然的(例如異源的)核酸序列，該序列整合到細胞基因組中或者作為在 多次傳代中保持的游離質粒而被攜帶。如本領域已知，在將核酸序列插入到細胞中的上下文中，術語“引入”意思是“轉 染”或“轉化”或“轉導”。“宿主株”或“宿主細胞”是其中已經引入了包括編碼目的多肽(例如α-淀粉酶 變體)的多核苷酸的表達載體、噬菌體、病毒或其他DNA構建體的生物。示例性的宿主株是 細菌細胞。術語宿主細胞包括從細胞(例如桿菌物種細胞)制備的原生質體。涉及多核苷酸或蛋白質時術語“異源的”指不是天然發生于宿主細胞中的多核苷 酸或蛋白質。涉及多核苷酸或蛋白質時術語“內源的“指天然發生于宿主細胞中的多核苷酸或 蛋白質。本文中使用的術語“表達”指基于基因的核酸序列產生多肽的過程。該過程包括 轉錄和翻譯。術語“選擇性標記”或“可選擇標記”指能夠在宿主中表達，使攜帶該基因的宿主 容易選擇的基因。選擇性標記的實例包括但不限于抗生素(例如潮霉素、博來霉素或氯霉 素)和/或賦予宿主細胞代謝優勢的基因，例如營養優勢。“培養”是指在適宜條件下在液體或固體培養基中生長微生物細胞群。培養包括含 有顆粒淀粉的淀粉底物發酵生物轉化為終產物(通常是在容器或反應器中)。“發酵”是用微生物酶促和厭氧分解有機底物來產生更簡單的有機化合物。雖然在 厭氧條件下發生發酵，但是這并不意味著該術語僅僅限于嚴格厭氧條件，因為在氧存在的 情況下也發生發酵。“基因”是指涉及多肽產生的DNA片段，包括編碼區、編碼區之前和之后的區域，以及各個編碼片段(外顯子)之間的間插序列(內含子)。“載體”是指設計了用來將核酸引入一種或多種細胞類型的多核苷酸序列。載體包 括克隆載體、表達載體、穿梭載體、質粒、噬菌體顆粒、表達盒等。“表達載體”指包含編碼目的多肽的DNA序列的DNA構建體，該DNA序列有效連接能 夠影響其在適宜宿主中表達的適宜控制序列。這樣的控制序列可包括影響轉錄的啟動子、 控制轉錄的可選操縱子序列、編碼mRNA上合適核糖體結合位點的序列、增強子和控制轉錄 和翻譯終止的序列。“啟動子”是在結合RNA聚合酶以起始基因轉錄中涉及的調節序列。啟動子可以是 可誘導的啟動子或組成型啟動子。一個示例性啟動子是地衣芽孢桿菌α-淀粉酶(AmyL) 啟動子。
“有效連接的”指所述及的組分之間處于允許它們以其預期方式發揮功能的關系 (包括但不限于并列)中。例如，與編碼序列有效連接的調節序列是以如下方式實現連接 的，即，所述編碼序列的表達受到控制序列的調控。術語“在轉錄控制下”是指多核苷酸序列(通常是DNA序列)的轉錄，依賴于其有 效連接到的有助于轉錄起始或促進轉錄的元件。術語“在翻譯控制下”是指多核苷酸序列(通常是RNA序列)翻譯為多肽，依賴于 其有效連接到的有助于翻譯起始或促進翻譯的元件。“信號序列”是指結合到蛋白質的N末端部分的氨基酸序列，其有助于該蛋白質向 細胞外的分泌。成熟形式的細胞外蛋白質缺乏在分泌過程中被切割下來的信號序列。如本文所使用，“生物學活性”是具有特定生物學活性的序列，例如酶活性。在本發 明的淀粉酶的情況下，該活性是α "淀粉酶活性。“水硬度”是水中存在的礦物(例如鈣和鎂)的量度。“糖化”指淀粉向葡萄糖的酶促轉化。“糊化”指通過烹飪形成粘稠懸浮體的淀粉分子的溶解。“液化”是指其中糊化的淀粉水解為低分子量可溶糊精的淀粉轉化階段。術語“聚合度(DP) ”指已知糖的無水吡喃葡萄糖單元數量。DPl的例子是單糖，例 如葡萄糖和果糖。DP2的例子是二糖，例如麥芽糖和蔗糖。DP > 3表示聚合度大于3的聚 合物。對于淀粉轉化，術語“終產物”或“目的終產物”指從淀粉底物酶促轉化來的具體 碳源衍生的分子。如本文所使用的術語“干固體含量(ds)”指以％干重計，料漿中總固體的百分含量。術語“料漿”指含有不溶固體的含水混合物。術語“殘余淀粉”指在含淀粉底物發酵或酶促水解之后在組合物中剩余的淀粉 (可溶或不可溶)。如本文使用的“再循環步驟”指醪液成分的再循環，醪液中可包括殘余淀粉、酶和 /或發酵含有淀粉的底物的微生物。術語“醪液”指包括可以用于生產發酵產物(例如乙醇)的可發酵碳源(例如碳 水化合物)的水性混合物。術語“發酵醪”和“醪液”可互換使用。
術語“釜餾物”指未發酵的固體和水的混合物，其是從發酵的醪液中除去乙醇之后 的殘留物。術語“干酒糟(DDG) ”和“具有可溶物的干酒糟(DDGS) ”指谷物發酵的有用副產物。如本文使用的“產乙醇微生物”指能夠將糖或寡糖轉化為乙醇的微生物。產乙醇微 生物由于其能夠表達一種或多種酶而能夠產乙醇，所述酶可單獨或一起將糖轉化為乙醇。如本文使用的術語“乙醇生產者”或“產乙醇微生物”指能夠從己糖或戊糖產生乙 醇的任何生物或細胞。一般來講，產乙醇細胞含有乙醇脫氫酶和丙酮酸脫羧酶。產乙醇微 生物的實例包括真菌微生物，例如酵母菌。優選的酵母菌包括Sacchromyces，特別是釀酒酵 母(S. cerevisiae) 0
對于淀粉酶及其底物，術語“接觸”指將酶放置到足夠靠近其底物的位置，以使該 酶能夠轉化底物為終產物。接觸可包括混合。根據上下文，術語“源自”是指術語“起源于”、“基于” “得自”或“可得自，，和“分
離自”。術語“酶轉化” 一般指通過酶(例如淀粉酶)作用的底物(例如淀粉)的修飾。本文使用的術語“比活性”指在特定條件下每單位時間被酶制品轉化為產物的底 物的摩爾數。比活性用單位(U)/mg蛋白質表示。術語“產率”指方法產生的終產物的量，例如表示為濃度、體積、量或起始材料百分 比。“ATCC”指美國標準菌種收藏所，位于維吉尼亞州馬納薩斯20108(ATCC)。“NRRL”指美國農業研究菌種保藏中心，農業應用研究的國家中心(以前叫USDA， 美國農業部北方地區研究實驗室)，在伊利諾州皮奧里亞。數值范圍包括定義該范圍的數值。一般，標題是描述性的，而不應理解為限制。1.2.縮寫除非另外說明，應用下面的縮寫AE醇乙氧基化物AEO 醇乙氧基化物AEOS 醇乙氧基硫酸鹽AES 醇乙氧基硫酸鹽AFAU 酸性真菌α-淀粉酶單位AGU 葡糖淀粉酶活性單位AOS α-烯烴磺酸鹽AS醇硫酸鹽 BAA 解淀粉芽孢桿菌α -淀粉酶BLA 地衣芽孢桿菌(或LAT)BSA 牛血清白蛋白cDNA 互補 DNACMC 羧甲基纖維素DNA 脫氧核糖核酸
DP3 三亞基的聚合度DPn η亞基的聚合度DTMPA 二亞乙基三胺五乙酸EC 進行酶分類的酶學委員會EDTA 乙二胺四乙酸
EO 環氧乙烷F&HC 織物和家居護理FAU 真菌淀粉酶單位GA 葡糖淀粉酶gpg 每加侖顆粒HFCS 高果糖玉米糖漿HFSS 基于高果糖淀粉的糖漿IPTG 異丙基-β -D-I-硫代半乳吡喃糖苷LAS 線性烷基苯磺酸酯LOM 耐洗牢度試驗儀(Launder-0-meter)LU Liquiphon 單位MW 分子量MWU 改良的 Wohlgemuth 單位NOBS 壬酰基氧基苯磺酸鹽NTA 次氮基三乙酸PCR 聚合酶鏈式反應PEG 聚乙二醇PVA 聚(乙烯醇)PVP 聚(乙烯吡咯烷酮)RNA 核糖核酸SAS 次級烷烴磺酸鹽TAED 四酰基乙二胺TCA 三氯乙酸TSB 胰蛋白酶消化豆胨培養基UFC 超濾濃縮w/v 重量/體積w/w 重量/重量wt 野生型1.3命名法本發明的說明書和權利要求書中，使用氨基酸殘基的常規單字母和三字母密碼。 為了便于引用，用下列命名法描述本發明的組合物和方法的α-淀粉酶變體原始氨基酸位置替代氨基酸。根據這種命名法，例如，在242位置用丙氨酸取代絲氨酸表示為Ser242Ala 或 S242A
30位的丙氨酸缺失表示為Ala30* 或 A30* 或 ΔΑ30另外的氨基酸殘基的插入，例如賴氨酸的插入，表示為Ala30AlaLys 或 A30AK。 連續氨基酸殘基片段的缺失，例如氨基酸殘基30-33，表示為(30-33廣或 Δ (Α30-Ν33)或Δ 30-33。連續兩個氨基酸的缺失，例如氨基酸殘基R180-S181，表示為ARS 或 Δ 180-181。當一個特定的α -淀粉酶與其他α _淀粉酶相比時包含“缺失”，而且在這一位置 進行了一個插入時，表示為 用*36Asp或*36D指在36位插入天門冬氨酸。多個突變用加號隔開，即用Ala30Asp+Glu34Ser 或 A30N+E34S表示在30和34位分別用丙氨酸和谷氨酸替換天冬酰氨和絲氨酸。當一個或多個備選氨基酸殘基可以插入在指定位置時，表示為A30N, E ；或A30N 或 A30E。并且，當適宜于修飾的位點在此處鑒定出但沒有指定的任何特定修飾時，應理解 為任何氨基酸殘基可以替代此位置的氨基酸殘基。因此，例如，當提及位點30處的丙氨酸 的修飾但是并未指明時，應理解為丙氨酸可以被缺失或取代為任何其他氨基酸，即下列氨 基酸中的任何一個R、N、D、A、C、Q、E、G、H、I、L、K、Μ、F、P、S、Τ、W、Y、V。另外，“Α30Χ”指下列替代中的任何一個 A30R、Α30Ν、A30D、A30C、A30Q、Α30Ε、A30G、Α30Η、Α30Ι、A30L、Α30Κ、Α30Μ、A30F、 Α30Ρ、A30S、Α30Τ、A30W、Α30Υ 或 A30V ；或簡寫為A30R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、Μ、F、P、S、Τ、W、Y、V。如果用于編號的親本酶已經含有正在討論，在其位置建議進行替代的氨基酸殘 基，當例如N或V之一存在于野生型中的情況下，則用下列命名法“Χ30Ν”或“Χ30Ν，V”。所以，這意味著其他相關的親本酶在位點30處被替代為 “Asn” 或 “Val”。1.4氨基酸殘基特征帶電荷的氨基酸Asp, Glu, Arg, Lys, His帶負電荷的氨基酸(從帶負電最多的殘基開始排列)Asp, Glu帶正電荷的氨基酸(從帶正電最多的殘基開始排列)Arg, Lys, His中性氨基酸Gly, Ala, Val, Leu, lie, Phe, Tyr, Trp, Met, Cys, Asn, Gin, Ser, Thr, Pro疏水氨基酸殘基(最疏水的殘基排在最后)
Gly, Ala, Val, Pro, Met, Leu, lie, Tyr, Phe, Trp,親水氨基酸(最親水的殘基排在最后)Thr, Ser, Cys, Gin, Asn1. 5同源性(同一性) 與另一序列具有一定百分比(例如80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、 87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或甚至 99% )序列同 一性的多核苷酸或多肽是指，兩個序列相比對時，其堿基或氨基酸殘基在比較的兩條序列 中相同的百分比。這種比對和百分比同源性或同一性可以使用本領域已知的任何適宜軟 件程序來測定，例如記載于 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. Μ. Ausubel 等 人編輯，1987，增刊30，7. 7. 18部分)中的那些。優選的程序包括Vector NTI Advance 9. 0 (Invitrogen Corp. Carlsbad, CA)、GCG Pileup program, FASTA (Pearson 等人(1988) Proc. Natl Acad. Sci USA 85 2444-2448)和 BLAST(BLAST Manual, Altschul 等人，Natl Cent. Biotechnol. Inf.，Natl Lib. Med. (NCIB NLM NIH)，Bethesda, Md.，和 Altschul 等 人，(1997)NAR. 25 :3389-3402)。另一個優選的比對程序是 ALIGN Plus (Scientific and Educational Software，PA)，其優選使用缺省參數。另一個可用的序列軟件程序是TFASTA 數據搜索程序，可源自序列軟件包6. 0版(威斯康辛麥迪遜的威斯康辛大學遺傳計算機 組)。同源性可以測定為兩個序列間同一性的程度，表明第一序列從第二序列衍生而 來。同源性適宜利用本領域已知的計算機程序測定，例如GCG程序包中提供的GAP (如上所 述)。因此，可以以缺省計分矩陣鑒定和下列缺省參數使用GAP GCG v8:缺口建立罰分5.0 和缺口延伸罰分0. 3，分別用于核酸序列比較；缺口建立罰分3. 0和缺口延伸罰分0. 1分別 用于蛋白質序列比較。GAP 使用 Needleman 和 Wunsch，(1970)，J. Mol. Biol. 48 443-453 中 描述的方法進行比對和計算同一性。AmyTS23 (SEQ ID NO :1)和例如另一種α -淀粉酶之間的結構性比對可以用于鑒 定在其它α-淀粉酶(該(1-淀粉酶與411^1323具有高度同源性，例如大約80%、81%、 82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%, 97%、98%或甚至99%)中的等同/對應位點。得到這種結構性比對的一種方法是利用來 自GCG程序包的Pile Up程序，使用缺口罰分的缺省值，S卩，缺口建立罰分3.0和缺口延伸 罰分0. 1。其它結構性比對的方法包括疏水簇分析(Gaboriaud等人，FEBS Letters. 224 第 149-155 頁，1987)和反向線索(Huber, T.和 Torda，Α. Ε.，Protein Science. 7(1)第 142-149 頁(1998))。1. 6 雜交用于表征上述AmyTS23的寡核苷酸探針可適當地基于所研究α -淀粉酶的全長或 部分核苷酸或氨基酸序列而制備。檢測雜交的適宜條件包括在5X SSC中預浸潤并在40°C的如下溶液中預雜交1小 時20%甲酰胺溶液，5 X Denhardt' s溶液，50mM磷酸鈉，pH6. 8和50mg變性超聲處理過的 小牛胸腺DNA。然后在補充了 IOOmMATP的相同溶液中在40°C下雜交18小時。然后用如下 條件洗滌該濾膜(filter)三次2XSSC，0.2% SDS，40°C，洗滌30分鐘(低嚴緊條件)；優 選在50°C下洗滌(中嚴緊條件)；更優選在65°C下洗滌(高嚴緊條件)；進一步優選在75°C下洗滌(非常高嚴緊條件)。關于雜交方法的更多細節可參見=Sambrook等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual，第二片反，Cold Spring Harbor，1989。在本文中，“源自，，不僅僅指α -淀粉酶產自或可產自所討論的生物的菌株，還指 α -淀粉酶編碼自該菌株分離的DNA序列，以及由用該DNA序列轉化的宿主生物生產。最 后，該術語意欲指這樣的α ”淀粉酶，該α ”淀粉酶被合成的和/或cDNA來源的DNA序列 編碼，而且具有與所討論的α-淀粉酶一致的性質。該術語還意欲指親本α-淀粉酶可以 是天然產生的α-淀粉酶的變體，g卩，變體，其是天然產生的α-淀粉酶的一個或多個氨基 酸殘基修飾(插入、取代、缺失)的結果。本領域技術人員能夠了解，本發明的組合物和方法所涵蓋的序列還通過在嚴緊 雜交條件下與示例性的amyTS23序列(例如圖4所示SEQ ID NO 4)雜交的能力來限 定。當核酸的單鏈形式能夠與另一條核酸在適宜的溫度和溶液離子強度條件下復性時， 該核酸為能夠與另一條核酸序列雜交。雜交和洗滌條件為本領域所公知(參見例如上述 Sa mbrook (1989)，特別是第9和11章)。在一些實施方式中，嚴緊條件對應于Tm為65°C和 0. 1XSSC,0. 1% SDS。1. 7親本α -淀粉酶如上所述，根據本發明，任何AmyTS23a-淀粉酶可以用作親本(即背景)α-淀粉 酶。在優選的實施方式中，親本α-淀粉酶源自桿菌物種TS-23菌株，例如上面涉及到的之 一，例如具有SEQ ID NO :1 (見圖1)中所示氨基酸序列的TS-23 α -淀粉酶。1. 8改變的性質下面的部分說明了存在于本發明所述變體淀粉酶中的突變體之間的關系，和可能 由其產生的理想的性質方面的改變(與親本TS-23 α -淀粉酶相比)。在整個說明書中詳細 說明了本發明的組合物和方法所涵蓋的變體，在下面幾段中僅僅進行概括。如上所述，本發明的組合物和方法一方面涉及源自或可源自桿菌物種TS-23的 α-淀粉酶的α-淀粉酶，包括相對于親本淀粉酶具有改變的性質的變體/突變體。親本淀 粉酶是上述親本TS-23 α -淀粉酶和包括TS-23 α -淀粉酶的至少一部分(例如成熟多肽的 氨基酸序列)的雜交或嵌合的淀粉酶。當桿菌物種TS-23ci-淀粉酶(SEQ ID NO :1)用作討論變體淀粉酶的起點時， 應理解其他與桿菌物種TS-23 α -淀粉酶具有高度同源性的桿菌物種α -淀粉酶可以作 為親本淀粉酶，而不會背離本發明的組合物和方法的范圍。特別是對于其他與桿菌物種 TS-23 α -淀粉酶僅有少許不同而且不包括本發明主題的取代、缺失或插入的天然產生的桿 菌物種α-淀粉酶，更是如此。在本發明的組合物和方法的第一方面，提供了親本桿菌物種菌株α -淀粉酶的變 體，其中該變體包括下列改變中的至少兩個(a) C末端平截；(b) 201位氨基酸的取代(即M201)，以SEQ ID NO=I對氨基酸計數；或(c)選自由R180，S181，T182和G183組成的組中的至少兩個殘基的缺失。應注意， 氨基酸殘基的標號參考SEQ ID NO :1。在一些實施方式中，這種改變包括(a)和(b)。在其 他實施方式中，改變包括(a)和(C)。在一些實施方式中，變體可進一步包括在選自由殘基 87、殘基225、殘基272和殘基282組成的組中的一個或多個殘基處的取代。變體淀粉酶優選具有α-淀粉酶活性。除了特別指出的改變，變體淀粉酶的其他剩下的氨基酸序列可具 有與SEQ ID NO 1的氨基酸序列至少85%的氨基酸序列同一性。在相關的方面，提供了親本AmyTS23 α -淀粉酶的變體，其中該變體具有與親本 α-淀粉酶至少85%同一性的氨基酸序列，并包含C末端的平截。該變體可具有SEQ ID NO 2的序列。該變體與親本淀粉酶相比可具有提高的在冷水中對淀粉污漬的清潔能力。在一些實施方式中，包含C末端平截的變體可進一步包括R180和S181位點(參 見SEQ ID NO 1的氨基酸序列)殘基的缺失。得到的變體可具有比親本淀粉酶高的洗滌劑 穩定性。在一些實施方式中，包含C末端平截的變體可進一步包括位點201處殘基的取代 (還是參見SEQ ID N0:1的氨基酸序列)。得到的變體可具有比親本淀粉酶高的氧化穩定 性。 在一些實施方式中，任何上述變體可進一步包括在選自由殘基87、殘基225、殘基 272、和殘基282組成的組中的一個或多個殘基處的取代。1.8. 1 穩定性在本文所述變體的上下文中，對于得到改變的穩定性(即較高或較低)重要的突 變(包括氨基酸取代和缺失)包括列于“改變的性質”部分的任何突變，該改變的穩定性特 別是提高的穩定性，在特定的高溫下(即70-120°C)和/或極端pH(即低或高pH值，即分 別PH4-6或pH8-ll)，特別是低于60ppm的游離(即未結合的，所以在溶液中的)鈣濃度。 穩定性可以如下面的“方法”部分所述測定。1.8. 2Ca2+穩定性改變的Ca2+穩定性是指酶在Ca2+減少的條件下的穩定性得到了提高，即，較高或較 低的穩定性。當前描述的變體的背景下，對于得到改變的Ca2+穩定性重要的突變(包括氨 基酸取代和缺失)包括列于“改變的性質”部分的任何突變，該改變的Ca2+穩定性特別是提 高的Ca2+穩定性，在特定的高pH(即pH8-10. 5)下較高或較低的穩定性。1. 8. 3 比活性在進一步的方面，對于得到呈現比活性改變的變體的重要的突變(包括氨基酸取 代和缺失)包括列于“改變的性質”部分的任何突變，該改變的比活性是指，特別是升高或 降低的比活性，特別是10-60°C，優選20-50°C，特別是30-40°C下的比活性。比活性可以如 下面的“方法”部分所述測定。1.8.4氧化穩定性與親本α -淀粉酶相比，所述變體也可以具有改變的氧化穩定性，特別是更高的 氧化穩定性。例如，在洗滌劑組合物中增加的氧化穩定性是有利的，而在用于淀粉液化的組 合物中降低的氧化穩定性是有利的。氧化穩定性可以如下面的“方法”部分所述測定。改變的ρΗ譜關于具有ρΗ譜改變的得到的變體的重要位置和突變包括位于活性位點殘基附近 的氨基酸殘基的突變，該改變的PH譜是指，特別是在特別高的ρΗ(即ρΗ8-10. 5)或低ρΗ(即 ΡΗ4-6)下的改善的活性。優選的具體突變/取代是列于上面“改變的性質”部分中對于討論的位置的突變 /取代。適宜的檢測在下面的“方法”部分說明。
1. 8. 6洗滌性能 對于在特別高pH(即pH8. 5-11)具有洗滌性能改善的得到的變體的重要位置和突 變包括列于上面“改變的性質”部分中對于討論的位置的具體突變/取代。洗滌性能可以 如下面的“方法”部分所述測定。2.制備α-淀粉酶變體的方法因此，本發明一方面提供了產生重組形式的桿菌物種TS-23菌株α-淀粉酶序列， 其包括其他以前確定的氨基酸取代、缺失、顛換、插入及其組合，以生產桿菌物種TS-23菌 株α-淀粉酶的變體。這些變體可具有附加的產量增加、升高的ρΗ穩定性、升高的溫度穩 定性、降低對Ca2+的需求、增加的比活性、增加的餐具洗滌或洗滌性能、增加的溶解度、增加 的儲存穩定性或其組合。重組產生變體的方法可以用提供的序列和載體執行，或者用其他 本領域已知的方式進行。本領域已知幾種向基因中引入突變的方法。在簡單討論α -淀粉酶編碼DNA序列 的克隆之后，將討論在α "淀粉酶編碼序列內部的特異性位點產生突變的方法。2. 1編碼α -淀粉酶的DNA序列的克隆編碼親本α -淀粉酶的DNA序列可從任何產生該α -淀粉酶的細胞或微生物中以 本領域已知的各種方法分離。首先，應該用產生要研究的α -淀粉酶的生物的染色體DNA或 信使RNA構建基因組DNA和/或cDNA庫。然后，如果已知該α -淀粉酶的氨基酸序列，可 以合成同源、標記的寡核苷酸探針，用于從所討論生物制備的基因組庫中鑒定編碼α-淀 粉酶的克隆。或者，含有與已知α-淀粉酶基因同源的序列的標記寡核苷酸探針可用作用 雜交和低嚴緊條件下洗滌的方法鑒定編碼α"淀粉酶克隆的探針。鑒定編碼α _淀粉酶的克隆的另一種方法涉及將基因組DNA的片段插入到表達載 體中，例如質粒中，用得到的基因組DNA庫轉化α-淀粉酶陰性的細菌，將轉化的細菌平板 接種于含α-淀粉酶底物的瓊脂上，從而鑒定表達α-淀粉酶的克隆。或者，編碼該酶的DNA序列可以用已建立的標準方法合成制備，例如 S. L. Beaucage 和 Μ. H. Caruthers, (1981)描述的亞磷酰胺方法，或 Matthes 等人(1984)記 載的方法。在亞磷酰胺方法中，例如在自動DNA合成儀上合成寡核苷酸，純化、退火、連接并 克隆到適當的載體中。最后，DNA序列可以是混合了基因組來源和合成來源的，混合了合成來源的和 cDNA來源的，或者混合了基因組來源和cDNA來源的，并通過以標準技術連接合成的、基因 組的或cDNA來源的(如適用，則為對應于整個DNA序列的各個部分的片段)片段制備。 DNA序列也可利用特定的引物通過聚合酶鏈式反應(PCR)制備，例如美國專利4，683，202或 R. K. Saiki 等人(1988)中所述。2. 2定點誘變—旦分離了編碼α-淀粉酶的DNA序列，確定了所需突變的位點，可以用合成的 寡核苷酸引入突變。這些寡核苷酸含有側翼于所需突變位點的核苷酸序列；突變核苷酸在 寡核苷酸合成過程中插入。在一個特定方法中，在帶有α-淀粉酶基因的載體中形成橋接 α -淀粉酶編碼序列的單鏈DNA缺口。然后帶有所需突變的合成核苷酸退火到該單鏈DNA 的同源部位。然后用DNA聚合酶I (Klenow片段)將剩余的缺口補齊，用Τ4連接酶連接該構 建體。這種方法的具體例子描述于Morinaga等人(1984)中。美國專利4，760，025公開了通過進行表達框的微小改變而引入編碼多個突變的寡核苷酸的方法。但是，用Morinaga方 法可以在任何一段時間引入更大量的突變，因為可以引入具有各種長度的多個寡核苷酸。向編碼α -淀粉酶的DNA序列引入突變的另一個方法記載于Nelson和 Long(1989)中。其涉及含有需引入的突變的PCR片段的三步生成法，該突變用化學合成的 DNA鏈作為PCR反應的一個引物來引入突變。從該PCR產生的片段，帶有突變的DNA片段可 以用限制性內切酶裂解來分離，然后再插入到表達質粒中。提供變體的其他方法包括基因移動(gene shuffling)，例如，如 W095/22625 (Affymax Technologies N. V.)或WO 96/00343 (Novo Nordisk A/S)所述，或者 其他相關的得到包含所討論突變例如取代和/或缺失的雜交酶的技術。2.3α-淀粉酶變體的表達
用上述方法或本領域已知的其他方法產生的編碼α -淀粉酶變體的DNA序列，可 以用來用表達載體表達變體淀粉酶(即酶)，這些表達載體通常包括編碼啟動子、操縱子、 核糖體結合位點、翻譯起始信號的調控序列和可選的阻遏基因或各種激活子基因。帶有編碼α -淀粉酶變體的DNA序列的重組表達載體可以是任何載體，其可以方 便地進行重組DNA過程，載體的選擇經常取決于其要引入的宿主細胞。所以，載體可以是自 主復制的載體，即作為染色體外實體存在的載體，其復制獨立手染色體的復制，例如質粒、 噬菌體或染色體外元件、微染色體或人工染色體。或者，該載體可以是當引入宿主細胞時整 合到宿主細胞基因組中，并與其整合入的染色體一起復制的載體。在載體中，DNA序列應有效連接于適當的啟動子序列。啟動子可以是在選擇的 宿主細胞中表現出轉錄活性的任何DNA序列，可源自編碼與宿主細胞同源或異源的蛋白 質的基因。用于指導編碼本發明組合物和方法的α-淀粉酶變體的DNA序列轉錄(特別 是在細菌宿主中)的適宜啟動子的實例有大腸桿菌Iac操縱子的啟動子、天藍色鏈霉 菌(Str印tomyces coelicolor)瓊脂糖酶基因dagA啟動子、地衣芽孢桿菌α -淀粉酶基 因(amyL)的啟動子、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophilus)產麥芽糖 淀粉酶基因(amyM)的啟動子、解淀粉芽孢桿菌α -淀粉酶(amyQ)的啟動子、和枯草芽孢 桿菌xylA和xylB基因的啟動子等。對于真菌宿主中的轉錄，有用的啟動子的實例是源 自編碼米曲霉(A.oryZae)TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白 水解酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α -淀粉酶、黑曲霉酸穩定性α-淀粉酶、黑曲 霉葡糖淀粉酶、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖異構酶或構巢曲霉 (A. nidulans)乙酰胺酶的基因的啟動子。表達載體也可包括與編碼本發明組合物和方法的α -淀粉酶變體的DNA序列有效 連接的適宜轉錄終止子以及，在真核生物中，多腺苷酸化序列。終止序列和多腺苷酸化序列 可適宜地源自與啟動子相同的來源。載體還可包括允許載體在所討論的宿主細胞中復制的DNA序列。該序列的實例是 質粒 pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMBl 和 pIJ702 的復制起點。載體也可包括選擇標記，例如其產物能在宿主細胞中彌補缺陷的基因，例如來自 枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或者賦予抗生素抗性(例如氨芐青霉素、卡那霉 素、氯霉素或四環素抗性)的基因。此外，載體可包括曲霉屬(Aspergillus)選擇標記，例 如amdS、argB, niaD和sC (產生潮霉素抗性的標記)，或者可通過共轉化實現選擇，參見例如，WO 91/17243。 雖然細胞內表達在一些方面可能是有益的，例如當使用某些細菌作為宿主細胞 時，但是一般優選細胞外表達。一般，這里提到的桿菌屬α-淀粉酶包括允許表達的蛋白酶 分泌到培養基中的前區(preregion)。如果需要，可由不同的前區或信號序列代替該前區， 其可以通過編碼各自前區的DNA序列的取代而方便地實現。使用的分別連接編碼α -淀粉酶變體的DNA構建體、啟動子、終止子和其它元件 的操作，和用于將它們插入含有復制必需信息的合適載體的操作是本技術領域眾所周知 的(見，例如，Sambrook 等人，MOLECULAR CLONING :A LABORATORY MANUAL，第 2 版.，Cold Spring Harbor,1989)。有益地，將包括DNA構建體或表達載體的細胞用作重組生產α -淀粉酶變體的宿 主細胞。可用編碼該變體的本發明組合物和方法的DNA構建體，通過將該DNA構建體(以 一個或多個拷貝)整合到宿主染色體中而方便地轉化細胞。通常認為這一整合是有利的， 因為DNA序列更有可能穩定地保持在細胞中。可根據常規方法，例如通過同源或異源重組 實現DNA構建體向宿主染色體的整合。或者，可以用與不同類型的宿主細胞相關的上述表 達載體轉化細胞。細胞可以是高等生物的細胞，例如哺乳動物或昆蟲的細胞，但是優選微生 物細胞，例如細菌或真菌(包括酵母菌)細胞。適宜細菌的實例為革蘭氏陽性菌，例如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽 孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Geobaci 1 Ius stearothermophilus)、嗜堿芽 孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、凝固芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌 (Bacillus megaterium)、蘇云金芽孢桿菌、淺青紫鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌；或革蘭氏陰性細 菌，例如大腸桿菌。細菌的轉化可以用例如原生質體轉化進行，或用感受態細胞以已知的方 式進行。適宜的酵母生物可以選自酵母屬物種(Saccharomyce)或裂殖酵母屬 (Schizosaccharomyce)物種，例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。絲狀真菌 可有利地屬于曲霉屬(Aspergillus)物種，例如米曲霉(Aspergillusoryzae)或黑曲霉 (Aspergillus niger)。真菌細胞可以用包括原生質體形成和原生質體轉化的方法進行轉 化，原生質體轉化后以已知的方式進行細胞壁的再生。曲霉宿主細胞的轉化的適宜方法記 載于EP 238 023中。在又一個方面中，提供了產生α-淀粉酶變體的方法，該方法包括在有利于變體 生產的條件下培養上述宿主細胞，并從該細胞和/或培養基中回收變體。用于培養細胞的培養基可以是任何適于生長所討論宿主細胞和獲得α -淀粉酶 變體表達的常規培養基。適宜的培養基可獲自商品供應商或可根據公開的制劑(例如按美 國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection(ATCC))的目錄所述)制備。可通過公知的方法從培養基中方便地回收分泌自宿主細胞的α-淀粉酶變體，包 括通過離心或過濾從培養基中分離細胞，通過諸如硫酸銨的鹽沉淀培養基中的蛋白質組 分，隨后使用諸如離子交換層析、親和層析等的層析方法。3.工業應用本發明的α-淀粉酶變體具有可用于多種工業應用的有價值的性質。特別是，該 酶變體可用作洗滌、餐具洗滌和硬表面清潔洗滌劑組合物的成分。
具有改變的性質的一個或多個變體可以用于淀粉加工，特別是淀粉轉化，尤其 是淀粉的液化(參見，例如美國專利3，912，590、歐洲專利申請252730和63 909，WO 99/19467和WO 96/28567，此處所有的參考文獻均通過合并入本文作為參考)。還涉及淀粉 轉化目的的組合物，其除了本發明組合物和方法的變體，還包括葡糖淀粉酶、支鏈淀粉酶和 其他α-淀粉酶。另外，一種或多種變體還可以用于甜味劑和乙醇的生產中(參見例如通過合并入 本文作為參考的美國專利5，231，017)，例如從淀粉或整個谷物生產燃料乙醇、飲用乙醇和 工業乙醇。本發明的變體還可以用于紡織品、織物和衣物的退漿(參見例如通過合并入本文 作為參考的WO 95/21247、美國專利4，643，736和EP 119,920)；發酵醪生產或釀造；以及 紙漿和紙的生產。3. 1淀粉轉化常規的淀粉轉化過程，例如液化和糖化過程記載于通過合并入本文作為參考的例 如美國專利3，912，590和歐洲專利公開252，730和63，909。在一個實施方式中，降解淀粉為較低分子量的碳水化合物成分(如糖或脂肪取代 物)的淀粉轉化過程包括脫支化步驟。3. 2淀粉向糖的轉化在淀粉向糖的轉化的情況下，解聚淀粉。這種解聚過程可由預處理步驟和兩個或 三個連續步驟組成，例如液化步驟、糖化步驟，和取決于目的終點產物的可選的異構化過程。3. 3天然淀粉的預處理天然淀粉由微觀顆粒組成，其在室溫下不溶于水。當加熱水性淀粉料漿時，顆粒溶 脹并最終破裂，向溶液中釋放淀粉分子。在此“糊化”過程中，粘度會急劇升高。由于在通 常的工業過程中，固體水平是30-40%，因此淀粉不得不薄化或“液化”以使其能夠操作。目 前這種粘度的降低大部分通過酶促降解來得到。3. 4 液化在液化步驟中，長鏈淀粉被α -淀粉酶降解成支鏈和直鏈的較短單位(麥芽糊 精)。液化過程通常在105-110°C進行5-10分鐘，然后在95°C，pH值在5. 5-6. 2之間進行 1-2小時。為了在這些條件下保證最優的酶穩定性，加入ImM鈣(40ppm游離鈣離子)。該 處理以后，液化的淀粉會具有10-15的“葡萄糖當量”(DE)。3. 5 糖化液化步驟后，通過添加葡糖淀粉酶(例如OPTIDEX L-400)和脫支酶(如異淀粉 酶(U. S. Pat. No. 4，335，208)或支鏈淀粉酶，將麥芽糊精轉換為葡萄糖。在此步驟之前，將 PH降至低于4. 5的值，維持高溫(高于95°C )以使液化α _淀粉酶失活，以降低稱作“潘糖 前體”的短鏈寡糖的形成，這種短鏈寡糖不能被分支酶正確水解。使溫度降至60°C，可以加入葡糖淀粉酶和脫支酶。糖化步驟通常進行24-72小時。通常，當液化步驟后變性α -淀粉酶時，大約0. 2-0. 5 %的糖化產物是分支的三 糖，Glc pa l-6Glc ρ α l_4Glc (潘糖)，其不能被支鏈淀粉酶降解。如果來自液化步驟的活 性淀粉酶在糖化步驟中存在，即沒有變性，這種糖的水平可高至1_2%，這是非常不想要的結果，因為這會大大降低糖化作用的產率。3. 6異構化當所需的最終糖產品是例如高果糖糖漿時，葡萄糖糖漿可以轉化為果糖。糖化過 程之后，PH升高到6-8范圍內，優選pH7. 5，通過離子交換除去鈣。葡萄糖糖漿然后用例如 固定化的葡萄糖異構酶(例如GENSWEET IGI-HF)轉化為高果糖糖漿。3. 7乙醇生產
通常從全谷物生產乙醇可分為如下四個主要步驟研磨；液化；糖化和發酵。3. 7.1 研磨碾磨谷粒打開其結構，從而允許進一步加工。可以使用的兩種碾磨方法是濕磨法 或干磨法。在干磨法中，碾磨整個核和在該方法的剩下部分中使用。濕磨法提供胚芽和粉 (淀粉顆粒和蛋白質)的良好分離，并且，除少數例外外，在平行進行糖漿生產時使用這種 方法。3. 7. 2 液化在該液化過程中，通過水解將淀粉顆粒溶解為大部分具有高于4的DP的麥芽糊 精。水解可以通過酸處理或用α-淀粉酶酶處理進行。酸水解用于有限的基質上。原料可 以是研磨的整粒谷物或淀粉加工的側流(副產物)。酶促液化通常作為三步熱料漿過程進行。料漿加熱到60_95°C，優選80_85°C，力口 入酶。然后在95-140°C，優選105-125°C噴射蒸煮該料漿，冷卻至60_95°C，加入更多的酶， 得到最終水解。液化過程在PH4. 5-6. 5下進行，通常在5和6之間的pH下進行。研磨的和 液化的谷物也稱作醪液。3. 7. 3 糖化為了生產可以被酵母菌代謝的低分子糖DP"，液化中產生的麥芽糊精必須進一步 水解。通常，水解通過酶促進行，通過葡糖淀粉酶，也可使用備選的α-糖苷酶或酸性α-淀 粉酶。完全糖化步驟可以持續至多72小時，但是，通常僅僅進行一般40-90分鐘的預糖化， 然后在發酵中完全糖化(SSF)。通常在30-65°C進行糖化，一般為60°C左右，pH4. 5。3. 7. 4 發酵通常將來自酵母菌屬物種的酵母菌加入到醪液中，發酵24-96小時，例如通常 35-60小時。溫度在26-34°C之間，通常約32°C，pH為pH3_6，優選約pH4_5。注意到，廣泛應用的方法是同時糖化和發酵(SSF)的方法，其中沒有糖化的保持 期，意味著酵母菌和酶一起加入。當進行SSF時，通常就在發酵之前在高于50°C的溫度下引 入預糖化步驟。3. 8 蒸餾發酵之后，蒸餾醪液以提取乙醇。根據該方法得到的乙醇可用作例如燃料乙醇；飲 用乙醇，即可飲用中性酒精飲料；或工業乙醇。3. 9副產物發酵剩下的谷物通常以液體或干燥形式用作動物飼料。如何進行液化、糖化、發酵、蒸餾和乙醇回收的進一步的細節為本領域技術人員所 公知。根據本文所述的方法，糖化和發酵可以同時或分開進行。
3. 10紙漿和紙生產本發明的α -淀粉酶也可用于從淀粉強化的廢紙和卡紙板生產木質纖維素材料， 例如紙漿、紙和卡紙板，特別是當在7以上的ρΗ下進行再次制漿時，淀粉酶通過該強化淀粉 的降解促進了廢料的崩解。α -淀粉酶特別用于從淀粉涂層的印刷紙制備造紙紙漿的方法。 該方法可以如W095/14807所述進行，包括下列步驟a)分解紙，生產紙漿；b)在a)步驟之前、過程中或之后用淀粉降解酶處理；和C)在a)和b)步驟之后從紙漿中分離墨水顆粒。
本文所述的α -淀粉酶也可用于改性淀粉，酶促改性的淀粉與堿性填料如碳酸 鈣、高嶺土和粘土用于造紙中。用本發明組合物和方法的α-淀粉酶，有可能在填料存在下 改性淀粉，從而可以得到更簡單的整合方法。3. 11紡織品、織物和衣物的退漿本發明的α-淀粉酶也可以用于紡織品、織物或衣物的退漿。在紡織品加工工業 中，α “淀粉酶通常用作退漿過程中的輔劑，以促進含淀粉漿料的去除，該漿料在紡織過程 中作為紗線上的保護性涂層起作用。紡織以后的漿料涂層的完全去除對于保證后續過程的 最優結果非常重要，后續過程中織物被洗滌、漂白和染色。優選酶促淀粉分解，因為這不會 對織物材料造成任何有害效果。為了減少加工成本和增加研磨處理量，退漿過程有時候與 洗滌和漂白步驟聯合進行。在這種情況下，非酶促助劑，如堿或氧化劑通常用來分解淀粉， 因為經典的α-淀粉酶非常不適用于高ρΗ值和漂白劑。淀粉漿料的非酶促分解會導致一 些纖維破壞，因為使用了更加具有攻擊性的化學品。所以，使用本發明的組合物和方法的 α -淀粉酶變體將是理想的，因為它們在堿溶液中具有改善的性能。α -淀粉酶可以單獨使 用，或當退漿含纖維素的織物或紡織品時與纖維素酶聯合使用。退漿和漂白過程為本領域所公知。例如，該過程記載于WO 95/21247，U.S.Pat. No. 4，643，736和EP 119，920中，其通過合并入本文作為參考。用于退漿的市售產品包括 Genencor 的 OPTISIZE FLEX。本發明還涉及使用一種或多種桿菌物種TS-23菌株α -淀粉酶或其變體處理織物 (例如紡織品退漿)的組合物和方法。本領域公知，該酶可用于任何織物處理方法中，參見 例如美國專利6，077，316。例如，一方面，用包括將織物與桿菌物種TS-23菌株α -淀粉酶 或其變體溶液接觸的方法改善織物的手感和外觀。一方面，在壓力下用該溶液處理織物。一方面，在紡織品紡織過程中或之后，或在退漿階段，或一個或多個另外的織物加 工步驟中使用該酶。在紡織品紡織期間，紡線暴露于相當大的機械張力。在機械織機上紡 織之前，經紗通常涂上淀粉或淀粉衍生物漿料，以增加其抗張強度并防止斷裂。可以施加這 些酶以除去這些淀粉或淀粉衍生物漿料。在紡織品織成之后，織物可以進入退漿階段。這 之后可接著一個或多個其他織物加工步驟。退漿是從紡織品中除去漿料的行為。紡織后必 須除去漿料涂層，之后再進一步加工織物，以確保均一和耐洗效果。本文還提供了包括通過 桿菌物種TS-23菌株α -淀粉酶或其變體的作用來酶促水解上述漿料的退漿方法。該酶可以單獨或與其他退漿化學試劑和/或退漿酶一起用作為洗滌劑添加劑，在 例如水性組合物中，使織物(包括含棉織物)退漿。桿菌物種TS-23菌株α-淀粉酶或其 變體也可用于在靛藍染色的粗斜棉布織物和衣服上產生石洗外觀的組合物和方法中。為生產衣服，織物可以剪裁并縫紉成衣服或衣物，之后進行整理。特別是，為生產粗斜棉布牛仔 服(denim jeans)，已研發了不同的酶促整理方法。粗斜棉布衣服的整理通常始于酶促退漿 步驟，在此期間淀粉分解酶作用于衣服，以使織物柔軟，并使該棉布更易于接受隨后的酶促 整理步驟。該酶可用于整理粗斜棉布衣服(例如“生物打磨法”(bio-stoning))、酶促退漿 及為織物提供柔軟度，和/或整理的方法中。淀粉酶的劑量隨著方法類型而改變。較小劑 量與較大劑量的同樣酶相比，會需要更多的時間。然而，退漿淀粉酶存在的量沒有上限，除 了受溶液的物理約束控制。因此，酶的限度可以是能夠溶解于溶液中的量。通常，退漿酶， 例如α _淀粉酶，以織物的重量計，以約0. 00001%至約2%酶蛋白、約0. 0001%至約酶 蛋白、約0. 001%至約0. 5%酶蛋白的量加入到處理組合物中，在另一個實施例中，以織物 的重量計，可以是約0. 01 %至約0. 2 %酶蛋白的量。3. 12發酵醪的生產此處提供的變體α -淀粉酶也可用于發酵醪生產過程中；α _淀粉酶通常在 淀粉 糖化過程中加入。3. 13洗滌劑組合物本文所述的α -淀粉酶變體可以加入并由此成為洗滌劑組合物的成分。例如，可以將此處提供的洗滌劑組合物配制成手洗或機洗的衣物洗滌劑組合物， 包括適于預處理污染的織物的衣物添加劑組合物和漂洗添加的織物柔軟劑組合物，或者配 制成用于一般的家居硬表面清潔操作的洗滌劑組合物，或者配制以用于手洗或機洗的餐具 洗滌操作。在一個具體的方面，提供了包括本文所述變體酶的洗滌劑添加劑。該洗滌劑添加 劑和洗滌劑組合物可包含一種或多種其它酶，例如蛋白酶、脂肪酶、過氧化物酶、另一種淀 粉分解的酶(例如另一種α "淀粉酶)、葡糖淀粉酶、產麥芽糖淀粉酶、CGT酶和/或纖維素 酶、甘露聚糖酶(如購自 Danisco U. S. A. Inc.，Genencor Division 的 MANNASTAR )、果膠 酶、膠質裂合酶、角質酶和/或漆酶。通常，所選酶的特性應與選擇的洗滌劑兼容(即最適pH、與其他酶和非酶成分的 兼容性等)，且所述酶應以有效量存在。蛋白酶適宜的蛋白酶包括動物、植物或微生物來源的那些。優選微生物來源。包 括經化學修飾或蛋白質工程改造的突變體。蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶，優 選堿性的微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣的蛋白酶或糜蛋白酶樣的蛋白酶。堿性蛋白酶的實 例是枯草桿菌蛋白酶，特別是來源于桿菌屬的枯草桿菌蛋白酶，例如枯草桿菌蛋白酶Novo、 枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白酶 168(記載于例如WO 89/06279)。胰蛋白酶樣蛋白酶的例子是胰蛋白酶(例如豬或牛來源 的)，和記載于WO 89/06270和WO 94/25583中的鐮孢菌屬蛋白酶。有用的蛋白酶的實例還包括但不限于W098/23732、W099/20770、WO 92/19729、WO 98/20115、W0 98/20116和WO 98/34946中記載的變體，特別是具有下列位點中一個或多個 取代的變體:27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235 和 274。示例性可商購的蛋白酶包括ALCALASE 、SAVINASE 、PRIMASE 、 DURALASE 、ESPERASE ⑧和 KANNASE (購自 Novozymes A/S)、MAXATASE (S)、MAXACAL、MAXAPEM 、PROPERASE 、PURAFECT 、PURAFECT OXP 、FN2 、FN3 和 FN4 (Genencor)0 脂肪酶適宜的脂肪酶包括細菌或真菌來源的那些。包括經化學修飾或蛋白質 工程改造的突變體。有用的脂肪酶的實例包括但不限于來自腐質霉屬(Humicola)(與嗜 熱絲孢菌屬(Thermomyces)同義)的脂肪酶，例如來自疏毛腐質霉(H. lanuginosa)(疏 棉狀嗜熱絲孢菌(T. Ianuginosus))(參見EP258068和EP 305216)或來自特異腐質霉 (H. insolens)(如WO 96/13580所述)；假單胞菌屬(Pseudomonas)脂肪酶(例如來自產 堿假單胞菌(P. alcaligenes)或類產堿假單胞菌(P. pseudoalcaligenes) (EP 218 272)， 洋蔥假單胞菌(P. cepacia) (EP 331 376)、斯氏假單胞菌(P. stutzeri) (GB 1，372，034)、 熒光假單胞菌(P. f luorescens)、假單胞菌屬菌株 SD 705 (WO 95/06720 和 WO 96/27002)、 P. wisconsinensis (W0 96/12012)的脂肪酶；芽孢桿菌屬脂肪酶(例如來自枯草芽孢 桿菌(Dartois 等人，(1993)，Biochemica et Biophysica Acta，1131 :253_360)，嗜熱 月旨肪芽孢桿菌(B. stearothermophilus) (JP 64/744992)或短小芽孢桿菌(B. pumilus) (W091/16422)的脂肪酶。其他可以考慮在制劑中使用的脂肪酶變體示例包括例如在 WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407 225、EP 260 105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079 和 WO 97/07202 中描述 的那些。一些市售可得的脂肪酶包括 LIP0LASE 和 LIP0LASE ULTRA (Novozymes, A/S)聚酯酶適宜的聚酯酶可以包含在該組合物中。適宜的聚酯酶包括例如WO 01/34899和WO 01/14629中記載的那些。淀粉酶也可包括一種或多種其它淀粉酶(除此處所述的淀粉酶變體之外)。適 宜的淀粉酶(α和/或β)包括那些細菌或真菌來源的淀粉酶。包括經化學修飾或蛋白質 工程改造的突變體。淀粉酶包括，例如，來自芽孢桿菌的α-淀粉酶，例如GB 1，296，839中 更具體描述的地衣芽孢桿菌的特定菌株。有用的α-淀粉酶的實例是在WO 94/18314、WO 96/39528、W094/02597、WO 94/18314、WO 96/23873 和 WO 97/43424 中描述的變體，特別是 在下列位點中的一個或多個上有取代的變體15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、 188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408 和 444。市售可得的α -淀粉酶是 DURAMYL 、LIQUEZYME TERMAMYL , NATALASE 、 STAINZYME PLUS、STAINZYME ULTRA、FUNGAMYL 和 BAN (Novozymes A/S)、RAPIDASE 禾口 PURASTAR (購自 Genencor)。纖維素酶可以向組合物中加入纖維素酶。適宜的纖維素酶包括細菌或真菌來 源的那些。包括經化學修飾或蛋白質工程改造的突變體。適宜的纖維素酶包括但不限于 來自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、木霉屬、腐質霉屬、鐮孢霉屬、梭孢殼屬(Thielavia)、枝頂 孢屬(Acremonium)的纖維素酶，例如如美國專利 No. 4，435，307 ；5，648，263 ；5, 691, 178 ； 5，776，757和W089/09259公開的自特異腐質霉(Humicola insolens)、嗜熱毀絲霉 (Myceliophthora thermophila)禾口尖鍵抱(Fusarium oxysporum)產生的真菌纖維素醇。 里氏木霉纖維素酶的實例公開于美國專利4，689，297,5, 814，501和5，324，649，以及WO 92/06221和WO 92/06165中。示例性芽孢桿菌屬纖維素酶公開于美國專利6，562，612中。市售可得的纖維素酶包括CELLUZYME (R)和 CAREZYME (Novozymes A/S)，CLAZINASE 和 PURADAX HA (R) (Genencor International Inc.)和 KAC-500 (B) (Kao Corporation)0過氧化物酶/氧化酶適宜的過氧化物酶/氧化酶包括植物、細菌或真菌來源的 那些。包括經化學修飾或蛋白質工程改造的突變體。有用的過氧化物酶的實例包括描述 于WO 93/24618,WO 95/10602和WO 98/15257中的來自鬼傘屬(Coprinus)(例如灰蓋鬼傘 (C. cinereus))的過氧化物酶及其變體。市售可得的過氧化物酶包括GUARDZYME (Novozymes A/S)。可通過添加含有一種或多種酶的分開的添加劑，或通過添加包括所有這些酶的組 合的添加劑而在洗滌劑組合物中包括洗滌劑酶。可以將本發明的組合物和發明中的洗滌劑 添加劑，即分開的添加劑或組合的添加劑配成例如顆粒、液體、漿液等。優選洗滌劑添加劑 制劑是顆粒型的，特別是無粉塵顆粒；液體，特別是穩定化的液體；或漿液。
可例如按照美國專利No. 4，106，991和4，661，452所公開來生產無粉塵顆粒，并 且可任選地用本領域已知的方法進行包衣。蠟質包衣材料的實例是平均分子量為1，000 至20，000的聚環氧乙烷產物(聚乙二醇，PEG)；具有16-50個環氧乙烷單元的乙氧基化壬 基酚；乙氧基化脂肪醇，其中醇含有12-20個碳原子且其中有15-80個環氧乙烷單元；脂肪 醇；脂肪酸；以及脂肪酸的單酰甘油和二酰甘油及三酰甘油。例如GB 1483591給出了適于 通過流化床技術應用的成膜包衣材料的實例。可例如通過加入多元醇諸如丙二醇、糖或糖 醇、乳酸或硼酸，按照已建立的方法來穩定液態酶制品。可按照如EP 238，216公開的方法 來制備受保護的酶。通常，洗滌劑組合物可以是任何便利的形式，例如棒、片、粉末、顆粒、糊或液體。液 體洗滌劑可以是水性的，通常含有高達約70 %的水，和0 %至約30 %的有機溶劑。濃縮洗滌 劑凝膠含有例如約30%或更少的水。洗滌劑組合物可以包括一種或多種表面活性劑，該表面活性劑可以是非離子型， 包括半極性和/或陰離子型和/或陽離子型和/或兩性離子型。表面活性劑一般按以重量 計0. -60%的水平存在。當包括在洗滌劑中時，洗滌劑通常將含有約至約40%的陰離子表面活性劑， 例如線性烷基苯磺酸鹽、α-烯烴磺酸鹽、烷基硫酸鹽(脂肪醇硫酸鹽)、醇乙氧基硫酸鹽、 仲烷基磺酸鹽、α -磺基脂肪酸甲酯、烷基或烯基琥珀酸或皂。當包括在洗滌劑中時，洗滌劑通常將含有約0.2%至約40%的非離子表面活性 齊U，如醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸 單乙醇酰胺、脂肪酸單乙醇酰胺、多羥基烷基脂肪酸酰胺、或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生 物(“葡糖酰胺”)。洗滌劑可含有0 % -65 %的洗滌劑增效劑或絡合劑(complexing agent)，例如 沸石、二磷酸鹽、三磷酸鹽、磷酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸、二亞 乙基三胺五乙酸、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸鹽或層狀硅酸鹽(例如來自Hoechst的 SKS-6)。洗滌劑可包括一種或多種聚合物。實例有羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二 醇、聚乙烯醇、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)、聚乙烯基咪唑、聚羧酸酯(如聚丙烯酸酯、馬來 酸/丙烯酸共聚物)和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。
洗滌劑可含有漂白系統，這可包括H2O2來源(例如過硼酸鹽或過碳酸鹽)，其可以 與形成過酸的漂白活性劑(如四乙酰基乙二胺或壬酰基氧基苯磺酸鹽)聯用。或者，漂白 系統可包括過氧酸(例如酰胺、酰亞胺或砜類過氧酸)。漂白系統也可以是酶促漂白系統。 參見例如WO 05/056782。可使用常規的穩定劑來穩定本發明組合物和方法中的洗滌劑組合物中的酶，穩定 劑例如多元醇(如丙二醇或甘油)、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物(例如，硼酸芳族 酯)、或苯基硼酸衍生物(例如4-甲酰基苯基硼酸)。可按照WO 92/19709和WO 92/19708 所述配制所述組合物。洗滌劑也可含有其他常規洗滌劑成分，例如織物調理劑，包括粘土、發泡劑、抑泡 劑、防腐蝕劑、污垢懸浮劑、防塵污再沉積劑、染料、殺菌劑、熒光增白劑、水溶增溶劑、晦暗 抑制劑或香料。目前認為在洗滌劑組合物中，尤其是桿菌物種TS-23菌株α -淀粉酶或其變體可 以按相當于每升洗液約0. 01至約IOOmg酶蛋白質(例如每升洗液約0. 05至約5. Omg酶蛋 白質，或每升洗液約0. 1至約1. Omg酶蛋白質)的量加入。本文所記載的變體酶的一種或多種可另外加入到WO 97/07202所公開的洗滌劑 制劑中，WO 97/07202通過引用而合并于此。4.組合物和用途本文所述的一種或多種變體酶也可以用于在洗滌劑(特別是衣物洗滌劑組合物 和餐具洗滌劑組合物)、硬表面清潔組合物中、使用α “淀粉酶的方法中，用于織物、紡織品 或衣物退漿組合物中，用于生產紙漿和紙、發酵醪生產、乙醇生產和如上所述的淀粉轉化過 程中。4. 1衣物洗滌劑組合物和用途根據該實施方式，通常一種或多種桿菌物種TS-23菌株α -淀粉酶或其變體可為 衣物洗滌劑組合物的組分。如此，其可以以無粉塵顆粒、穩定的液體或受保護的酶的形式 包括在洗滌劑組合物中。干燥的制劑可以是顆粒或微顆粒的形式。可以例如，按美國專利 No. 4，106，991和4，661，452所公開的那樣來生產無粉塵顆粒，并且可任選地由本領域已知 的方法進行包衣。蠟質包衣材料的實例是平均摩爾質量為1，000至20，000的聚(環氧乙 烷)產物(聚乙二醇，PEG)；具有16-50個環氧乙烷單元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪 醇，其中醇含有12-20個碳原子，且其中有15-80個環氧乙烷單元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂 肪酸的單酰甘油和二酰甘油及三酰甘油。例如英國專利1483591給出了適于通過流化床 技術應用的成膜包衣材料的實例。可例如通過加入多元醇諸如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或 硼酸，按照已建立的方法來穩定液態酶制品。其他酶穩定劑是本領域公知的。可按照例如 歐洲申請No. 238，216公開的方法來制備受保護的酶。長期以來多元醇被公認為蛋白質的 穩定劑，和用于提高蛋白質的溶解性。參見，例如J. K. Kaushik等人，“Why is trehalose an exceptional protein stabilizer ？ An analysis of the thermal stability of proteins in the presence of the compatible osmolyte trehalose, "J.Biol. Chem. 278 :26458_65 (2003)和其中引用的參考文獻；以及 Monica Conti 等人，“Capillary isoelectric focusing :the problem of protein solubility, "J. Chromatography 757 237-245(1997)。
該組合物可包括桿菌物種TS-23菌株α -淀粉酶或其變體作為主要酶組分，例 如單組分組合物。備選地，該組合物可包括多種酶活性，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽 酶、過氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質酶、環糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、酯 酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、鹵代過 氧化物酶、轉化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、肽谷氨酰胺酶、過氧 化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉谷氨酰胺酶或木聚糖酶，以及 下述其他酶。其他酶可通過屬于如下屬的微生物生產曲霉屬、木霉屬、腐質酶屬(例 如特異腐質霉(H. insolens))和鐮孢菌(霉)屬(Fusarium)。曲霉屬的示例性成員
(Aspergillus aculeatus) > ^ ^ ft # (Aspergillus awamori) > H ffi # (Aspergillus niger)或米曲霉(Aspergillus oryzae)。鐮孢霉屬的示例性成員包括桿 抱狀鍵抱(Fusarium bactridioides)、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、大 刀鍵抱(Fusarium culmorum)、禾本禾斗鍵抱(Fusarium graminearum)、禾赤鍵抱(Fusarium graminum)、異抱鍵抱(Fusarium heterosporum)、合歡木鍵抱(Fusarium negundinis)、 尖鍵抱(Fusarium oxysporum)、多枝鍵抱(Fusarium reticulatum)、粉紅鍵抱(Fusarium roseum)、接骨木鍵抱(Fusarium sambucinum)、膚色鍵抱(Fusarium sarcochroum)、 硫色鍵？包(Fusarium sulphureum)、Fusarium torulosum、擬絲抱鍵抱(Fusarium trichothecioides)或 Fusarium venenatum。洗滌劑組合物可以是任何有用的形式，例如粉末、顆粒、糊狀或液體。液體洗滌劑 可以是水性的，通常含有至多約70 %的水，和O %至約30 %的有機溶劑。還可以是僅僅包含 大約30%水的濃縮凝膠形式的洗滌劑組合物。酶可以用于與酶的穩定性相容的任何洗滌劑 組合物中。通常可以用已知的包囊化形式(例如通過造粒或隔離在水凝膠中)來保護酶免 于遭遇有害組分。酶和尤其是α-淀粉酶不局限于洗衣和餐具洗滌應用，還可以用于表面 清潔劑以及用于由淀粉或生物質生產乙醇。洗滌劑組合物可以包括一種或多種表面活性劑，其中每種都可以是陰離子型、非 離子型、陽離子型或兩性離子型。洗滌劑將通常包含0%至約50%的陰離子表面活性劑， 例如線性烷基苯磺酸鹽(LAS) ； α-烯烴磺酸鹽(AOS)；燒基硫酸鹽(脂肪醇硫酸鹽)(AS)； 醇乙氧基硫酸鹽(AE0S或AES)；仲烷基磺酸鹽(SAS) ； α -磺基脂肪酸甲酯；烷基或烯基琥 珀酸或皂。組合物也可包含0%至約40%的非離子表面活性劑，例如醇乙氧基化物(ΑΕ0或 AE)、羧化的醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化 脂肪酸單乙醇酰胺、脂肪酸單乙醇酰胺、或多羥基烷基脂肪酸酰胺(如例如在WO 92/06154 中所述)。洗滌劑組合物可另外包括一種或多種其他酶，例如脂肪酶、角質酶、蛋白酶、纖維 素酶、過氧化物酶、和/或漆酶的任何組合。如上所述。洗滌劑可任選地含有約至約65%的洗滌劑增效劑或絡合劑，例如沸石、二磷 酸鹽、三磷酸鹽、磷酸酯、檸檬酸鹽、次氮基三乙酸(ΝΤΑ)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亞乙基 三胺五乙酸(DTMPA)、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸鹽或層狀硅酸鹽(例如來自Hoechst 的SKS-6)。洗滌劑也可以是無增效劑的，即基本上不合洗滌劑增效劑。洗滌劑可任選地包括一種或多種聚合物。實例包括羧甲基纖維素(CMC)、聚乙烯吡 咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯如聚丙烯酸酯、馬來酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。洗滌劑可任選地含有漂白系統，可包括H2O2來源(例如過硼酸鹽或過碳酸鹽)，其 可以與形成過酸的漂白活性劑(如四乙酰基乙二胺(TAED)或壬酰基氧基苯磺酸鹽(NOBS)) 聯用。或者，漂白系統可包括過氧酸(例如酰胺、酰亞胺或砜類過氧酸)。漂白系統也可以 是酶促漂白系統，其中過水解酶(perhydrolase)活化過氧化物，例如WO 2005/056783中所 述的那些。可使用常規的穩定劑來穩定洗滌劑組合物中的酶，穩定劑例如多元醇(如丙二 醇或甘油)、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物(例如，硼酸芳族酯)。可按照WO 92/19709 和WO 92/19708所述配制所述組合物。洗滌劑也可含有其他常規洗滌劑成分，例如織物調理劑，包括粘土、發泡劑、抑泡 齊U、防腐蝕劑、污垢懸浮劑、防塵污再沉積劑、染料、殺菌劑、熒光增白劑或香料。pH(在使用濃度下于水性溶液中測量)通常是中性或堿性，例如PH約7. 0至約 11. 0。包含桿菌物種TS-23菌株α -淀粉酶或其變體的洗滌劑組合物可配制成的具體形 式包括1)具有體積密度(bulk density)為至少600g/L的顆粒劑形式的洗滌劑組合物， 包括約7%至約12%的線性烷基苯磺酸鹽(按酸計算)；約至約4%的醇乙氧基硫酸鹽 (例如C12_18醇，1-2環氧乙烷(EO))或烷基硫酸鹽(例如C16_18)；約5%至約9%的醇乙氧 基化物(例如C14_15醇，7E0)；約14%至約20%的碳酸鈉(例如Na2CO3)；約2%至約6%的 可溶性硅酸鹽(例如Na20，2Si02)；約15%至約22%的沸石(例如NaAlSiO4) ；0%至約6% 的硫酸鈉(例如Na2SO4)；約0%至約15%的檸檬酸鈉/檸檬酸(例如C6H5Na3O7ZiC6H8O7)；約 11%至約18%的過硼酸鈉(例如NaBO3H2O)；約2%至約6%的TAED 至約2%的羧甲基 纖維素(CMC) ；0-3%的聚合物(例如馬來酸/丙烯酸共聚物，PVP, PEG) ；0. 0001-0. 蛋 白質的酶(按純酶計算)；和0至5%的次要成分(例如抑泡劑、香料、熒光增白劑、光漂白 劑)。2)具有體積密度為至少600g/L的顆粒劑形式的洗滌劑組合物，包括約6%至約 11%的線性烷基苯磺酸鹽(按酸計算)；約至約3%的醇乙氧基硫酸鹽(例如C12_18醇， 1-2E0)或烷基硫酸鹽(例如C16_18)；約5%至約9%的醇乙氧基化物(例如C14_15醇，7E0)；約 15%至約21%的碳酸鈉(例如Na2CO3)；約1 %至約4%的可溶性硅酸鹽(例如Na2O, 2Si02)； 約24%至約34%的沸石(例如NaAlSiO4)；約4%至約10%的硫酸鈉(例如Na2SO4) ；0%M 約15%的檸檬酸鈉/檸檬酸(例如C6H5Na3(VC6H8O7) ；0%至約2%的羧甲基纖維素(CMC)； 1-6%的聚合物(例如馬來酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG) ；0.0001-0. 的酶(按純酶蛋白 質計算)；0至5%的次要成分(例如抑泡劑、香料)。3)具有體積密度為至少600g/L的顆粒劑形式的洗滌劑組合物，包括約5 %至 約9%的線性烷基苯磺酸鹽(按酸計算)；約7%至約14%的醇乙氧基化物(例如C12_15 醇，7E0)；約至約3%的皂如脂肪酸(例如C16_22脂肪酸)；約10%至約17%的碳酸鈉 (如Na2CO3)；約3%至約9%的可溶性硅酸鹽(例如Na20，2Si02)；約23%至約33%的沸石 (如NaAlSiO4) ；0%至約4%的硫酸鈉(例如Na2SO4)；約8%至約16%的過硼酸鈉(例如 NaBO3H2O)；約2%至約8%的TAED ；0%至約的磷酸酉旨(例如EDTMPA) ；0%至約2%的羧甲基纖維素(CMC) ；0-3%的聚合物(例如馬來酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG) ；0. 0001-0. 1% 的酶(按純酶蛋白質計算)；0至5%的次要成分(例如抑泡劑、香料、熒光增白劑)。4)具有體積密度為至少600g/L的顆粒劑形式的洗滌劑組合物，包括約8%至約 12%的線性烷基苯磺酸鹽(按酸計算)；約10%至約25%的醇乙氧基化物(例如C12_15醇， 7E0)；約14%至約22%的碳酸鈉(如Na2CO3)；約1 %至約5%的可溶性硅酸鹽(例如Na2O, 2Si02)；約25%至約35%的沸石(例如NaAlSiO4) ；0%至約10%的硫酸鈉(例如Na2SO4)； 0%至約2%的羧甲基纖維素(CMC) ； 1-3%的聚合物(例如馬來酸/丙烯酸共聚物，PVP, PEG) ；0.0001-0. 的酶(按純酶蛋白質計算)；和0至5%的次要成分(例如抑泡劑、香 料)。5)水性液體洗滌劑組合物，包括約15%至約21%的線性烷基苯磺酸鹽(按酸計 算)；約12%至約18%的醇乙氧基化物(例如C12_15醇，7E0或C12_15醇，5E0)；約3%至約 13%的皂如脂肪酸(例如油酸)；0%至約13%的烯基琥珀酸(C12_14)；約8%至約18%的氨 基乙醇；約2%至約8%的檸檬酸；0%至約3%的磷酸酯；0%至約3%的聚合物(例如PVP， PEG) ；0%至約2%的硼酸鹽(例如B4O7) ；0%至約3%的乙醇；約8%至約14%的丙二醇； 0. 0001-0. 的酶(按純酶蛋白質計算)；和0至5%的次要成分(例如分散劑、抑泡劑、香 料、熒光增白劑)。6)水性結構型液體洗滌劑組合物，包括約15%至約21%的線性烷基苯磺酸鹽(按 酸計算)；3-9%的醇乙氧基化物(例如C12_15醇，7E0或C12_15醇，5E0)；約3%至約10%的皂 如脂肪酸(例如油酸)；約14%至約22%的沸石(如NaAlSiO4)；約9%至約18%的檸檬酸 鉀；0%至約2%的硼酸鹽(例如B4O7) ；0%至約2%的羧甲基纖維素(CMC) ；0%至約3%的 聚合物(例如PEG，PVP) ；0%至約3%的錨定聚合物(anchoring polymer)(例如甲基丙烯 酸月桂酯/丙烯酸共聚物；摩爾比25 1,MW 3800) ；0%至約5%的甘油；0. 0001-0. 1 %的 酶(按純酶蛋白質計算)；和0%至5%的次要成分(例如分散劑、抑泡劑、香料、熒光增白 劑)。7)具有體積密度為至少600g/L的顆粒劑形式的洗滌劑組合物，包括約5%至約 10%的脂肪醇硫酸鹽；約3%至約9%的乙氧基化脂肪酸單乙醇酰胺；0-3%的皂如脂肪 酸；約5%至約10%的碳酸鈉(例如Na2CO3)；約至約4%的可溶性硅酸鹽(例如Na2O, 2Si02)；約20%至約40%的沸石(例如NaAlSiO4)；約2%至約8%的硫酸鈉(例如Na2SO4)； 約12%至約18%的過硼酸鈉(例如NaBO3H2O)；約2%至約7%的TAED ；約至約5%的 聚合物(例如馬來酸/丙烯酸共聚物，PEG) ；0. 0001-0. 的酶(按純酶蛋白質計算)；和 0至5%的次要成分(例如熒光增白劑，抑泡劑、香料)。8)顆粒劑形式的洗滌劑組合物，包括約8%至約14%的線性烷基苯磺酸鹽(按酸 計算)；約5%至約11%的乙氧基化脂肪酸單乙醇酰胺；0%至約3%的皂如脂肪酸；約4% 至約10%的碳酸鈉(例如Na2CO3)；約至約4%的可溶性硅酸鹽(Na2O, 2Si02)；約30% 至約50%的沸石(例如NaAlSiO4)；約3%至約11%的硫酸鈉(例如Na2SO4)；約5%至約 12%的檸檬酸鈉(例如C6H5Na3O7)；約1 %至約5%的聚合物(例如PVP，馬來酸/丙烯酸共 聚物，PEG) ；0. 0001-0. 的酶(按純酶蛋白質計算)；和0至5%的次要成分(例如抑泡 劑、香料)。9)顆粒劑形式的洗滌劑組合物，包括約6%至約12%的線性烷基苯磺酸鹽(按酸
31計算)；約至約4%的非離子表面活性劑；約2%至約6%的皂如脂肪酸；約14%至約 22%的碳酸鈉(例如Na2CO3)；約18%至約32%的沸石(例如，NaAlSiO4)；約5%至約20% 的硫酸鈉(例如Na2SO4)；約3%至約8%的檸檬酸鈉(例如C6H5Na3O7)；約4%至約9%的過 硼酸鈉(例如NaBO3H2O)；約至約5%的漂白活性劑(例如NOBS或TAED) ；0%至約2% 的羧甲基纖維素(CMC)；約至約5%的聚合物(例如聚羧酸酯或PEG) ；0. 0001-0. 的 酶(按純酶蛋白質計算)；和0至5%的次要成分(例如，熒光增白劑、香料)。10)水性液體洗滌劑組合物，包括約15%至約23%的線性烷基苯磺酸鹽(按酸計 算)；約8%至約15%的醇乙氧基硫酸鹽(例如C12_15醇，2-3E0)；約3%至約9%的醇乙氧 基化物(例如C12_15醇，7E0或C12_15醇，5E0) ；0%至約3%的皂如脂肪酸(例如月桂酸)；約
至約5%的氨基乙醇；約5%至約10%的檸檬酸鈉；約2%至約6%的水溶增溶劑(例如 甲苯磺酸鈉)；0%至約2%的硼酸鹽(例如B4O7) ；0%至約的羧甲基纖維素；約至 約3%的乙醇；約2%至約5%的丙二醇；0.0001-0. 的酶(按純酶蛋白質計算)；和0至 5%的次要成分(例如聚合物、分散劑、香料、熒光增白劑)。11)水性液體洗滌劑組合物，包括約20%至約32%的線性烷基苯磺酸鹽(按酸計 算)；6-12%的醇乙氧基化物(例如C12_15醇，7E0或C12_15醇，5E0)；約2%至約6%的氨基 乙醇；約8%至約14%的檸檬酸；約至約3%的硼酸鹽(例如B4O7) ；0%至約3%的聚合 物(例如馬來酸/丙烯酸共聚物，錨定聚合物例如甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物)；約 3%至約8%的甘油；0.0001-0. 的酶(按純酶蛋白質計算)；和0至5%的次要成分(例 如水溶增溶劑、分散劑、香料、熒光增白劑)。12)具有體積密度為至少600g/L的顆粒劑形式的洗滌劑組合物，包括約25%至約 40%的陰離子表面活性劑(線性烷基苯磺酸鹽、烷基硫酸鹽、α _烯烴磺酸鹽、α -磺基脂肪 酸甲酯、烷基磺酸鹽、皂)；約至約10%的非離子表面活性劑(例如醇乙氧基化物)；約 8%至約25%的碳酸鈉(例如Na2CO3)；約5%至約15%的可溶性硅酸鹽(例如Na2O, 2Si02)； 0%至約5%的硫酸鈉(例如Na2SO4)；約15%至約28%的沸石(NaAlSiO4) ；0%至約20%的 過硼酸鈉(例如NaBO3 ·4Η20)；約0%至約5%的漂白活性劑(TAED或NOBS) ；0. 0001-0. 1% 的酶(按純酶蛋白質計算)；0至3%的次要成分(例如香料、熒光增白劑)。13)如上面組合物1)_12)所述的洗滌劑組合物，其中所有或者部分的線性烷基苯 磺酸鹽被(C12-C18)烷基硫酸鹽代替。14)具有體積密度為至少600g/L的顆粒劑形式的洗滌劑組合物，包括約9%至約 15%的(C12-C18)烷基硫酸鹽；約3%至約6%的醇乙氧基化物；約至約5%的多羥基烷 基脂肪酸酰胺；約10%至約20%的沸石(例如NaAlSiO4)；約10%至約20%的層狀焦硅酸 鹽(例如來自Hoechst的SK56)；約3%至約12%的碳酸鈉(例如Na2CO3) ；0%至約6%的 可溶性硅酸鹽(例如Na20，2Si02)；約4%至約8%的檸檬酸鈉；約13%至約22%的過碳酸 鈉；約3%至約8%的TAED ；0%至約5%的聚合物(例如聚羧酸酯和PVP) ；0. 0001-0. 的 酶(按純酶蛋白質計算)；和0至5%的次要成分(例如熒光增白劑、光漂白劑、香料、抑泡 劑)。15)具有體積密度為至少600g/L的顆粒劑形式的洗滌劑組合物，包括約4%至約 8%的(C12-C18)烷基硫酸鹽；約11%至約15%的醇乙氧基化物；約至約4%的皂；約 35 %至約45%的沸石MAP或沸石A ；約2%至約8%的碳酸鈉(如Na2CO3) ；0%至約4%的可溶性硅酸鹽(例如Na20，2Si02)；約13%至約22%的過碳酸鈉；的TAED ；0%至約3% 的羧甲基纖維素(CMC) ；0%至約3%的聚合物(例如聚羧酸酯和PVP) ；0.0001-0. 的酶 (按純酶蛋白質計算)；和0至3%的次要成分(例如熒光增白劑、磷酸鹽、香料)。(16)上面1)_15)所述的洗滌劑制劑，其含有被穩定化的或囊化的過酸作為額外 組分或者作為已經述及的漂白系統的替代物。17)上面1)、3)、7)、9)和12)所述的洗滌劑組合物，其中過硼酸鹽被過碳酸鹽代替。
18)上文1)、3)、7)、9)、12)、14)和15)所述的洗滌劑組合物，還含有錳催化劑。 例如猛催化劑是"Efficient manganese catalysts for low-temperature bleaching，，， Nature 369 =637-639 (1994)中記載的化合物中的一種。19)配制成非水性洗滌劑液體的洗滌劑組合物，包括液態非離子表面活性劑，例 如，線性烷氧基化伯醇、增效劑體系(例如磷酸鹽)、酶和堿。該洗滌劑也可包括陰離子表面 活性劑和/或漂白系統。可以以常規用于洗滌劑中的濃度加入桿菌物種TS-23菌株α -淀粉酶或其變體。 目前考慮在洗滌劑組合物中，可以以每升洗液對應0. 00001-1. Omg (以純酶蛋白質計算)酶 的量加入桿菌物種TS-23菌株α -淀粉酶或其變體。在另一個實施方案中，可將2，6- β -D-果聚糖水解酶摻入洗滌劑組合物中并用于 家居和/或工業紡織品/衣物上存在的生物膜的去除/清潔。例如，可以將洗滌劑組合物配制成手洗或機洗的衣物洗滌劑組合物，包括適于預 處理污染的織物的衣物添加劑組合物和漂洗添加的織物柔軟劑組合物，或者配制成用于一 般的家居硬表面清潔操作的洗滌劑組合物，或者配制以用于手洗或機洗的衣物洗滌操作。一個具體的方面，洗滌劑組合物可以進一步包括2，6-β-D-果聚糖水解酶，除桿 菌物種TS-23菌株α -淀粉酶或其變體之外的一種或多種α _淀粉酶，和一種或多種其它 清潔酶，例如蛋白酶、脂肪酶、角質酶、糖酶、纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、 半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、漆酶和/或過氧化物酶和/或其組合。通常，所選酶的特性應與選擇的洗滌劑兼容(例如最適ρΗ、與其他酶和非酶成分 的兼容性等)，且所述酶應以有效量存在。4. 2餐具洗滌劑組合物本發明的α -淀粉酶也可用于餐具洗滌劑組合物中，包括下列例子1)粉末狀自動餐具洗滌組合物非離子表面活性劑0.4-2.5%硅酸鈉0-20%二硅酸鈉3-20%三磷酸鈉20-40%碳酸鈉0-20%過硼酸鈉2-9%四乙酰基乙二胺(TAED) 1-4%硫酸鈉5-33%酶0.0001-0.1%
2)粉末狀自動餐具洗滌組合物非離子表面活性劑1-2%(例如醇乙氧基化物)二硅酸鈉2-30% 碳酸鈉10_50%磷酸鈉0-5%二水合檸檬酸三鈉9-30%醋酸次氮基三鈉(NTA)0-20%一水合過硼酸鈉5-10%四乙酰基乙二胺(TAED)1-2%聚丙烯酸酯聚合物6-25%(例如馬來酸/丙烯酸共聚物)酶0.0001-0.1%香料0. 1-0. 5%/K5-10%3)粉末狀自動餐具洗滌組合物非離子表面活性劑0.5-2.0%二硅酸鈉25-40%檸檬酸鈉30-55%碳酸鈉0-29%碳酸氫鈉0-20%一水合過硼酸鈉0-15%四乙酰基乙二胺(TAED)0-6%馬來酸/丙烯酸共聚物0-5%粘土1-3%聚氨基酸0-20%聚丙烯酸鈉0-8%酶0.0001-0.1%4)粉末狀自動餐具洗滌組合物非離子表面活性劑1-2%沸石MAP15-42%二硅酸鈉30-34%檸檬酸鈉0-12%碳酸鈉0-20%一水合過硼酸鈉7-15%四乙酰基乙烯0-3%聯胺(TAED)聚合物0-4%馬來酸/丙烯酸共聚物0-5%有機磷酸酯0-4%
粘土1-2%
酶0.0001-0.1%硫酸鈉余量5)粉末狀自動餐具洗滌組合物非離子表面活性劑1-7%二硅酸鈉18-30%檸檬酸三鈉10_24%碳酸鈉12-20%單過硫酸鹽15-21%(2KHS05. KHSO4. K2SO4)漂白穩定劑0.1-2%馬來酸/丙烯酸共聚物0-6%二亞乙基三胺五乙酸鹽0-2.5%五鈉鹽酶0.0001-0.1%硫酸鈉，水余量6)具有清潔表面活性劑系統的粉末和液體餐具洗滌組合物非離子表面活性劑0-1.5%十八烷基二甲胺N-氧化二水合物0-5%十八烷基二甲胺N-氧化二水合物和十六烷基二甲胺N-氧化二水合物的80 20wt. C18/C16 共混物0-4%十八烷基二(羥乙基)胺N-氧化無水合物與十六烷基二(羥乙基)胺N-氧化無水合物的70 30wt. C18/C16 共混物0-5%平均乙氧基化度為3的C13-C15烷基乙氧基硫酸酯 0-10%平均乙氧基化度為3的C12-C15烷基乙氧基硫酸酯 0-5%平均乙氧基化度為12的C13-C15乙氧基化醇0-5%平均乙氧基化度為9的C12-C15乙氧基化醇共混物 0-6. 5%平均乙氧基化度為30的C13-C15乙氧基化醇共混物 0-4%二硅酸鈉0-33%三聚磷酸鈉0-46%檸檬酸鈉0-28%檸檬酸0-29%碳酸鈉0-20%一水合過硼酸鈉0-11.5%四乙酰基乙二胺(TAED)0-4%馬來酸/丙烯酸共聚物0-7. 5%硫酸鈉0-12.5%
酶0.0001-0.1%7)非水性液體自動餐具洗滌組合物液體非離子表面活性劑(例如醇乙氧基化物) 2.0-10.0%堿金屬硅酸鹽3.0-15.0%堿金屬磷酸鹽20.0-40.0%選自高級乙二醇、聚乙二醇、多氧化物、25.0-45.0%乙二醇醚的液體載體 穩定劑(例如磷酸和C16-C18鏈烷醇的偏酯) 0. 5-7. 0 %抑泡劑(例如硅酮)0-1.5%酶0.0001-0.1%8)非水性液體餐具洗滌組合物液體非離子表面活性劑(例如醇乙氧基化物)2.0-10.0%硅酸鈉3.0-15.0%堿金屬碳酸鹽7.0-20.0%檸檬酸鈉0.0-1.5%穩定化系統(例如細分的硅酮和低分子量二烷基聚乙二醇醚的混合物)0.5-7.0%低分子量聚丙烯酸酯聚合物5.0-15.0%粘土凝膠增稠劑(如膨潤土 )0.0-10.0%羥丙基纖維素聚合物0.0-0.6%酶0.0001-0.1%選自高級乙二醇、聚乙二醇、多氧化物、乙二醇醚的液體載體余量9)觸變性液體自動餐具洗滌組合物C12-C14 脂肪酸0-0.5%嵌段的共聚物表面活性劑1.5-15.0%檸檬酸鈉0-12%三聚磷酸鈉0-15%碳酸鈉0-8%三硬酯酸鋁0-0.1%枯烯磺酸鈉0-1.7%聚丙烯酸酯增稠劑1.32-2.5%聚丙烯酸鈉2.4-6.0%硼酸0-4.0%甲酸鈉0-0.45%甲酸鈣0-0.2%正癸基聯苯氧化物二磺酸鈉0-4.0%單乙醇胺(MEA)0-1. 86%氫氧化鈉(50%)1. 9-9. 3%
1，2-丙二醇0-9.4%酶0.0001-0.1%抑泡劑、染料、香料、水余量10)液體自動餐具洗滌組合物醇乙氧基化物0-20%脂肪酸酯磺酸酯0-30%十二烷基硫酸鈉0-20%
烷基聚糖苷0-21%油酸0-10%二硅酸鈉一水合物18-33%檸檬酸鈉二水合物18-33%硬脂酸鈉0-2.5%一水合過硼酸鈉0-13%四乙酰基乙二胺(TAED)0-8%馬來酸/丙烯酸共聚物4-8%酶0.0001-0.1%11)含有保護的漂白顆粒的液體自動餐具洗滌組合物硅酸鈉5-10%焦磷酸四鉀15-25%三磷酸鈉0-2%碳酸鉀4-8%保護的漂白顆粒，例如氯5-10%聚合物增稠劑0.7-1.5%氫氧化鉀0-2%酶0.0001-0.1%水余量11)上面1)、2)、3)、4)、6)和10)所述的自動餐具洗滌組合物，其中過硼酸鹽被過 碳酸鹽代替。12)上述1)_6)的自動餐具洗滌組合物，進一步包含錳催化劑。該錳催化劑可以是 例如"Efficient manganese catalysts for low-temperature bleaching,，，Nature 369, 1994，pp 637-639中記載的化合物中的一種。4. 3生物膜去除組合物和用途用于除去生物膜的組合物可包括桿菌物種TS-23菌株α -淀粉酶或其變體作為主 要酶成分，例如單組分組合物。或者，該組合物可以包括多種酶活性，例如多種淀粉酶，或者 包括下列酶任意組合的酶混合物氨肽酶、淀粉酶(β_或α-或葡糖淀粉酶)、糖酶、羧肽 酶、過氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質酶、環糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、 α-半乳糖苷酶、半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、鹵代過氧化 物酶、轉化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、肽谷氨酰胺酶、過氧化物酶、 植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉谷氨酰胺酶和/或木聚糖酶，或其任意組合，用于去除生物膜。其他酶可通過屬于如下屬的微生物生產曲霉屬、木霉屬、腐質酶屬 (例如特異腐質霉)和鐮孢菌(霉)屬。曲霉的示例性實例包括棘孢曲霉、泡盛曲霉、黑曲 霉或米曲霉。鐮孢霉屬的實例包括桿孢狀鐮孢、F. cerealis.F. crookwellense、大刀鐮孢、 禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、 膚色鐮孢、硫色鐮孢、F. toruloseum、擬絲孢鐮孢和Fusarium Venenatum0包括桿菌物種TS-23菌株α _淀粉酶或其變體的組合物可以按照本領域已知的方 法制備，并且可以是液體或干組合物的形式。例如，含桿菌物種TS-23菌株α-淀粉酶或其 變體的組合物可以是顆粒或微顆粒的形式。欲包括在組合物中的多肽可以按照本領域已知 的方法穩定化。下文給出了多肽組合物用途的實例。含桿菌物種TS-23菌株α -淀粉酶或其變體 的組合物的用量及組合物使用的其他條件可以基于本領域已知的方法來確定。 還考慮桿菌物種TS-23菌株α -淀粉酶或其變體與2，6_ β -D-果聚糖水解酶或其 變體一起用在組合物中。另一方面是瓦解和/或去除生物膜的組合物和方法。如本文所用的術語“瓦解”應 理解為水解生物膜基質中的多糖(該多糖在生物膜中將個體微生物細胞連接并結合在一 起)，由此所述微生物細胞能夠從生物膜中釋放并除去。生物膜通常存在于表面，故生物膜 的瓦解可以通過用含有桿菌物種TS-23菌株α _淀粉酶或其變體或一種或多種其他負責降 解生物膜的酶(例如但不限于2，6-β-D-果聚糖水解酶)的水性介質接觸表面(例如通過 浸沒、覆蓋或噴灑表面)而實現。組合物可用于水解例如紙漿業和紙業白水中的淀渣。桿菌物種TS-23菌株α -淀粉酶或其變體的存在量可以是0. 0001-10, 000mg/L、 0. 001-1000mg/L、0. 01-100mg/L、或是0. 1-lOmg/L。其他酶及酶變體可以以相似或更低的量 存在。該方法可以適宜地在室溫至約70°C的溫度進行。適宜的溫度范圍包括約30°C至 約600C，例如約40°C至約500C。用于水解生物膜的適宜pH處在約3. 5至約8. 5的范圍內。示例性pH范圍包括 pH約5. 5至約8，例如約6. 5至約7. 5。用于酶有效去除生物膜的接觸時間或反應時間 可以變化相當大，這取決于生物膜的特性以及用酶單獨或組合其他生物膜降解酶(如2， 6-β-D-果聚糖水解酶)處理表面的頻率。示例性的反應時間可包括約0. 25至約25小時 內，以及約1至約10小時，例如約2小時。可與桿菌物種TS-23菌株α -淀粉酶或其變體和2，6_ β -D-果聚糖水解酶組合的 其他生物膜降解酶包括但不限于纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶、其他淀粉酶，包括其他 α -淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶和/或果膠酶。桿菌物種TS-23菌株α -淀粉酶或其變體還可以與抗微生物劑組合，例如酶的或 非酶的殺生物劑。酶殺生物劑可以是例如包括氧化還原酶，例如漆酶或過氧化物酶，特別 是鹵代過氧化物酶，和任選的增強劑，例如丁香酸烷基酯的組合物，例如國際PCT申請WO 97/42825和DK 97/1273中所描述的那樣。可以去除和/或清除生物膜的表面可以是硬表面，其定義涉及基本上微生物不能 透過的任何表面。表面的實例是由金屬例如不銹鋼合金、塑料/合成聚合物、橡膠、板材、玻 璃、木材、紙、紡織品、混凝土、巖石、大理石、石膏及陶瓷材料制成的表面，其任選地以例如油漆、琺瑯、聚合物等包覆。從而，表面可以是支持、運輸、處理或接觸水性溶液的系統(如 供水系統、食品處理系統、冷卻系統、化學處理系統或藥物處理系統)的構件。該組合物和 使用該組合物的方法用于木材加工系統(如制漿和/或造紙工業)中除去生物膜。因此，酶 和含有酶的組合物可用于常規的就地清洗(C-I-P)系統。表面可以是系統單元(如管道、 罐、泵、膜、濾器、熱交換器、離心機、蒸發器、混合器、噴霧塔、閥門和反應器)的一部分。表 面也可以是醫學科學和工業所用的器具(如污染的內窺鏡、假體裝置或醫學內植物)或其 部分。用于生物膜去除的組合物也可以考慮用于防止當金屬表面例如管道受微生物生 物膜攻擊時發生的所謂生物腐蝕，即通過瓦解生物膜，由此防止生物膜中的微生物細胞建 立起腐蝕其所附著的金屬表面的生物膜環境。抗生物膜組合物的其他應用包含口腔護理。然而表面也可以是生物來源的，例如 粘膜、皮膚、牙齒、頭發、指甲等。因此表面包含具有牙菌斑的牙齒(例如通過將酶加入到牙膏中)和污染的隱形眼 鏡。因此，桿菌物種TS-23菌株α-淀粉酶或其變體可用在組合物中和用于制備瓦解人或 動物牙齒菌斑的藥物的方法中。另一用途是自粘膜瓦解生物膜，例如患有囊性纖維化的患 者肺中的生物膜。 因此，本發明進一步的方面涉及口腔護理組合物，包含重組的酶，例如基本不含任 何活性污染物的純化的酶。口腔護理組合物可適當包含一定量的重組酶。用于口腔護理組合物的其他生物膜降解酶包括但不限于口腔護理組合物中的 2，6-i3_D-果聚糖水解酶活性。考慮的酶活性包括下組酶中的活性葡聚糖酶；齒斑葡 聚糖酶(mutanase)；氧化酶，例如葡糖氧化酶，L-氨基酸氧化酶，過氧化物酶，例如WO 95/10602中所述的鬼傘屬物種(Coprinus)過氧化物酶或乳過氧化物酶，鹵代過氧化物 酶，特別是衍生自彎孢霉屬物種(Curvularia)、特別是糙壁彎孢(C. verruculosa)和不等 彎孢(C. inaequalis)的鹵代過氧化物酶；漆酶；蛋白酶例如木瓜蛋白酶，酸性蛋白酶(例 如TO95/02044中所述的酸性蛋白酶)，內切糖苷酶，脂肪酶，淀粉酶，包括淀粉葡糖苷酶，如 AMG(Novo Nordisk A/S)；抗微生物酶，以及它們的混合物。口腔護理組合物可以具有任何適宜的物理形式(即，粉末、糊、凝膠、液體、膏、片 等)。“ 口腔護理組合物”包括可用于維持或改善人和動物口中口腔衛生的組合物，預防齲 齒、預防牙菌斑和牙垢形成、去除牙菌斑和牙垢、預防和/或治療牙科疾病等。口腔護理組 合物在本文中至少也包括用于清潔假牙、人工牙齒等的產品。口腔護理組合物的實例包括 牙膏、牙霜、凝膠或牙粉、漱牙漱口水、刷牙前后的漱洗制劑、口香糖、錠劑和糖果。牙膏和牙 凝膠一般包括磨擦拋光材料、發泡劑、矯味劑、保濕劑、粘合劑、增稠劑、甜味劑、增白劑/漂 白劑/去漬劑、水和任選的另外的酶和酶組合。漱口水，包括菌斑去除液體，一般包括水/醇溶液、香料、保濕劑、增甜劑、發泡劑、 著色劑和任選的另外的酶或酶組合。磨擦拋光材料也可以摻入到口腔護理組合物例如牙粉中。從而，磨擦拋光材料可以包括氧化鋁及其水合物，例如三水合α-氧化鋁 (α alumina trihydrate)；三硅酸鎂；碳酸鎂；高嶺土 ；鋁硅酸鹽，例如煅燒硅酸鋁和硅酸 鋁；碳酸鈣；硅酸鋯；還有粉狀塑料，例如聚氯乙烯；聚酰胺；聚甲基丙烯酸甲酯；聚苯乙烯；苯酚甲醛樹脂；蜜胺甲醛樹脂；脲甲醛樹脂；環氧樹脂；粉狀聚乙烯；氧化硅干凝膠；水 凝膠和氣凝膠等。同樣適合作為磨料的有焦磷酸鈣；水不溶性堿性偏磷酸鹽；磷酸二鈣和 /或其二水合物，正磷酸二鈣；磷酸三鈣；羥基磷灰石顆粒等。還可以采用這些物質的混合 物。根據口腔護理組合物的不同，磨擦產品可以以重量計約0%至約70%，或約至 約70 %存在。對于牙膏，磨料含量一般處于以最終牙膏重量計10 % -70 %的范圍內。
采用保濕劑以防止例如牙膏的水分流失。適合用于口腔護理組合物的保濕劑包括 如下化合物及其混合物甘油；多元醇；山梨糖醇；聚乙二醇(PEG)；丙二醇；1，3_丙二醇； 1，4_ 丁二醇；氫化的部分水解多糖等。保濕劑一般以重量計0%至約80%，或約5%至約 70%存在于牙膏中。二氧化硅、淀粉、黃芪膠、黃原膠、愛爾蘭苔(Irish moss)提取物、藻酸鹽、果膠、纖 維素衍生物如羥乙基纖維素、羧甲基纖維素鈉和羥丙基纖維素鈉；聚丙烯酸及其鹽、聚乙烯 吡咯烷酮是幫助穩定牙粉產品的適合的增稠劑和粘合劑的實例。增稠劑在牙膏乳劑和凝膠 中的存在量可以是以終產品重量計約0. 1 %至約20 %，而粘合劑達到約0. 01至約10 %的程度。可以使用陰離子、陽離子、非離子、兼性和/或兩性離子表面活性劑作為發泡劑 皂。這些可以以終產品重量計0%至約15%、約0. 1至約13%或約0. 25%至約10%的水平存在。表面活性劑僅在其不對本發明的桿菌物種TS-23菌株α-淀粉酶或其變體施加失 活效應的程度上是適宜的。表面活性劑包括脂肪醇硫酸鹽，磺化單酰甘油或具10-20個碳 原子的脂肪酸的鹽，脂肪酸-清蛋白縮合產物，脂肪酸酰胺和牛磺酸的鹽和/或脂肪酸羥乙 基磺酸酯的鹽。適宜的增甜劑包括制劑用糖精。香料例如留蘭香通常以低含量存在，例如以重量計約0.01%至約5%，尤其是約 0. 至約5%。增白劑/漂白劑包括H2O2，且可以以終產品重量計低于約5%，或約0. 25% 至約4%的量添加。增白劑/漂白劑可以是酶，例如氧化還原酶。適宜的牙齒漂白酶的實例 為例如WO 97/06775中描述的那些。水通常以賦予例如牙膏可流動形式的量添加。也可以包括其它水溶性抗菌劑，例如二葡萄糖酸氯己定，氨己嘧啶(hexetidine)， 雙胍啶(alexidine)，三氯生(Triclosan )，季銨抗菌化合物，以及水溶性的某些金屬離 子源，例如鋅、銅、銀和錫源(例如，氯化鋅、氯化銅和氯化亞錫，以及硝酸銀)。也可以加入能夠用作為氟化物源、色素/著色劑、防腐劑、維生素、pH調節劑、防齲 齊U、脫敏劑等的化合物。當生物膜降解酶用于清潔口腔時可提供若干益處。蛋白酶降解唾液蛋白質，這些 蛋白質吸附在牙齒表面并形成薄膜(pellicle)，即所致菌斑的第一層。蛋白酶連同脂肪酶 一起通過裂解構成細菌細胞壁和膜的結構組分的蛋白質和脂質而破壞細菌。葡聚糖酶及其他糖酶如2，6_β-D-果聚糖水解酶降解細菌所產生的形成細菌粘 附基質的有機主鏈結構。蛋白酶和淀粉酶不僅防止牙菌斑形成，而且還可以通過降解結合 鈣的糖-蛋白質復合物防止礦化，從而阻止牙垢發展。
牙膏一般可以包括如下成分(以最終牙膏組合物的重量百分比計)磨料至約 70% ；保濕劑0%至約80% ；增稠劑約0. 至約20% ；粘合劑約0. 01%至約10% ；增 甜劑約0. 至約5% ；發泡劑0%至約15% ；增白劑0%至約5% ；和酶約0. 0001%至 約 20%。在一個具體實施方式
中，牙膏具有在約6.0至約8.0范圍內的pH，且包括a)約 10%至約70%的磨料；b)0%至約80%的保濕劑；c)0. 至約20%的增稠劑；d) 0.01%至 約10%的粘合劑；e)約0. 至約5%的增甜劑；f)0%至約15%的發泡劑；g)0%至約5% 的增白劑和i)約0. 0001%至約20%的酶。i)中涉及的所述酶包括桿菌物種TS-23菌株α -淀粉酶或其變體，單獨或組合其 他生物膜降解酶如2，6-β-D-果聚糖水解酶，和任選地已知用于牙膏中的上述其他類型的
酶等。 漱口劑一般可以包括如下成分(以最終漱口劑組合物的重量百分比計)0%至約 20 %的保濕劑；0 %至約2 %的表面活性劑；0 %至約5 %的酶；0 %至約20 %的乙醇；0 %至 約2%的其他成分(例如香料，增甜劑活性成分，如氟化物)。組合物還可以含有約0%至約 70%的水。漱口劑組合物可以用適當的緩沖劑進行緩沖，例如pH約6. 0至約7. 5的檸檬酸鈉 或磷酸鈉。漱口劑可以是非稀釋的形式(即，用前必須稀釋)。口腔護理組合物可以利用任何口腔護理領域已知的常規方法來生產。4. 4淀粉加工組合物和用途另一方面，具有所公開的桿菌物種TS-23菌株α -淀粉酶或其變體的組合物可用 于淀粉液化或糖化。一方面，涉及組合物和組合物在用淀粉制備增甜劑中的用途。將淀粉轉換為果糖 糖漿的傳統方法通常包括三個連續的酶促步驟液化步驟，糖化步驟以及異構化步驟。在液 化步驟中，在約5. 5至約6. 2的pH值、約95°C至約160°C的溫度，通過為期約2個小時的桿 菌物種TS-23菌株α-淀粉酶或其變體作用，使淀粉降解為糊精。為了在這些條件下保證 最優的酶穩定性，加入ImM鈣(40ppm游離鈣離子)。淀粉加工用于生產醇(例如谷物液化 為燃料或可飲用的醇、醇的釀造)，淀粉液化可用于增甜劑生產、蔗糖加工和其他食品相關 的淀粉加工目的。其他條件可用于不同的桿菌物種TS-23菌株α-淀粉酶或其變體。液化步驟后，可以通過添加葡糖淀粉酶(例如AMG )和脫支酶(如異淀粉酶或支 鏈淀粉酶(例如PR0M0ZYME ))，將糊精轉換為右旋糖。在此步驟之前，將pH降至低于約 4. 5的值，維持高溫(高于95°C )，并使液化桿菌物種TS-23菌株α -淀粉酶或其變體的活 性變性。使溫度降至60°C，可以加入葡糖淀粉酶和脫支酶。糖化步驟通常進行約24至約 72小時。糖化步驟之后，將pH升至處于約6. 0至約8. 0范圍的值(例如pH7. 5)，并通過離 子交換除去鈣。然后利用例如固定化的葡萄糖異構酶(如Sweetzyme )將葡萄糖漿轉化 為高果糖糖漿。可以完成該過程中至少一種酶的改良。桿菌物種TS-23菌株α-淀粉酶或其變體 具有液化中降低的鈣需求。游離的鈣的加入是充分確保桿菌物種TS-23菌株α-淀粉酶或 其變體的高穩定性所需的；但是游離的鈣強烈抑制葡萄糖異構酶的活性，并且需要利用昂貴的單元操作除去鈣，達到游離鈣的水平降至低于3-5ppm的程度。如果能夠避免這樣的操 作，且液化步驟無需添加游離鈣離子即能進行，則可以獲得費用的節約。例如，可在組合物和操作中利用鈣依賴性較小的酶，其在低濃度游離鈣 (< 40ppm)時穩定且具有高活性。這樣的桿菌物種TS-23菌株α-淀粉酶或其變體應當具 有位于PH范圍約4. 5至約6. 5中，或者在范圍約4. 5至約5. 5中的最適ρΗ。在實驗室中和工業設置中，桿菌物種TS-23菌株α _淀粉酶或其變體可用于水解 用于各種目的的淀粉或任何含麥芽糊精(maltodextrine)的化合物。這些桿菌物種TS-23 菌株α -淀粉酶或其變體可單獨使用以提供特異性水解，或者與其他淀粉酶組合提供具有 廣譜活性的混合物。示例性應用包括從生物樣品、食品、動物飼料、藥物或工業樣品中除去 或部分或完全水解淀粉或任何含麥芽糊精的化合物。本發明另一方面涉及在發酵過程中的組合物和使用該組合物的方法，其中淀粉底 物在桿菌物種TS-23菌株α -淀粉酶或其變體存在下液化和/或糖化，以產生葡萄糖和/或 麥芽糖，其適于由發酵微生物如酵母菌轉化為發酵產物。這樣的發酵過程包括生成用作燃 料的乙醇或飲用乙醇(可飲用乙醇)的過程，生產飲料的過程 、生產所需有機化合物(例如 檸檬酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸、葡糖酸鈉、葡糖酸鈣、葡糖酸鉀、葡糖酸S -內酯或異抗壞血 酸鈉)、酮類、氨基酸(如谷氨酸、谷氨酸單鈉)、以及難以合成制備的更復雜的化合物(例 如青霉素、四環素等抗生素)、酶、維生素(例如核黃素、維生素Β12、β-胡蘿卜素)和激素) 的過程。待加工的淀粉可以具有高度精制的淀粉質量，例如至少90%、至少95%、至少 97%或至少99. 5%純。或者，淀粉可以是較為粗制的含淀粉材料，其含有碾磨過的整個谷 粒，包括非淀粉級分如胚殘留物和纖維。碾磨原料如整個谷粒以打開其結構，從而允許進一 步加工。可以使用兩種碾磨方法濕磨法和干磨法。此外，可以使用玉米渣如碾磨過的玉米渣。干磨的谷粒除淀粉外還將包含顯著量的非淀粉糖類化合物。當通過噴射蒸煮加 工這樣的異質原料時，桿菌物種TS-23菌株往往僅能實現淀粉的部分糊化。由于桿菌物種 TS-23菌株α _淀粉酶或其變體對未糊化的淀粉具有高活性，該酶應用在包括液化和/或糖 化噴射蒸煮的干磨淀粉的方法中具有優勢。并且，由于桿菌物種TS-23菌株α _淀粉酶或其變體的優良水解活性，糖化步驟中 對葡糖淀粉酶的需求也得到了極大降低。這使得糖化可以在非常低水平的葡糖淀粉酶活性 下進行。葡糖淀粉酶或者不存在，或者如果存在的話，以不超過或甚至低于0. 5AGU/gDS、或 不超過或甚至低于0. 4AGU/gDS、或不超過或甚至低于約0. 3AGU/g DS、或者低于0. 1AGU，例 如不超過或甚至低于0. 05AGU/g DS淀粉底物的量存在。“DS”是加入每克干固形底物的酶單 位。酶蛋白以mg表示，具有葡糖淀粉酶活性的酶或者不存在，或者以不超過或甚至低于約 0. 5mg EP/g DS，或者不超過或甚至低于約0.4mg EP/g DS，或者不超過或甚至低于約0. 3mg EP/g DS，或者不超過或甚至低于約0. Img EP/g DS (例如不超過或甚至低于約0. 05mg EP/ g DS或者不超過或甚至低于0. 02mg EP/g DS的淀粉底物)的量存在。葡糖淀粉酶可以源 自曲霉屬物種、籃狀菌屬物種(Talaromyces sp.)、大紋飾孢屬物種(Pachykytospora sp.) 或栓菌屬物種(Trametes sp.)的菌株，其中示例性的實例為黑曲霉(Aspergillus niger)、 埃默森籃狀菌(Talaromyces emersonii)、瓣環栓菌(Trametes cingulata)或紙質大紋飾Jfe (Pachykytospora papyracea)0
該方法可包括a)將淀粉底物與桿菌物種TS-23菌株α -淀粉酶或其變體接觸， 其包含具有α-淀粉酶活性的催化模塊和糖結合模塊，例如第一方面中所述的多肽；b) 將所述淀粉底物與所述酶在一定溫度下孵育一段時間，在此條件下足以將至少90%、至 少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至 少99%或甚至至少99. 5% w/w的所述淀粉底物轉化為可發酵的糖；c)發酵，以產生發酵 產物；和d)可選地回收發酵產物。在該方法的步驟b)和/或c)中，具有葡糖淀粉酶活 性的酶或者不存在，或者以 0.001-2. OAGU/g DS、0. 01-1. 5AGU/g DS、0. 05-1. OAGU/g DS、 0. 01-0. 5AGU/g DS的量存在。具有葡糖淀粉酶活性的酶可以或者不存在，或者以不超過或 甚至低于0. 5AGU/g DS、或不超過或甚至低于0. 4AGU/g DS、或不超過或甚至低于0. 3AGU/g DS、或者不超過甚至低于0. lAGU/g DS，例如不超過或甚至低于0.05AGU/g DS的淀粉底物的 量存在。酶蛋白以mg表示，具有葡糖淀粉酶活性的酶或者不存在，或者以不超過或甚至低 于0. 5mgEP/g DS,或者不超過或甚至低于0. 4mgEP/g DS,或者不超過或甚至低于0. 3mgEP/ g DS，或者不超過或甚至低于0. lmgEP/g DS (例如不超過或甚至低于0.05mgEP/g DS或者 不超過或甚至低于0.02mgEP/g DS的淀粉底物)的量存在。在該方法中，步驟a)、b)、c)和 /或d)可以單獨執行或者同時執行。在另一方面，該方法包括a)將淀粉底物與轉化后表達桿菌物種TS-23菌株 α -淀粉酶或其變體的酵母菌細胞接觸，所述變體包含具有α -淀粉酶活性的催化模塊和 糖結合模塊；b)將所述淀粉底物與所述酵母菌在一定溫度下孵育一段時間，在此條件下足 以將至少90% w/w的所述淀粉底物轉化為可發酵的糖；c)發酵，以產生乙醇；和d)可選地 回收乙醇。在該方法中，步驟a)、b)和c)可以單獨執行或者同時執行。在又一個方面中，該方法包括水解糊化的糖漿或顆粒淀粉，特別是在低于所述顆 粒淀粉的初始糊化溫度的溫度下水解顆粒淀粉為可溶的淀粉水解產物。除了與包含具有 α -淀粉酶活性的催化模塊和糖結合模塊的多肽接觸之外，淀粉還可以與任何一種或多種 下述真菌α “淀粉酶(EC 3. 2. 1. 1)、以及一種或多種下述β -淀粉酶(EC 3. 2. 1. 2)和葡 糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)的酶接觸。在另一方面，可向桿菌物種TS-23菌株α -淀粉酶或 其變體中添加其他淀粉水解酶或脫支酶，例如異淀粉酶(EC 3.2. 1.68)或支鏈淀粉酶(EC 3. 2. 1. 41)。在一實施方案中，所述方法在低于初始糊化溫度的溫度實施。此類方法時常在至 少30°C、至少31°C、至少32°C、至少33°C、至少34"C、至少35°C、至少36°C、至少37°C、至 少38°C、至少39"C、至少40°C、至少41°C、至少42°C、至少43°C、至少44"C、至少45°C、至 少46°C、至少47°C、至少48°C、至少49°C、至少50°C、至少51 °C、至少52°C、至少53°C、至少 54°C、至少55 °C、至少56 °C、至少57 °C、至少58 °C、至少59 V或至少60 V實施。實施所述方 法的PH可以處于約3. 0至約7. 0、或約3. 5至約6. 0、或約4. 0至約5. 0的范圍。一方面考 慮包括發酵的方法，例如，在32°C左右(例如30-35°C)的溫度，例如利用酵母生產乙醇。另一方面，所述方法包括同時進行的糖化和發酵，例如，在30_35°C (例如32°C左 右)的溫度，例如利用酵母生產乙醇或者利用其他適宜的發酵生物生產期望的有機化合 物。在上述發酵方法中，乙醇含量達到至少約7%、至少約8%、至少約9%、至少約10%、至少約11%、至少約12%、至少約13%、至少約14%、至少約15%，例如至少約16%乙醇。在上述任何方面中使用的淀粉漿可以具有約20%至約55%的干固形物顆粒淀 粉，約25%至約40%的干固形物顆粒淀粉，或約30%至約35%的干固形物顆粒淀粉。在 與桿菌物種TS-23菌株α -淀粉酶或其變體接觸后，該酶將顆粒淀粉中的可溶性淀粉以至 少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少 93 %、至少94%、至少95 %、至少96 %、至少9 7 %、至少98 %或至少99 %的量轉化成可溶性 淀粉水解物。在另一實施方案中，在用于液化、糖化糊化的淀粉(例如但不限于通過噴射蒸煮 進行的糊化)的方法中使用桿菌物種TS-23菌株α-淀粉酶或其包含具有α-淀粉酶活性 的催化模塊和糖結合模塊的變體，例如第一方面中所述的多肽。所述方法可以包括發酵以 生產發酵產物例如乙醇。通過發酵由含淀粉原料生產乙醇的此類方法包括(i)用包含具 有α “淀粉酶活性的催化模塊和糖結合模塊的多肽，例如第一方面的多肽液化所述含淀粉 原料；(ii)糖化所得的液化醪液(mash)；和(iii)在發酵生物的存在下發酵步驟(ii)所得 的物質。任選該方法還包括回收乙醇。糖化和發酵的方法可以作為同時糖化和發酵法(SSF) 實施。在上述發酵期間，乙醇含量達到至少約7%、至少約8%、至少約9%、至少約10%、例 如至少約11%、至少約12%、至少約13%、至少約14%、至少約15%，例如至少約16%乙 醇。在上述方面的方法中待加工的淀粉可以特別地來自塊莖、根、莖、豆類、谷物或整 個谷粒。更具體地，顆粒淀粉可以獲自玉米、玉米芯、小麥、大麥、黑麥、買羅高梁、西米、木 薯、木薯粉、高粱、稻、豌豆、豆、香蕉或馬鈴薯。還考慮的有蠟質及非蠟質類型的玉米和大麥。上述組合物可用于液化和/或糖化糊化或顆粒的淀粉，和部分糊化的淀粉。部分 糊化的淀粉是糊化一定程度的淀粉，即，其中部分淀粉被不可逆溶脹和糊化，而部分淀粉仍 然以顆粒狀態存在。上述組合物可包含以0. 01-10. OAFAU/g DS 或 0. 1-5. OAFAU/g DS 或 0. 5-3. OAFAU/ A⑶或0. 3-2. OAFAU/g DS的量存在的酸性α-淀粉酶變體。該組合物可用于上述任何淀粉 加工中。如本文所用，名詞或動詞形式的術語“液化”表示將淀粉轉化為鏈長較短且粘性 較小的糊精的過程。通常，此過程包括淀粉的糊化，同時或之后添加桿菌物種TS-23菌株 α-淀粉酶或其變體。也可以添加其他液化誘導酶。如本文所用，術語“初次液化(primary liquefaction) ”是指漿液溫度升至或接近 其糊化溫度時的液化步驟。繼溫度升高之后，使漿液傳送通過熱交換器或噴射器達到溫度 約200-300 T，例如220-235 T。繼應用熱交換器或噴射器溫度之后，使漿液在該溫度保持 為期3-10分鐘。這種保持漿液處于200-300 °F的步驟為初次液化。如本文所用，術語“二次液化”是指繼初次液化(加熱至200_300下)之后，當漿 液被允許冷卻至室溫時的液化步驟。此冷卻步驟可以是30分鐘至180分鐘(3小時)，例如 90分鐘至120分鐘(2小時)。如本文所用，術語“二次液化的分鐘數”是指自二次液化開始時起到測量DE的時間止所經過的時間。另一方面考慮在包含桿菌物種TS-23菌株α-淀粉酶或其變體的組合物中額外應 用β _淀粉酶，β “淀粉酶(EC 3. 2. 1. 2)是外切產麥芽糖淀粉酶，其催化直鏈淀粉、支鏈淀 粉以及相關的葡萄糖聚合物中的1，4-α_糖苷鍵水解，由此釋放麥芽糖。已經從多種植物和微生物中分離到β-淀粉酶(W. Μ. Fogarty和C.T.Kelly， PROGRESS IN INDUSTRIAL MICROBIOLOGY，15 卷，112-115 頁，1979)。這些 β-淀粉 酶的特征在于具有處于40°C至65°C范圍內的最適溫度，以及處于約4. 5至約7. O范 圍內的最適pH。考慮的β-淀粉酶包括但不限于來自大麥SPEZYME BBA 1500、 SPEZYME DBA、OPTIMALT ME、OPTIMALT BBA(Genencor International Inc.)和 N0V0ZYM WBA (Novozymes A/S)的 β -淀粉酶。考慮用于組合物中的另一酶是葡糖淀粉酶(EC 3. 2. 1. 3)。葡糖淀粉酶來自微生物 或植物。示例性葡糖淀粉酶為真菌或細菌來源。示例性細菌葡糖淀粉酶有曲霉屬葡糖淀粉 酶，特別是黑曲霉Gl或G2葡糖淀粉酶(Boel等人，EMBO J. 3 (5) 1097-1102 (1984))或其 變體，例如WO 92/00381和W000/04136中所公開的；泡盛曲霉葡糖淀粉酶(W0 84/02921)； 米曲霉葡糖淀粉酶(Agric. Biol. Chem.，55 (4) :941_949 (1991))或其變體或片段。其他考慮的曲霉屬葡糖淀粉酶變體包括增強熱穩定性的變體G137A和 G139A (Chen 等人(1996)，Prot. Eng. 9 499-505) ；D257E 和 D293E/Q (Chen 等人，Prot. Eng. 8 575-582(1995)) ；N182(Chen 等人，Biochem. J. 301 :275_281 (1994)) ； 二 硫鍵， A246C (Fierobe 等人，Biochemistry, 35 :8698_8704(1996))；和在 A435 和 S436 位引 入Pro殘基(Li等人ProteinEng. 10 1199-1204(1997))。其他考慮的葡糖淀粉酶包 括籃狀菌屬葡糖淀粉酶，特別是來源于埃默森籃狀菌(W0 99/28448), Talaromyces. Ieycettanus (美國專利 No. RE 32，153)、杜邦籃狀菌(Talaromyces. duponti)、嗜熱籃 狀菌(Talaromyces. thermophilics)(美國專利No. 4，587，215)。考慮的細菌葡糖淀 粉酶包括來自梭菌屬(Clostridium)，特別是 C. thermoamylolyticum (EP135138)和 C. thermohydrosulfuricum(ffO 86/01831)的葡糖淀粉酶。葡糖淀粉酶的示例包括來源于 米曲霉的葡糖淀粉酶。還考慮商業葡糖淀粉酶，例如AMG 200L、AMG 300L、SAN SUPER和 AMG E(Novozymes) ；0PTIDEX. 300 (購自 Genencor International Inc.) ；AMIGASE 禾口 AMIGASE PLUS (DSM) ；G_ZYME G900 (Enzyme Bio-Systems) ；G_ZYME G990ZR (黑曲霉葡 糖淀粉酶和低蛋白酶含量)。可以以0. 02-2. OAGU/g DS 或 0. 1-1. OAGU/g DS(例如 0. 2AGU/g DS)的量加入葡 糖淀粉酶。組合物中可包含其他酶和酶變體。除了桿菌物種TS-23菌株α -淀粉酶或其變體， 可以使用一種或多種α “淀粉酶，或可以進一步包括本文討論的其他酶。可以任選加入的另一種酶是脫支酶，例如異淀粉酶(EC 3. 2. 1. 68)或支鏈淀粉酶 (EC 3.2.1.41)。異淀粉酶水解支鏈淀粉和極限糊精中的a-l，6-D-糖苷分支鍵，并且 通過異淀粉酶不能攻擊普魯分支葡聚糖及其對a-極限糊精的有限作用而能夠與支鏈淀 粉酶區別開來。可以按本領域技術人員熟知的有效量加入脫支酶。所述方法的產物的確切組成取決于所應用的酶組合以及所加工的顆粒淀粉的類 型。例如，可溶水解產物可以是純度為至少約85 %、至少約90 %、至少約95. O %、至少約95. 5%、至少約96. 0%、至少約96. 5%、至少約97. 0%、至少約97. 5%、至少約98. 0%、至少 約98. 5、至少約99. 0%或至少約99. 5%的麥芽糖。備選地，可溶淀粉水解產物可以是葡萄 糖，或者淀粉水解物具有至少94. 5 %、至少95.0%、至少95.5%、至少96. 0 %、至少96. 5 %、 至少97. 0 %、至少97. 5 %、至少98. 0 %、至少98. 5、至少99. 0 %或至少99. 5 %的DX (葡萄 糖占總溶解的干固形物的百分比)。該方法可包括特制糖漿產物，例如用于生產冰淇淋、蛋 糕、糖果、水果罐頭的包含葡萄糖、麥芽糖、DP3和DPn的混合物的特制糖漿。兩種碾磨方法是濕磨法和干磨法。在干磨法中，碾磨和使用整個谷粒。濕磨法提 供胚芽和粉(淀粉顆粒和蛋白質)的良好分離，當淀粉水解產物用于糖漿生產時通常使用 這種方法。干磨法和濕磨法均為淀粉加工領域公知，且同等地考慮與所公開的組合物和方 法一起使用。所述方法可在超濾體系中進行，其中保留物在酶、粗淀粉和水的存在下保持再 循環，且其中透過物為可溶淀粉水解產物。同等考慮的是在具有超濾膜的連續膜反應器中 進行的方法，其中保留物在酶、粗淀粉和水的存在下保持再循環，且其中透過物為可溶淀粉 水解產物。同樣考慮的是在具有微過濾膜的連續膜反應器中進行的方法，其中保留物在酶、 粗淀粉和水的存在下保持再循環，且其中透過物為可溶淀粉水解產物。一方面，將該方法的可溶淀粉水解產物轉化為基于高果糖淀粉的糖漿(HFSS)，例 如高果糖玉米糖漿(HFCS)。這種轉化可利用葡萄糖異構酶，以及通過是固定在固相支持物 上的固定葡萄糖異構酶實現。所考慮的異構酶包括商品SWEETZYME ,IT(N0V0ZymeS A/S)； G-ZYME IMGI 和 G-ZYME G993，KETOMAX , G-ZYME G993 (Rhodia)，G-ZYME G993 液 體和 GENSWEET IGI (Genencor 國際公司)。另一方面，這些方法所生產的可溶淀粉水解產物可用于出產燃料或飲用乙醇。在 第三方面的方法中，發酵可以與顆粒淀粉漿的水解同時或分開/相繼進行。當發酵與水解 同時進行時，溫度可以在30°C _35°C之間，尤其是31°C -34°C之間。該方法可以在超濾體系 中進行，其中保留物在酶、粗淀粉、酵母、酵母營養物和水的存在下保持再循環，且其中透過 物為含乙醇的液體。同等考慮的是在具有超濾膜的連續膜反應器中進行的方法，其中保留 物在酶、粗淀粉、酵母、酵母營養物和水的存在下保持再循環，且其中透過物為含乙醇的液 體。所述方法的可溶淀粉水解產物也可以用于發酵產品的生產，其包括將所處理的淀 粉發酵成發酵產品，例如檸檬酸、谷氨酸單鈉、葡糖酸、葡糖酸鈉、葡糖酸鈣、葡糖酸鉀、葡糖 酸S-內酯或異抗壞血酸鈉。桿菌物種TS-23菌株α _淀粉酶或其變體的淀粉水解活性例如可以利用馬鈴薯淀 粉作為底物來測定。此方法基于該酶對改性馬鈴薯淀粉的降解，且反應后接著將淀粉/酶 溶液樣品與碘溶液混合。最初形成黑藍色，但是在淀粉降解期間，藍色變弱，逐漸變成紅棕 色，將其與有色玻璃標準進行比較。5.方法5. 1過濾篩選實驗下面討論的實驗可用于篩選與親本α -淀粉酶相比，在高或低ρΗ和/或在Ca2+衰 竭條件下具有改變的穩定性的AmyTS23 α -淀粉酶變體。5. 2高ρΗ濾膜篩選實驗于37°C，將桿菌屬物種庫平板接種在含有10微克/毫升卡那霉素的TY瓊脂平板
46上的多層醋酸纖維素(0E 67，Schleicher&Schuell，Dassel，Germany)和硝酸纖維素濾膜 (Protran-Ba 85，Schleicher&Schuell，Dassel, Germany)上至少 21 小時。醋酸纖維素層 位于TY瓊脂平板上。平板接種后但是在孵育之前用針特別標記各個濾膜夾層，以便能夠在濾膜上 定位陽性變體，將帶有結合變體的硝酸纖維素濾膜轉移到含有甘氨酸-NaOH緩沖液， pH8. 6-10. 6的容器中并室溫(可在10-60°C間變化)孵育15分鐘。帶有菌落的醋酸纖維 素濾膜在室溫下儲存于TY平板上，直至使用。孵育之后，在含有1 %瓊脂糖、0. 2 %淀粉的甘 氨酸-NaOH緩沖液(pHS.6-10.6)的平板上檢測殘余的活性。帶有硝酸纖維素濾膜的實驗 板以與上述濾膜夾層同樣的方式標記，并在室溫下孵育2小時。去除濾膜后，用10%復方碘 溶液(Lugol solution)對實驗板染色。在暗藍色背景下，降解淀粉的變體檢測為白色斑點 并然后在儲存板上鑒定出。在與第一次篩選同樣的條件下重新篩選兩次陽性變體。5. 3低鈣濾膜篩選實驗于37°C，在含有相關抗生素(例如卡那霉素或氯霉素)的TY瓊脂平板上的多層醋 酸纖維素(0E 67, Schleicher&Schuel 1, Dassel, Germany)和硝酸纖維素濾膜(Protran-Ba 85，Schleicher&Schuell, Dassel, Germany)上平板接種桿菌屬物種庫至少21小時。醋酸 纖維素層位于TY瓊脂平板上。平板接種后但是在孵育之前用針特別標記各個濾膜夾層，以便能夠在濾膜上定 位陽性變體，將帶有結合變體的硝酸纖維素濾膜轉移到含有碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液， pH8. 5-10，具有不同EDTA濃度(0. OOlmM-IOOmM)的容器中。將濾膜室溫下孵育1小時。帶 有菌落的醋酸纖維素濾膜在室溫下儲存于TY平板上，直至使用。孵育之后，在含有1 %瓊脂 糖、0.2%淀粉的碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(pH8.5-10)的平板上檢測殘余的活性。帶有硝 酸纖維素濾膜的實驗板以與上述濾膜夾層同樣的方式標記，并在室溫下孵育2小時。去除 濾膜后，用10%復方碘溶液(Lugol solution)對實驗板染色。在暗藍色背景下，降解淀粉 的變體檢測為白色斑點并然后在儲存板上鑒定出。在與第一次篩選同樣的條件下重新篩選 兩次陽性變體。5. 4低pH篩選濾膜實驗于37°C在含有10微克/毫升氯霉素的TY瓊脂平板上多層醋酸纖維素(0E 67，Schleicher&Schuell，Dassel, Germany)禾口 肖酸纖維素濾膜(Protran-Ba 85， Schleicher&Schuell, Dassel, Germany)上平板接種桿菌屬物種庫,至少21小時。醋酸纖 維素層位于TY瓊脂平板上。在平板接種后但是孵育之前用針特別標記各個濾膜夾層，以便將陽性變體定位在 濾膜上，帶有結合變體的硝酸纖維素濾膜被轉移到含有檸檬酸鹽緩沖液，PH4. 5的容器中并 80°C孵育20分鐘(當在野生型背景(backbone)下篩選變體時)或85°C孵育60分鐘(當 篩選親本α-淀粉酶的變體時)。帶有菌落的醋酸纖維素濾膜在室溫下儲存于TY平板上， 直至使用。孵育之后，在含有瓊脂糖、0. 2%淀粉的檸檬酸鹽緩沖液(ρΗ6. 0)的實驗平板 上檢測殘余的活性。帶有硝酸纖維素濾膜的實驗板以與上述濾膜夾層同樣的方式標記，并 在50°C下孵育2小時。去除濾膜后，用10%復方碘溶液對實驗板染色。在暗藍色背景下， 降解淀粉的變體檢測為白色斑點并然后在儲存板上鑒定出。在與第一次篩選同樣的條件下 重新篩選兩次陽性變體。
5. 5 二次篩選從儲存板上挑出重篩選后的陽性轉化體并在二次平板篩選中檢測。37°C下陽性轉 化體在5mL的LB+氯霉素中生長22小時。各個陽性轉化體和作為對照表達相應背景的克 隆的桿菌屬培養物在檸檬酸鹽緩沖液(PH4.5)中于90°C下孵育，在0、10、20、30、40、60和 80分鐘時取樣。在實驗板上點3yL樣品。用10%復方碘溶液對實驗板染色。改善的變體 視為與背景相比具有更高殘余活性(在實驗板上檢測為暈斑)的變體。用核苷酸測序來確 定該改善的變體。5. 6未純化變體的穩定性實驗變體的穩定性可以用如下方法檢測表達要分析的變體的桿菌屬培養物在IOml LB+氯霉素中于37°C下生長21小時。800 μ L培養物與200 μ L檸檬酸鹽緩沖液(ρΗ4. 5)混 合。對應于樣品時間點數的多個70 μ L等分樣品在PCR管中制備，并于在PCR儀中于70°C 或90°C孵育不同時間(通常是5、10、15、20、25和30分鐘)。0分鐘樣品不在高溫下孵育。 通過轉移20 μ L樣品至200 μ L的α -淀粉酶PNP-G7底物MPR3 (Boehringer Mannheim目 錄號1660730)中來測定樣品活性，如下面“α-淀粉酶活性測定”部分所述。結果以百分比 活性(相對于0分鐘時間點的活性)對時間作圖，或者描述為在孵育一定時間之后殘余活 性百分比。5.7α-淀粉酶變體的發酵和純化如下所述發酵和純化包含相關表達質粒的枯草芽孢桿菌菌株將從-80°C儲存的 儲液中取出的菌株劃線接種于含有10微克/毫升卡那霉素的LB瓊脂板上，37°C下過夜生 長。菌落轉移至500mL搖瓶中的補充有10微克/毫升氯霉素的IOOmL PS-I培養基中。PS-I培養基的成分顆粒糖(Pearlsugar) 100g/l大豆粉40g/lNa2HPO4,12H2010g/lPluronic PE 6100 0.lg/1CaCO35g/l培養物在37°C下以270rpm振蕩培養5天。4500rpm離心20_25分鐘，從發酵液中去除細胞和細胞碎片。過濾上清得到完全 清澈的溶液。濃縮濾液并在UF-過濾器(10000截留膜)上洗滌，緩沖液換為20mM醋酸鹽 緩沖液，PH5.5。將UF-過濾液上樣到S-瓊脂糖F. F.上，用含0. 2MNaCl的同樣緩沖液階段 洗脫。用IOmM Tris,pH9. 0透析洗脫液，并將洗脫液上樣到Q-瓊脂糖F. F.，用從0到0. 3M 的NaCl的線性梯度以6個柱體積洗脫。收集含有活性(用Phadebas實驗測量)的級分， 將PH調至pH7. 5，通過0. 5% ff/vol.活性炭處理5分鐘來去除剩余的顏色。5. 8比活性測定用PHADEBAS 實驗(Pharmacia)測定比活性，記作“活性/毫克酶”。遵循廠商的 說明書(還參見下文“ α -淀粉酶活性測定”)。5. 9等電點測定用等電聚焦法測定pi (例如 Pharmacia，Ampholine, pH3. 5-9. 3)。5. 10增加的穩定性測定
在50ml丙烯管中加入IOml目的洗滌劑。對AmyTS23t和AmyTS23t Δ RS適當稀 釋，以將其吸入含有該洗滌劑的各個管中后，各自以180ppm測量。帶有各個突變酶的洗滌 劑渦旋30秒，然后置于RotaMix(ATR RKVS Model)上10分鐘。吸取100微升含有突變酶 的洗滌劑，以1 651稀釋。突變體的初始活性用嵌段的P-硝基-苯基-麥芽糖庚糖(Bi ockedP-Nitro-Phenyl-Maltoh印taose(嵌段的 PBNPG7))底物在 Konelab，Model2OXT 上檢 測。然后將洗滌劑樣品在設置為37°C的恒溫孵育器中孵育。在第1、2、4、7和17天取出樣 品，檢測酶活性。5.11α-淀粉酶活性測定5. 11. 1 Phadebas 實驗以使用PHADEBAS 片作為底物的方法測定α -淀粉酶活性。Phadebas片 (PHADEBASi 淀粉酶檢測，Pharmacia Diagnostic提供)含有交聯的不可溶藍色淀粉聚合 物，其已經與牛血清白蛋白和緩沖物質混合并壓片。對于每個單獨測量，在含有5ml 50mM Britton-Robinson緩沖液(50mM乙酸，50mM 磷酸，50mM硼酸，0. ImM CaCl2，用NaOH調至所需pH值)的管中懸浮一片。該檢測在目的 溫度的水浴中進行。要檢測的α-淀粉酶在X ml的50mM Britton-Robinson緩沖液中稀 釋。Iml該α -淀粉酶溶液加入到5ml 50mM Britton-Robinson緩沖液中。該α -淀粉酶 水解淀粉，得到可溶的藍色片段。用分光光度計在620nm測量得到的藍色溶液的吸光度是 該α-淀粉酶活性的函數。重要的是在10或15分鐘(檢測時間)孵育后測得的620nm吸光度處于620nm 的0.2-2. O吸光度單位范圍內。在這個吸光度范圍內，在活性和吸光度之間有線性關系 (Lambert-beer定律)。因此酶的稀釋必須調節為符合該標準。在指定條件(溫度、pH、反應 時間、緩沖條件)設置下，Img的給定α-淀粉酶將水解一定量的底物而且會產生藍色。在 620nm測量顏色強度。測得的吸光度與所測α -淀粉酶在給定的條件設置下的比活性(活 性/mg純α -淀粉酶蛋白)正好成比例。5. 11. 2備選方法α -淀粉酶活性用使用PNP-G7底物的方法測定。PNP-G7是對-硝基苯基-α -D-麥 芽庚糖苷的縮寫，是能夠被內切淀粉酶裂解的嵌段寡糖。裂解之后，試劑盒中包含的 α-葡糖苷酶消化該底物，釋放游離的PNP分子，PNP分子是黃色的，因此能夠在λ = 405nm(400-420nm)被可見分光光度法檢測。含有PNP-G7底物和α-葡糖苷酶的試劑盒由 Boehringer-Mannheim ^zfe (貨號 1054635)。為了制備該試劑溶液，按照生產者的建議，IOml的底物/緩沖液加入到50ml酶/ 緩沖液中。將20微升樣品轉移至96孔微滴定板，在25°C孵育來進行該檢測。加入在25°C 預平衡的200微升試劑溶液。混合溶液，并預孵育1分鐘，在酶標儀上4分鐘內每30秒在 OD 405nm測量一次吸光度。時間相關的吸光度曲線的斜率直接與給定條件設置下所實驗的α -淀粉酶的活 性成比例。5. 12洗滌劑組合物中酶性能的測定5. 12. 1美國條件使用Terg-o-tometer，美國檢測中心，Hoboken，新澤西州——為了模擬美國洗衣
49條件下的洗滌檢測，在20°C下用標準洗滌劑，如不含熒光增白劑的液體AATCC2003和/或粉 末AATCC1993(美國紡織品化學和色彩協會)，測量目的突變酶的劑量效率曲線(DEC)。然 后測定相當的α-淀粉酶的相應DEC來比較本發明突變酶的污漬去除性能。40°C下重復 該過程。通常，將4個CS-28稻米淀粉污染(荷蘭CFT)的樣品置于Terg-o-tometer的鋼 容器中，其中充滿了 1升去離子水和1.5g的液體AATCC。當使用粉末AATCC時，用分析天 平(Model PM4800, Mettler Instrument Corp. , Highstown, N. J. 08520)稱取 1. 5g 該洗滌 劑粉末，然后加入到Terg-o-tometer中。同時重復進行兩次檢測。除非另外說明，該檢測 進行12分鐘，洗滌3分鐘。洗滌之后，空氣干燥該樣品，用Konica Minolta生產的Chroma Meter Model CR-410測定所測試樣品的反射比。用適宜的統計分析處理收集的數據。5. 12. 2歐洲條件使用Launder-0-meter，Atlas公司制造，喬治亞州亞特蘭大——為了模擬歐洲洗 滌條件下的洗滌測試，在40°C下用標準歐洲測試洗滌劑，IECA和含漂白劑(TAED-四乙酰 基乙二胺乙酸鹽)和過硼酸鈉的IEC A，測量目的突變酶的劑量效率曲線(DEC)。然后測定 相當的突變酶的相應DEC曲線來比較本發明的突變酶的污漬去除性能。如果需要，在更高 洗滌溫度下重復該過程。通常，四個EMPA 161，玉米淀粉(EMPA，瑞士)樣品置于鋼容器中， 其中含有250ml含有6. 8g/L IEC A洗滌劑或8. 0g/L含有漂白劑的IEC A洗滌劑的去離子 水。同時重復進行兩次檢測。除非另外說明，該檢測進行45分鐘，洗滌5分鐘。洗滌之后， 空氣干燥該樣品，用Chroma Meter Model CR-410測定所測試樣品的反射比。用適宜的統 計分析處理收集的數據。5. 12. 3評估洗滌劑組合物的微樣品方法存在許多種α-淀粉酶清潔測定法。檢測清潔的示例性描述包括如下內容。“樣品”是一塊材料，例如其上施有污漬的織物。該材料可以是例如由棉、聚酯或 天然和合成纖維的混合物制成的織物。該樣品還可以是紙，例如濾紙或硝化纖維素，或者是 一塊硬材料，例如陶瓷、金屬或玻璃。對于α-淀粉酶，污漬是基于淀粉的，但是也可以包括 血液、乳、墨水、草、茶、酒、菠菜、肉汁、巧克力、蛋、奶酪、粘土、色素、油或這些化合物的混合 物。“小樣品”是自樣品上用單孔穿孔裝置切下的部分，或者用定制的96孔穿孔裝置 (該多孔穿孔模式與標準96孔微滴定板匹配)切下的部分，或者是以其它方式自樣品上取 下的部分。樣品可以是紡織品、紙、金屬或其他適宜的材料。小樣品可以在放入24孔、48孔 或96孔微滴定板的孔之前或之后被污物固著。“小樣品”也可以通過向小塊材料施加污物 而制成。例如，小樣品可以是直徑為5/8”或0.25”的污染的織物片。定制的穿孔機經設計 可以同時將96個樣品遞送至96孔板的所有孔中。該裝置可以通過簡單地向同一 96孔板 多次上樣，而向每孔遞送一個以上的樣品。可以想到將多孔穿孔裝置用于向任何規格的板 (包括但不限于24孔、48孔和96孔板)同時遞送樣品。另一可想到的方法中，污染的測試 平臺可以是由金屬、塑料、玻璃、陶瓷，或其他適宜材料形成的、被污物底物包覆的珠，其用 于測試用于紡織品以外材料的清潔組合物。然后將一個或多個污物包覆的珠放入含有適宜 緩沖液和酶的96孔、48孔或24孔板的孔中或更大形式的板的孔中。這種情況下，可以通 過直接吸光度測量或在二級生色反應后在上清液中檢測釋放的污物。也可以通過質譜分析 來進行釋放的污染物的分析。進一步的微篩選測定可以是將樣品(例如靛藍染色的粗斜棉布織物)遞送并固定到多孔板的孔中，并加入顆粒，例如沙子或者更大的顆粒，例如篩成包 括6-8或9號規格的石粒，并振蕩該多孔板，以使通過加入的顆粒對樣品形成磨損。該測定 可用于在石洗應用中的纖維素酶的評價中。酶的有效性可以通過顏色釋放到反應緩沖液中 (例如釋放的靛藍溶解于二甲基亞砜中，測量A6tltl的吸光度)或磨損樣品的反射比測定來判定。當例如未處理的BMI (血液/牛奶/墨水)樣品在沒有漂白劑的洗滌劑中洗滌時， 大比例的墨水即使沒有蛋白酶的幫助也會釋放。加入蛋白酶導致墨水釋放的小量增加，這 種增加在大背景下難以定量。本發明的一方面提供了使人可以控制污漬的固著程度的處理 方案。結果是，可以產生例如當在不存在被檢測的酶的情況下進行洗滌時能釋放出不等量 的污漬的樣品。固著的樣品的使用導致在洗滌試驗中信噪比的顯著提高。此外，通過改變 固著程度，可以產生在不同清潔條件下給出最佳結果的污漬。在多種材料類型上具有已知“強度”的污漬的樣品是市售可得的(EMPA， St. Gallen, Switzerland ；wfk—Testgewebe GmbH, Krefeld Germany ；或 Center for Test Materials, Vlaardingen, The Netherlands)和 / 或可以由從業者制得(Morris 和 Prato， Textile Research Journal 52(4) :280286 (1982))。其他檢測樣品包括但不限于含棉織物 上的血液/牛奶/墨水(BMI)污漬，含棉織物上的菠菜污漬，或含棉織物上的草漬，和含棉 織物上的巧克力/牛奶/煙灰污漬。可以用0.0003%至0.3%的過氧化氫將BMI污漬固著在棉上。其他組合包括用 0. 001% -1%戊二醛固著的草漬或菠菜漬、用0. 001%-1%戊二醛固著的明膠和考馬斯亮 蘭染料、或用0.001% -1%戊二醛固著的巧克力、牛奶和煙灰。也可以在用酶和/或洗滌劑制劑孵育期間攪拌樣品。洗滌性能數據取決于孔中， 尤其是在96孔板中的樣品的取向(水平對垂直)。這表明在孵育期間混合是不充分的。盡 管存在許多方式來保證孵育期間充分的攪拌，但可以構建將微滴定板夾在兩個鋁板之間的 板夾。這可以簡單地例如在孔上方放置粘性板密封物，然后用任何類型的適合的、市售可得 的夾子將兩個鋁板與96孔板夾緊而實現。然后可以將它放到商品化的孵育搖床中。將搖 床設定為約400轉/分鐘可以導致非常有效的混合，而板夾有效地阻止了泄漏或交叉污染。可以使用三硝基苯磺酸(TNBS)來量化洗液中的氨基濃度。這可以用作從 樣品中去除的蛋白質量的量度(參見例如Cayot和Tainturier, Anal. Biochem. 249 184-200(1997))。然而，如果洗滌劑或酶樣品導致異乎尋常的小肽片段的形成(例如，因樣 品中存在肽酶所致)，那么人們將獲得較大的TNBS信號，即更多“噪音”。另一種測定對血液/牛奶/墨水或其他污漬的洗滌性能的方式基于墨水的釋放。 樣品上蛋白質的蛋白水解導致墨水顆粒的釋放，能夠通過測量洗液的吸光度來定量。可以 在350和800nm之間的任何波長測量吸光度。測量波長為410nm或620nm。也可以檢查洗 液以確定對于含有草、菠菜、明膠或考馬斯亮蘭的污漬的洗滌性能。對于這些污漬，示例性 的波長包括對于菠菜污漬或草污漬的670nm和對于明膠污漬或考馬斯亮蘭污漬的620nm。 例如，移出等份試樣的洗液(例如，通常來自96孔微板的100-150 μ L)并放到小杯或微孔 微板中。然后將它放到分光光度計中并在適當的波長讀取吸光度。也可以使用該體系，例如通過使用在諸如布、塑料或陶瓷的適宜底物上的血液/ 乳/墨水污漬，來測定用于餐具洗滌的強化的酶和/或洗滌劑組合物。
一方面，通過在25°C將0. 3%過氧化氫施用于BMI/棉樣品30分鐘，或通過在60°C 將0. 03%過氧化氫施用于BMI/棉樣品30分鐘來將BMI污漬固定于棉上。從上述BMI/棉 樣品切下大約0. 25”的小樣品，置于96孔微滴定板的孔中。向各孔中放入已知的洗滌劑組 合物和酶如變體蛋白質的混合物。向微滴定板頂部放置粘性板密封物后，將微滴定板與鋁 板夾在一起，并在定軌搖床上以約250轉/分鐘攪拌約10-60分鐘。這個時間結束后，將上 清液轉移到新的微滴定板的孔中并測量620nm的墨水吸光度。相似地，可以對固著于棉的 菠菜污漬或草污漬進行檢測，該污漬通過在25°C對菠菜/棉樣品或草/棉樣品施用0. 01 % 戊二醛30分鐘來固著。同樣也可以對巧克力、牛奶和/或煙灰污漬檢測。其他血液/牛奶 /墨水檢測和條件記載于美國專利7，122，334中(Genencor International, Inc.)。5. 13 LAS敏感度測定在40°C下將變體與不同濃度的LAS(線性烷基苯磺酸酯；Nansa 1169/P)孵育10 分鐘。用Phadebas 測量法或使用PNP-G7底物的其他方法測定殘余活性。在0. 1M，pH7. 5的磷酸鹽緩沖液中稀釋LAS。使用下列濃度500ppm、250ppm、100ppm、50ppm、25ppm 和 IOppm 或無 LAS。在總體積IOml中，在不同的LAS緩沖液中將變體稀釋至0. 01_5mg/l的濃度，并在 溫控水浴中孵育10分鐘。通過轉移小等分試樣至冷檢測緩沖液中來停止孵育。重要的是， 在活性測量期間，LAS濃度低于lppm，以免影響該活性測量。然后用上述PHADEBAS 測量法或其他方法，測定殘余活性，對每樣品一式兩份測定。減去空白后測定活性。無LAS的活性為100%。本申請組織為多個部分，以易于閱讀；但是，讀者應理解在一個部分中的描述可以 用于其他部分中。以這種方式，用于本公開的不同部分的標題不應被理解為限制。為了進一步說明本發明的組合物和方法及其優勢，給出了下列具體實施例。應理 解的是，這些實施例僅僅是為了說明本發明的組合物和方法而提供，而不應理解為以任何 方式對其范圍的限制。實施例在整個說明書中，使用了下列縮寫(重量百分比)；°C (攝氏度)；H20(7JO ； dH20或DI (去離子水)；dIH20(去離子水，Milli-Q過濾)；g或gm(克)；Pg(微克)；mg(毫 克)；kg(千克)；μ 1和PL(微升)；mL和ml (毫升)；mm(毫米)；μπι(微米)；M(摩爾 每升)；mM(毫摩爾每升)；μΜ(微摩爾每升)；U(單位)；麗(分子量)；sec(秒)；min(s) (分鐘)；hr(s)(小時)；DO(溶解氧)；W/V(重量體積比)；W/W(重量比)；V/V(體積比)； Genencor (Danisco US Inc，Genencor部，加利福尼亞州帕洛阿爾托)；Ncm(牛頓厘米)和 ETOH(乙醇)；eq(等價物)；N(正常的(normal)) ；ds或DS(干固體含量)。實施例1AmyTS23在枯草芽孢桿菌中的表達為了檢測AmyTS23全長的表達，如圖3所示的合成DNA序列(德國雷根斯堡 Geneart制備)克隆到pHPLT載體(參見例如W02005111203和Solingen等人(2001)Extremophiles 5:333-341)中LAT(地衣芽孢桿菌淀粉酶)啟動子之后，并以與編碼LAT 信號肽屬于相同讀碼框的方式融合(圖5)，并轉化到9個蛋白酶缺失的枯草芽孢桿菌 株(degUHy32, oppA, AspoII3501, amyE: xyl RPxyl AcomK-ermC, Δ aprE, Δ nprE, Aepr, Δ ispA, Abpr, Avpr, AwprA, Ampr-ybfJ, AnprB)(參見例如 US
發明者B·E·瓊斯, C·卓依, C·常, C·弗勒門, C·萊夫朗, J·T·小凱爾特斯, L·卡斯考佩雷拉, M·埃斯塔布魯克, M·科爾克曼, W·韋勒 申請人:丹尼斯科美國公司