專利名稱：治療血友病的含Ⅷ因子和IXa因子的組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及治療血友病的組合物。
具體地，本發明涉及含FIXa和FVIII的組合物在制備治療A型血友病或B型血友病受試者的組合物中的用途。
背景技術：
血液凝集過程涉及一系列稱為血液凝集蛋白的蛋白質，它們以級聯式反應起作用以引起血液凝塊的形成。
血液凝集的分子機制以及參與凝集過程的成分在數篇綜述性文獻中有詳細的描述(Furie，B.and Furie，B.C.，Cell 53(1988)505-518；Davie，E.W.et al.，Biochem.30(1991)10363-10379；Bergmeyer，H.U.(ed.)Methods of Enzymatic Analysis，Vol.V，chapter 3，3rd ed.，Academic Press，New York(1983))。
血友病是人類和其它哺乳動物疾病，其中體內的一個編碼血液凝集因子的基因含有突變而使編碼的蛋白在級聯過程中不能發揮正常的作用。
A型血友病是該紊亂最常見的類型，為X染色體連鎖的隱性出血紊亂，是由于凝集VIII因子活性的缺乏而引起。發病個體可發生關節和肌肉出血、易擦傷和傷口出血時間過長等各種表現型。該紊亂是由圖譜定位在Xq28的VIII因子基因中雜合突變(heterogeneousmutations)引起。盡管VIII因子突變具有雜合性(heterogeneity)，可通過對選定突變(尤其是反轉)的直接檢測來進行對攜帶者的檢測和出生前診斷，也可通過連鎖分析進行間接檢測。利用來自人血漿的各種制備物或重組技術來進行VIII因子的置換。在大多數情況下，置換治療是有效的，而有10-25％的治療個體產生中和抗體而影響療效。常規治療A型血友病的主要方法是灌輸VIII因子，其量是恢復VIII因子至治療水平所需的量。由于VIII因子的半衰期是11-16小時，因此有時需要每天灌輸兩次。
B型血友病作為遺傳疾病，其特征為編碼血液凝集蛋白-因子IX的基因發生突變。因子IX的綜述可參見High等(1995，″Factor IX″，于Molecular Basis of Thrombosis and Hemostasis，High andRoberts，eds.，Marcel Dekker，Inc.)。
在1936年，Patek和Stetson(J.Clin.Invest.15，531-542)報道血友病可通過VIII因子的置換來糾正。但是，大約15％的血友病病人產生針對VIII因子的抗體(Roberts，(1981)，N.Engl.J.Med.305，757)，這成為治療這些患者的主要障礙。
Barrowcliffe等(1983，J.La b.Clin.Med)報道了治療該類患者的一種形式-FEIBA(Baxter Healthcare Corporation，USA)。FEIBA是源自血漿的蛋白復合物，可與抑制劑一起用于治療A型血友病的病人，這不需要VIII因子而能使血液形成凝塊。
Barrowcliffe等(1981，Thromb.Res.21，181)發現FEIBA中含有的VIII因子的一種形式占抑制劑血漿中體外血液凝集促進活性的30-50％。結果表明，VIII因子可能與IXa因子和磷脂形成復合體而存在，而這種形式可以部分保護其免受與抑制劑的相互作用。Barrowcliffe等(1981)還報道，增加純化的IXa因子和磷脂可保護VIII因子免受隨后的抗體失活作用，而且磷脂起主要保護作用。
本發明尋求提供改進的治療血友病患者的組合物。
發明概述本發明部分地基于如下驚人的發現相對于不含有FIXa的組合物而言，FIXa使得在治療A型血友病或B型血友病的組合物中的FVIII濃度可減少。
因此，第一個方面，本發明涉及FIXa和FVIII在制備治療受試者中的A型血友病或B型血友病的組合物中的用途，其中所述病人中不存在抗-FVIII抗體。
第二個方面，本發明涉及含有FIXa的組合物和含有FVIII的組合物，它們同時，同時但獨立或按順序使用以治療受試者中的A型血友病或B型血友病，其中所述病人中不存在抗-FVIII抗體。
第三個方面，本發明涉及FIXa在制備含有FVIII的治療A型血友病或B型血友病的組合物中的用途，其中FIXa的存在允許相對于不含有FIXa的組合物而言，減少組合物中FVIII的濃度。
第四個方面，本發明涉及一種治療患有A型血友病或B型血友病的受試者的方法，包括給予有需要的受試者含有FIXa和FVIII的組合物，其中所述受試者中不存在抗FVIII抗體。
第五個方面，本發明涉及一種治療患有A型血友病或B型血友病的受試者的方法，包括給予有需要的受試者以含有FIXa和FVIII的組合物，其中所述組合物中含有的FVIII的量低于不含有FIXa的組合物用于治療該受試者所要求的量。
第六個方面，本發明涉及一種強化FVIII的方法，包括將因子FVIII和FIXa混合成組合物的步驟。
本發明的其它方面在權利要求書中和下面的描述和討論中闡述。這些方面在不同的章節標題下闡述。然而，應當理解的是每一章節標題下的教導并不局限于該特定章節標題。
優選地，含有FIXa的組合物中進一步包含磷脂。
優選地，本發明組合物進一步包含磷脂。
優選地，所述組合物給予體內不存在抗-FVIII抗體的受試者。
優選地，FVIII和FIXa通過重組DNA技術產生。
此外，已經提出增加FIXa和磷脂可以減少FVIII的免疫原性，因而減少血友病病人中抗-FVIII抑制劑的產生和/或所述抑制劑發生作用的速度。該推測的基礎是分別在FVIII分子的C2結構域和A2結構域中的磷脂結合區和FIXa結合區是優勢免疫區域，因而通過與相應的配體結合覆蓋這些區域應該減少這些表位的抗原反應。因此，本發明提供一種減少FVIII的免疫原性的方法，包括給病人提供FVIII與FIXa和磷脂的混合物，或同時提供FVIII、FIXa和磷脂。同樣，本發明提供FIXa和磷脂在制備治療血友病受試者的組合物中的應用，其中該組合物用于減少所述受試者對FVIII的免疫反應。
本發明的優點本發明具有諸多優點。這些優點通過下面的描述將變得明顯。
舉例來說，本發明的優點之一是由于提供了商業上有用的組合物。
舉例來說，本發明的又一優點是本發明的治療A型血友病或B型血友病的組合物中要求更低量的VIII因子。因此，本發明的組合物可比現有的治療方式更經濟。
進一步舉例來說，本發明的優點是由于提供了治療A型血友病或B型血友病的另外的治療方法。
進一步舉例來說，本發明的優點是由于提供了治療受試者中的A型血友病或B型血友病的另外的治療方法，其中所述病人中存在有抗-FVIII抗體。
此外，本發明在治療過程中，通過減少天然或重組FVIII的免疫原性而阻止和/或延遲血友病病人中抗-FVIII抗體的產生。我們認為FIXa掩蓋了FVIII的抗原表位，使它在血液循環中的免疫原性降低。
附圖簡要說明

圖1顯示含高濃度FIXa(14nM)的FVIII濃縮物產生凝血酶的情況。A.FVIII濃縮物的劑量反應。濃縮物HP(Mo-Ab)2稀釋成人工FVIII缺乏型血漿，濃度分別為1 、0.125(■)、0.03(▲)、0.005I U/ml(×)、正常血漿(◆)。B.不同FVIII濃縮物產生凝血酶的比較。在人工FVIII缺乏型血漿中添加1IU/ml的FVIII濃縮物。rFVIIIBDD(O)、rFVIIIFL1(■)、rFVIII FL2(▲)、HP(Mo-Ab)1(×)、HP(Mo-Ab)2(*)、HP(Ion--ex)(●)、IP(+)、正常血漿(◆)。
圖2顯示不同的FVIII缺乏型血漿中產生凝血酶的情況。所有缺乏型血漿均為＜0.01IU/ml。正常血漿(◆)，從輸注后4天的病人采集的兩個嚴重的血友病的血漿1(-*-)、2(--*--)、商業購買的血友病血漿(+)、人工耗竭型血漿(0)。
圖3顯示FIXa對凝血酶產生的影響。A.FIXa的濃度對凝血酶產生的影響。兩種不同濃度的FIXa用于激活凝血酶的產生。添加14nM(實線)或0.2nM(虛線)的FIXa濃縮物以起始凝集反應。正常血漿(◆)、血友病血漿(*)。B.在低濃度FIXa時，FVIII濃縮物的劑量反應。HP(Mo-Ab)2稀釋到病人1的血友病血漿中。在FIXa濃度為0.2nM激發凝血酶的產生。正常血漿(◆)、1(●)、0.125(■)、0.03IU/ml(▲)和血友病血漿(*)。
本發明的詳細描述血友病血友病是一類遺傳性出血紊亂，由特定的凝血因子引起，分為A型血友病和B型血友病。
如本文所述，本發明涉及了A型血友病和B型血友病的治療。在高度優選的實施方式中，本發明涉及A型血友病的治療。
A型血友病關于A型血友病的常規教導可參見Semin ThrombHemost(2002)28(3)309-22；Mol Pathol(2002)55(2)，127-44；Baillieres Clin Haematol(1996)9(2)211-28；Hum Mutat(1995)5(1)1-22；以及Adv Hum Genet(1988)1727-59；0｀Brien D P，Tuddenham E G D，The structure and function of factor VIII.于”Haemostasis&thrombosis”，Ed Bloom A，Forbes C D，ThomasD P，Tuddenham E G D，ChurchillLivingstone，1993，333-348。
Victor A.McKusick等在http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim上提供了關于A型血友病的背景知識。下面關于血友病的信息是從該來源選擇和摘抄的A型血友病是X連鎖的、隱性的出血紊亂，是由凝血VIII因子活性的缺陷引起的。發病個體可產生關節和肌肉出血、易擦傷和傷口出血時間過長等各種表現型。該疾病是由圖譜定位在Xq28的VIII因子基因中雜合突變引起。盡管VIII因子突變具有雜合性，攜帶者的檢測和出生前診斷可通過對選定突變(尤其是反轉)的直接檢測來進行，也可通過連鎖分析進行間接檢測。利用來自人血漿的各種制備物或重組技術來進行VIII因子的置換。在大多數情況下，置換治療是有效的，而有10-25％的治療個體產生中和抗體而影響療效。
發病個體產生關節和肌肉出血、易擦傷和傷口出血時間過長等各種表現型。A型血友病和B型血友病的臨床表現具有相似性，而只能通過分析VIII因子和IX因子的活性來區分。相反，von Willebrand病更經常存在有黏膜與皮膚的或胃與腸的出血或者月經過多。診斷中采用的檢查方法包括出血時間、血小板凝集及VIII因子和vonWillebrand因子分析。
A型血友病中出血嚴重性和頻率與剩余的VIII因子的量負相關(＜1％為嚴重；2-5％為中等嚴重；5-30％為輕微)。
A型血友病是由抗血友病球蛋白(VIII因子)遺傳缺陷引起。VIII因子的分子量為330 000，其在血漿中循環的濃度為100ng/ml，可與von Willebrand因子(VWF)非共價結合，后者起穩定劑和載體蛋白的作用。其主要在肝中合成。VWF在血漿中循環的濃度為5-10μg/ml，單體的分子量為250 000，但在循環中的形式是分子量最多2千萬的一系列多聚體。VIII因子由在Xq28上的VIII因子基因所編碼，而影響出血時間和血小板瑞斯托菌素(ristocetin)凝集的νWF由染色體12上的一個基因編碼。
常規治療A型血友病的主要方法是灌輸VIII因子，其用量為恢復VIII因子的活性至治療水平的量。由于VIII因子的半衰期是11-16小時，因此有時需要每天灌輸兩次。
B型血友病關于B型血友病的常規教導可參見Mol Pathol(2002)55(2)，127-44；Baillieres Clin Haema tol.(1996)9(2)211-28；Adv Hum Genet(1988)1727-59以及Haemophilia(1998)4(4)350-7。
B型血友病的特征是IX因子的缺陷，該病在受傷和外科手術等之后產生出血延長，初次出血終止后重新出血和滯后出血。嚴重的B型血友病中，最常見的癥狀是自發的關節出血。
診斷的年齡和出血現象(episodes)的頻率與因子IX的凝集活性有關。嚴重的B型血友病病人通常在出生第一年被診斷出來。若不進行治療，每月病人平均有2至5次自發性出血現象。中等嚴重的B型血友病的病人很少自發性出血，然而在相對輕微的外傷之后確實發生延長出血或滯后出血，通常在5-6歲前診斷出來。出血現象的頻率在每月一次至每年一次之間變化。輕微的B型血友病的病人也不發生自發性出血，然而，若不進行治療，在進行外科手術、拔牙和嚴重受傷的情況下會發生不正常出血。出血的頻率在每年一次至每十年一次之間變化。輕微的B型血友病的病人通常在歲數較大后才被診斷出來。在任何病人中，出血現象在兒童和青少年時可能比成年時更頻繁。
在IX因子凝集活性低的個體中確立了B型血友病的診斷。對IX因子基因(染色體座位為Xq27.1-q27.2)進行的分子遺傳檢測在超過99％的B型血友病的病人中鑒定出引起疾病的突變。
IXa因子在此處，術語“IXa因子”包括任何功能性IXa蛋白或其片段，包括任何重組、雜交或修飾形式的IXa因子。
雜交或修飾形式的IXa因子包括包含IXa因子氨基酸序列的任何功能性IXa因子蛋白或其片段-例如，來源于哺乳動物(例如人和動物)的IXa因子氨基酸序列。
IXa因子(FIXa)是從其無活性的前體，即因子IX，通過XIa因子或組織因子/VIIa因子/磷脂復合體的蛋白裂解產生的。所述活化產生于對IX因子分子的兩個肽鍵進行的切割，釋放出活化糖肽，其表觀分子量為10 000。IXa因子的重鏈(Mr＝28000)包含絲氨酸蛋白酶催化結構域，而輕鏈(Mr＝17 000)含有膜結合結構域。
IXa因子對IX因子的活化可參見綜述文獻Trends CardiovascMed(2000)，10(5)，198-204。
IXa因子作為絲氨酸蛋白酶發揮功能，參與了酶原(zymogen)X因子的活化以形成酶Xa因子。
根據本發明，IXa因子也可是天然存在的IXa因子的修飾形式-例如，化學修飾形式。IXa因子可以是任何重組形式的IXa因子-例如突變形式的IXa因子。如果利用修飾形式的IXa因子，則該修飾形式通常相對于天然形式具有優點。這些特性可以包括例如增加的穩定性、增加的活性、易于制備或降低制備成本等。
IXa因子可通過各種已知的方法來制備。例如，IXa因子可通過用XIa因子活化由高純度的IX因子來制備。IXa因子可進一步通過凝膠過濾，繼而免疫親合純化來純化。其純度通過SDS-PAGE分析來評價。活性分析可通過Over(1984)Scandinavian Journal of HaematologySupplementum No.41，33，13-24中描述的一步凝集分析法來確定。
優選地，利用的IXa因子是通過重組DNA技術來制備的。
重組FIXa(97/562)可由NIBSC(Potters Bar，UK)獲得。
優選地，重組FIXa是基本上純化的-例如99％的純度。
FIXa試劑可用于檢查因子Xa產生系統中FVIII和組織因子的缺乏(Barrowcliffe et al.2002，Thromb.Haemost 87，442-9)。
在數據庫中可以獲得IXa因子的核苷酸和氨基酸序列。
VIII因子在此處，術語“VIII因子”包括任何功能性VIII因子蛋白分子，包括任何雜交或修飾的VIII因子。
雜交或修飾的VIII因子包括包含VIII因子氨基酸序列的任何功能性VIII因子蛋白分子或其片段，所述VIII因子氨基酸序列來源于哺乳動物-例如人和動物。
人的VIII因子是痕量的血漿糖蛋白，作為輔因子(cofactor)參與活化因子X和IXa。VIII因子的遺傳性缺陷引起X連鎖性出血紊亂A型血友病，可通過純化的VIII因子來成功地進行治療。A型血友病的置換療法最初是用來源于血漿的VIII因子，后來用在哺乳動物細胞中克隆和表達VIII因子cDNA而獲得的重組VIII因子(Wood etal.，1984，Nature 312330)。
VIII因子的結構域排列為A1-A2-B-A3-C1-C2，合成時為具有2351個氨基酸的單鏈多肽，在易位到內質網的內腔中時被切除19個氨基酸長的信號肽。
VIII因子可以是還包含其它蛋白物質如纖維蛋白原和纖連蛋白的血漿部分的形式。這種VIII因子制備物可容易的通過現有技術中的分離方法來制備(例如參見，″Human Blood Coagulation，Haemostasisand Thrombosis″，Ed.R.Biggs，2nd Edition(1976)，BlackwellScientific Publications，Chapter 11)。
可以利用VIII因子的凍干中間純度制備物，這在Newman etal.(1971)British Journal of Haematology 2l，1中有描述。
VIII因子可以通過加熱、溶劑、清潔劑或其它技術進行處理以滅活病毒。
近年來，研究人員盡力由重組來源來制備VIII因子，以避免與血液產品相關的潛在污染。此外，VIII因子的重組來源幾乎可以無限制地提供凝集因子，因而避免了與用捐贈的血漿作為來源材料有關的供應限制。
因此，有利地，利用重組DNA技術制備的VIII因子。
人VIII因子cDNA可從合適的基因組來源(如產生該蛋白的天然器官即人肝)中，通過各種方法而分離得到，其包括從分離的mRNA模板制備cDNA，直接合成，或其組合，如US 4757006所述。
表達VIII因子的宿主-載體系統可以是原核生物的，但由于VIII因子的復雜性，優選地表達體系為哺乳動物的(至少對于具凝集活性的生物活性VIII因子而言)。這可通過用合適的VIII因子載體轉化真核生物(通常是哺乳動物或脊椎動物細胞)來實現。
VIII因子的表達系統描述于US6358703。VIII因子在重組和轉基因系統中的表達在Blood Cells Mol Dis(2000)，28(2)234-48中進行了綜述。
編碼VIII因子或其個別片段或修飾蛋白的cDNA可在正確的閱讀框中與合適的調節信號融合以產生遺傳構建體，然后其可被擴增，例如根據常規方法-如Sambrook et al.，Molecular CloningALaboratory Manual(Cold Spring Harbor Press，1989)中描述的方法在細菌(如大腸桿菌)質粒載體中制備。擴增的構建體然后可從載體中切出并純化以備用。其中可通過各種已知的方法來進行純化，例如通過一個或多個循環的HPLC。
使用的VIII因子也可選自表1所列的NIBSC參考制備物。rFVIIIBDD(99/694)是缺乏B-結構域的重組FVIII(B-結構域被認為對于止血沒有任何影響)。全長的重組體可通過稍微不同的方法來制備(rFVIII FL 1&2，96/598，96/590)，FL1是通過將FVIII和vWF的cDNA插入到中國倉鼠卵巢細胞系中來制備(Lee，(1999)，ThrombHaemost，82516-524)。FL2是通過將FVIII cDNA插入到幼倉鼠腎細胞系來制備，上述FL1和FL2的制備方法采用類似的純化步驟和均需要白蛋白用于穩定。高純度的純化單克隆抗體(HP(Mo-Ab)1&2，96/574，95/640)使用與柱子中sephrose珠共價連接的FVIII抗體，當冷沉物通過柱子時，抗體吸附FVIII，FVIII通過洗脫緩沖液從柱上釋放出來，并對材料進行進一步純化(Lee CA.Coagulation factorreplacement therapy.InRecent Advances in Haematology(Hoffbrand AV and Brenner MK，eds)，No 6.EdinburghChurchillLivingstone.p73-88)。純化的高純度離子交換(HP(Ion-ex)，96/600)制備如下先經過色譜純化冷沉物之后，以離子交換樹脂通過吸附以進一步純化FVIII。中等純度(IP，96/574)是通過肝素和甘氨酸沉淀進行純化的(Kasper Cota e Silva(2000)InFacts and Figures，No 6.MontrealWorld Federation of Hemophilia.2000；5-6)。對照WHO濃縮物標準進行顯色反應以測定效力。
VIII因子的核苷酸和氨基酸序列可在數據庫中獲得。
磷脂通常，磷脂的最佳來源是取自嚴重血友病患者的富含血小板的血漿形式的血小板自身的磷脂(Nilsson et al.(1957)Acta.Med.Scand.159，35-57(1957))。然而，將對于大多數實驗室來說并不是有實際意義的方法，其它磷脂來源必須使用。
帶負電荷的磷脂(例如磷脂酰絲氨酸)與不帶電荷的磷脂(例如磷脂酰膽堿)的混合物可以作為合適的試劑(Zwaal&Hemker(1982)Haemostasis 11，12-39)。
可以利用不同來源的磷脂抽提物，例如在Bell and Alton(1954)Nature 174，880-881；Hjort et al.(1955)J.Lab.Clin.Med.46，89-97及Barrowcliffe et al.(1982)Haemostasis 11，96-101中披露的牛、兔或人腦。
磷脂可以是基本上純化或合成的磷脂。
磷脂可由純化或合成的磷脂單獨一種組成，也可以由其與其它物質例如磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、鞘磷脂等的混合組成。
磷脂可以通過非極性溶劑從富含磷脂的人、動物或植物組織中抽提。合適的組織來源可以包括牛、人、豬或兔的腦、胎盤、脊髓或血小板，而牛或人腦是富含磷脂的特別好的來源。
任何非極性溶劑，只要能夠用于抽提組織并獲得所需水平的磷脂，均可用于該方法。合適的溶劑可以包括但不局限于，氯烷烴-例如氯仿和二氯甲烷，和石油醚。
不管選擇何種抽提溶劑和抽提方法，優選地，獲得的磷脂是穩定的產品并包含最少的氧化產物。這可通過將合適的抗氧化劑，尤其是丁基化羥基苯甲醚，加入到所采用的一種或多種溶劑中來最好地實現。
一旦通過例如混合純化或合成磷脂或從自然來源的物質抽提得到磷脂后，可隨后通過本領域已知的乳化方法將其分散到水性溶液中。例如，磷脂可溶解于甲醇或乙醇，然后蒸發大部分或所有的溶劑，接著在劇烈攪拌下將所述固體加入到水中或生理鹽水中而形成磷脂乳液。
在優選實施方式中，磷脂(91/542)可從NIBSC，Potters Bar，UK獲得。
治療(treatment)在本發明中所述治療包括治愈、減輕和預防性治療中的一種或多種。優選地，術語治療至少包括治愈治療和/或減輕治療。
所述治療可以與其它治療血友病的方式相結合。
療法(therapy)本發明的組合物可以用作治療試劑-即用于治療用途。
如同在這里的術語“治療”，術語“療法”包括治愈效果、減輕效果及預防效果。
療法可以在人或動物上進行。
療法可與其它對血友病的治療性治療相結合。
受試者在本發明中，“受試者(subject)”指任何可以發展出或已患有血友病的受試者-例如哺乳動物，例如人和動物。
優選地，根據本發明的受試者是人。
受試者體內可含有或不含有抗-FVIII抗體。
抗-FVIII抗體的存在可通過各種本領域已知的多種方法來確定-例如在Barrowcliffe et al.(1983)J Lab.Clin.Med.34-43中描述的那些方法。
通常，含有的抗-FVIII抗體水平低于10 Bethesda單位/ml的病人可用高劑量的VIII因子治療。然而，這種治療存在許多問題，不僅因為它并不總是有效，而且費用也很高。含有的抗-FVIII抗體水平高于10 Bethesda單位/ml的受試者通常需要另外的治療方法，因為用高劑量的VIII因子治療并不起作用。
本發明的組合物因此可以給予所含抗-FVIII抗體水平低于和高于10 Bethesda單位/ml的病人。
在一個更優選地實施方式中，本發明的組合物給予所含抗-FVIII抗體水平高于10 Bethesda單位/ml的病人。
組合物根據本發明，FVIII和FIXa可以作為分開的藥物組合物給藥或作為單一藥物組合物而共同給藥。
FVIII和FIXa也可同時、同時但獨立或按順序給藥。
組合物可進一步包括磷脂。
優選地，含有FIXa的組合物可進一步包括磷脂。
典型地，磷脂可分散于水性溶液-例如水或生理鹽水-以形成分散體，其然后與IXa因子混合。
相應地，根據本發明的組合物可包括FVIII藥物組合物和添加有磷脂的FIXa藥物組合物。根據本發明的組合物可進一步包括含有FVIII、FIXa和磷脂的藥物組合物。
根據本發明的組合物可基本上由FVIII藥物組合物和添加有磷脂的FIXa藥物組合物組成。根據本發明的組合物可進一步基本上由含有FVIII、FIXa和磷脂的藥物組合物來組成。
本發明的組合物也可含有非毒性物質-例如天然存在的物質。這些進一步的物質通常來源于血漿或富含磷脂的組織來源。這些物質的典型的是纖維蛋白原和白蛋白。
為了制備本發明的組合物，其中的一種或多種成分可以凍干。
若是含磷脂的藥物組合物，則含有IXa因子和磷脂(與任何其它相關材料一起)的混合物可通過凍干來制備。這種情況下，組合物可通過將凍干混合物加入水性溶液來制備。
此處所述的組合物可用于人或動物而作為人用藥和獸用藥，典型地包含任何一或多種藥物可接受稀釋劑、載體或賦形劑。治療用的可接受載體或稀釋劑在藥物領域中是熟知的，在例如Remington′sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaroedit.1985)中有所描述。藥物載體、賦形劑或稀釋劑的選擇可根據預期給藥途徑和標準制藥實踐來進行。藥物組合物可如同含載體、賦形劑或稀釋劑一樣含有-或者除載體、賦形劑或稀釋劑外額外含有-任何合適粘合劑、潤滑劑、懸浮劑、包覆劑或增溶劑。
相應地，本發明的組合物中的成分也可與一種或多種合適的藥物載體、賦形劑或稀釋劑混合，所述一種或多種合適的藥物載體、賦形劑或稀釋劑根據預期給藥途徑和標準制藥實踐來選擇。
根據不同的給藥體系對組合物/制劑有不同的要求。例如，本發明有用的藥物組合物可制備成適于非腸胃給藥，其中組合物制備成如適于經靜脈內、肌肉內或皮下途徑遞送的可注射劑型。或者，可將制劑設計成適于多種途徑給藥。
防腐劑、穩定劑、染色劑甚至調味劑均可提供于藥物組合物中。防腐劑的例子包括苯甲酸鈉、山梨酸和對羥基苯甲酸酯。抗氧化劑和懸浮劑也可使用。
優選地，藥物可接受稀釋劑或載體是水。然而，可由其它合適的稀釋劑或載體，如生理鹽水來替代。
本發明的組合物可以以含有調味或著色劑的片劑、膠囊、ovules、酏劑、溶液劑或混懸劑的形式，用于即時、延時、緩和(modified)、持續、脈沖或控制釋放給藥。
如果藥物為片劑，則可含有賦形劑-例如微晶纖維素、乳糖、檸檬酸鈉、碳酸鈣、二堿價磷酸鈣及甘氨酸，崩解劑如淀粉(優選玉米、馬鈴薯或本薯淀粉)、乙醇酸淀粉鈉、交聯羧甲基纖維素鈉及某些復合硅酸鹽以及成粒粘合劑如聚乙烯吡咯烷酮、羥基丙基甲基纖維素(HPMC)、羥丙基纖維素(HPC)、蔗糖、明膠和阿拉伯樹膠。此外，也可包含潤滑劑，如硬脂酸鎂、硬脂酸、山萮酸甘油和滑石粉。
類似類型的固體組合物也可用作明膠膠囊填充劑。在這點上，優選的賦形劑包括乳糖、淀粉、纖維素、奶糖或高分子量聚乙二醇。對于水性混懸劑和/或酏劑，該試劑可與不同的甜味劑或調味劑、著色物質或染色劑聯合，與乳化劑和/或懸浮劑聯合，以及與稀釋劑如水、乙醇、丙二醇和甘油聯合，以及與這些物質的組合之間聯合。
給藥(遞送)途徑可包括，但不局限于口服給藥(例如作為片劑、膠囊劑或作為可食入的溶液)、非腸胃給藥(如通過注射形式)、肌肉內、靜脈內、心室內、皮內或皮下給藥中的一種或多種。
藥物組合物可用于人或動物，而作為人用藥或獸藥，典型包含任何一種或多種藥物可接受的稀釋劑、載體或賦形劑。治療用的可接受的稀釋劑、或載體在藥物領域中是非常熟知的，例如在Remington′sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaroedit.1985)中所述。藥物載體、賦形劑或稀釋劑的選擇可根據預期給藥途徑和標準制藥實踐來進行。藥物組合物可如同含有載體、賦形劑或稀釋劑一樣含有-或除載體、賦形劑或稀釋劑外額外含有-任何合適的粘合劑、潤滑劑、懸浮劑、包覆劑、增溶劑。
防腐劑、穩定劑、染色劑甚至調味劑均可提供于藥物組合物中。防腐劑的例子包括苯甲酸鈉、山梨酸和對羥基苯甲酸酯。抗氧化劑和懸浮劑也可使用。
根據不同的遞送體系對組合物/制劑有不同的要求。或者，可將制劑設計成適于多種途徑給藥。
藥物組合物可經非腸胃注射，例如靜脈內、肌肉內或皮下給藥。對于非腸胃給藥，組合物最佳的劑型是滅菌的水溶液，其中可含其它物質，如足夠的鹽或單糖以使溶液與血液有相同的滲透壓。
劑量根據本發明的組合物中成分的可能劑量可通過本領域技術人員來確定。例如通過動物研究來確定成分的最佳用量。
VIII因子的劑量在本領域中以國際單位(IU)來表示。一個IU表示1ml正常血漿中的VIII因子的量，約為100ng。
給予病人的實際VIII因子用量由病人臨床表現而定，本領域技術人員可以確定這一實際用量。
典型地，根據現有技術，單獨給予VIII因子的劑量范圍為20-50IU/kg。
有利的是，根據本發明的組合物所給予的與FIXa及任選與磷脂聯合使用的VIII因子的量可減少多達2、4、6、8或10倍或更高(體外)。
因此，有利地，本發明的組合物提供的劑量低于20IU/kg，優選2至10IU/Kg，有利地為2至5IU/Kg。
根據本發明，以摩爾計算，FIXa的濃度應高于FVIII。
優選地，以摩爾計算，FIXa的濃度應至少是FVIII的10-100倍，更優選FIXa應至少是FVIII濃度的20-90倍，進一步優選FIXa應至少是FVIII濃度的30-70倍，還優選FIXa應至少是FVIII濃度的40-60倍，最優選FIXa應至少是FVIII濃度的50倍。
根據本發明，以摩爾計算，磷脂的濃度應高于FVIII。
優選地，以摩爾計算，磷脂的濃度應至少是FVIII的10-1500倍。更優選，以摩爾計算，磷脂的濃度至少是FVIII的10-1000倍，更優選，磷脂的濃度應至少是FVIII的10-900倍，更優選，磷脂的濃度應至少是FVIII的10-800倍，更優選，磷脂的濃度應至少是FVIII的10-700倍，更優選，磷脂的濃度應至少是FVIII的10-600倍，更優選，磷脂的濃度應至少是FVIII的10-500倍，更優選，磷脂的濃度應至少是FVIII的10-400倍，更優選，磷脂的濃度應至少是FVIII的100-400倍，進一步優選，磷脂的濃度應至少是FVIII的200-400倍。最優選，磷脂的濃度應至少是FVIII的300倍。
根據不同的病人，具體劑量水平和給藥頻率可能不同，要考慮各種因素，包括使用的具體化合物的活性、該化合物的代謝穩定性及作用持續時間、年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食、給藥方式和時間、排泄率、聯合給藥、具體病況的嚴重程度以及具體的正在進行的治療方法。
制劑本發明的成分可制備成藥物組合物，如用本領域的已知方法將其與一種或多種可接受載體、稀釋劑或賦形劑混合。
核苷酸序列在這里，術語“核苷酸序列”與術語“多核苷酸”具有同等含義。
本發明的方面涉及核苷酸序列的應用，這些序列可在數據庫中獲得。這些核苷酸序列可用于表達氨基酸序列，其可作為本發明組合物中的成分。
核苷酸序列可以是基因組的或合成的或重組來源DNA或RNA。核苷酸序列可以是雙鏈或單鏈，代表有義鏈或反義鏈或者它們的組合。
核苷酸序列可通過重組DNA技術(如重組DNA)來制備。
核苷酸序列可與天然存在的形式相同，也可以是其衍生物。
氨基酸序列在此處，術語“氨基酸序列”與術語“多肽”和/或術語“蛋白質”具有同等的含義。有時，術語“氨基酸序列”與術語“肽”有相同的含義。有時，術語“氨基酸序列”與術語“蛋白質”的含義等同。
本發明的某些方面涉及氨基酸序列的應用，其序列可在數據庫中獲得。這些氨基酸序列可用于本發明的組合物中。
氨基酸序列可從合適的來源分離得到，或通過合成或重組DNA技術來制備。
動物檢測模型體內模型可用于優化或設計治療受試者中的A型血友病或B型血友病的治療方法。
動物檢測模型可以是哺乳動物，如非人哺乳動物，例如大鼠、倉鼠、兔、豚鼠或小鼠。
通用重組DNA技術除非特別說明，本發明采用的是常規的化學、生物學、分子生物學、微生物學和重組DNA技術，這些均是本領域技術人員所熟知的。
這些技術在現有技術的文獻中有說明。例如參見J.Sambrook，E.F.Fritsch，and T.Maniatis，1989，分子克隆實驗手冊，第二版，Books 1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel，F.M.et al.(1995and periodic supplements；Current Protocolsin Molecular Biology，ch.9，13，和16，John Wiley&Sons，NewYork，N.Y.)；B.Roe，J.Crabtree，and A.Kahn，1996，DNAIsolation and SequencingEssential Techniques，John Wiley&Sons；M.J.Gait(編輯)，1984，Oligonucleotide SynthesisA Practical Approach，Irl Press以及D.M.J.Lilley and J.E.Dahlberg，1992，Methods of EnzymologyDNA Structure Part ASynthesis and Physical Analysis of DNA Met hodsin Enzymology，Academic Press。本發明分別通過引用的方式將這些文獻引入作為參考。
下面通過實施例的方式對本發明作進一步說明，所述實施例有助于本領域技術人員實施本發明，而不能解釋為對本發明范圍的任何限制。
實施例1材料和方法試劑TBS緩沖液50mM Tris，150mM NaCl，0.02％NaN2，pH7.4，1％人血清白蛋白(Zenalb，BPL，Elstree，UK)。牛纖維蛋白原(Diagnostic Reagents Ltd.Thame，Oxon UK)。來自NIBSC，PottersBar，Herts，UK的凍干試劑磷脂(91/542)，重組FIXa(97/562)，蝮蛇抗栓酶(74/581)，α-凝血酶(89/588)。FIXa試劑為99％的純度并用于測定在Xa因子產生系統中的FVIII和組織因子的存在與否(Barrowcliffe TW，Fabregas P，Jardi M，Cancelas J，RabanedaM，and Feize J.Procoagulant activity of Tlymphoblastoid celldue to exposure of negatively charged phospholipid.ThrombHaemost 2002；87442-449)。
FVIII濃縮物對不同純度和制備方法獲得的一系列濃縮物進行研究。作用FVIII濃縮物(表1)為凍干材料，作為參照制備物，也獲自NIBSC。rFVIII BDD(99/694)是重組FVIII，缺乏B-結構域(B-結構域被認為在止血中沒有任何作用(Lee C.Recombinant clotting factors in thetreatment of hemophilia.Thromb Haemost 1999；82516-524))。全長重組體的制備方法稍有不同(rFVIII FL1&2，96/598，96/590)，FL1是通過插入FVIII和vWF的cDNA到中國倉鼠卵巢細胞系而制備得到(Lee C.Recombinant clotting factors in the treatment ofhemophilia.Thromb Haemost 1999；82516-524)。FL2是通過將FVIII cDNA插入到幼倉鼠腎細胞系中而制備，它們均具有類似的純化步驟并需要白蛋白來穩定。高純度單克隆抗體，純化的，(HP(Mo-Ab)1&2，96/574，95/640)利用在柱子中共價結合于sepharose珠的FVIII抗體，當冷沉物通過柱子時抗體吸附FVIII，繼而用洗提緩沖液將FVIII從柱上釋放，然后可作進一步的純化(Lee CA.Coagulationfactor replacement therapy.于Recent Advances inHaematology(Hoffbrand AV and Brenner MK，eds)，No 6.EdinburghChurchill Livingstone.1992；73-88)。高純度的離子交換純化(HP(Ion-ex)，96/600)制備如下首先通過色譜純化冷沉物，然后用離子交換樹脂通過吸附以進一步純化FVIII(Lee CA.Coagulation factor replacement therapy.于Recent Advancesin Haematology(Hoffbrand AV and Brenner MK，eds)，No 6.EdinburghChurchill Livingstone.1992；73-88)。中間純度(IP，96/574)通過肝素和甘氨酸沉淀來純化(Kasper CK and Cota e SilvaM.Registry of clotting factor concentrates 2nd edn.于Factsand Figures，No 6.MontrealWorld Federation of Hemophilia.2000；5-6)。對照WHO濃縮物標準通過顯色方法來測定效力。
血漿人工FVIII缺陷血漿(Organon Teknika Corporation，Durham，USA)。所述血漿是化學法耗竭的，并含有正常水平的vWF。正常的無血小板的血漿從National Blood Service，Colindale，UK獲得。5個捐贈的血漿在冷凍前匯集在一起，通過顯色反應分析可知獲得的匯集物含有0.86IU/ml FVIII。從2個病人獲得血友病血漿，通過一步法APTT分析得知水平低于0.01IU/ml。血漿于2000g，4℃下離心15分鐘以去除血小板。
兔多克隆FVIII抗體由Dr Ingerslev贈予。對照抗體是Gammabulin，Baxter Hyland Immuno(Immuno Ltd，Thetford，Norfolk，UK)產品。
凝血酶產生試驗在Deca設備(Grifols，Barcelona，Spain)上進行，通過機械終點測定凝塊。
凝血酶產生試驗如下去除血漿中纖維蛋白使用先前描述過的蝮蛇抗栓酶(ancrod)(Houbouyan L，Padilla A，Gray E，Longstaff C，andBarrowcliffe TW.Inhibition of thrombing eneration by heparinand LMW heparinsa comparison of chromogenic and clottingmethods.Blood Coagul Fibrinolysis 1996；724-30)，終濃度為0.5IU/ml血漿，37℃保持30分鐘，然后用木制棍破壞凝塊。FVIII濃縮物加入到FVIII缺乏型血漿中使其濃度達到0.005-1IU/ml。400μl正常血漿或缺乏型血漿和FVIII濃縮物及80μl FIXa(在血漿中的濃度為14nM)在37℃共同孵育1.5分鐘，然后加入400μl磷脂(終濃度3.1μg/ml)和400μl CaCl2(終濃度7.8mM)以起始反應。以頻繁的時間間隔取50μl次級(subsample)樣品加入到兩個Deca設備上含200μl纖維蛋白原的杯子中，記錄凝結的時間。通過α-凝血酶標準曲線將凝結時間轉化為凝血酶單位。凝血酶產生曲線用曲線下面積(AUC)、血酶峰值和達到半數最大值(T1/2max)所需費的時間來進行量化。每組實驗均以反向平衡順序進行，平行兩份，并重復3或更多次。
TGT的再現性在3個月周期中，對正常血漿進行了9次單獨實驗，各平行兩份，獲得的曲線的3個參數表明CV范圍為8.9-14.6％。此外，對3個不同的FVIII濃度進行了為期1周的一組5次重復實驗，CV范圍在0.02IU/ml時為5-5.6％，在0.005IU/ml時為9.2-11.7％，而正常血漿(0.86IU/ml)為6.8-12.3％。
FVIII抗體實驗將抗體加入到正常和血友病血漿中，加入的FVIII抗體稀釋度為1/1000，而對照抗體為10μg/ml。血漿和抗體于37℃孵育過夜，按前述的方法進行凝血酶產生實驗。
數據分析統計分析是用不成對斯氏t-檢驗來分析。
實施例2TGT對FVIII的劑量反應濃縮HP(Mo-Ab)2摻料到人工化學法耗竭的FVIII缺乏血漿，這些血漿的FVIII濃度涵蓋了較寬的范圍，從0.005至1IU/ml，并測定凝血酶產生(Fig 1A)。發現FVIII的濃度從1降低到0.005IU/ml時，曲線中由T1/2max所代表的滯后時間由64秒延長到165秒。然而，盡管是非常低水平的FVIII，凝血酶的峰值不受影響，且觀察到AUC只降低很少。甚至在FVIII濃度為0.005IU/ml時，AUC也僅比正常血漿稍有減少，分別是6287和6540iu.sec。在濃度為1(T1/2max64sec)和0.125IU/ml(T1/2max87sec)時，凝血酶比正常血漿(T1/2max118sec)產生更快，而濃度為0.03IU/ml(T1/2max119sec)時與正常血漿產生凝血酶的情況相似。
實施例3FVIII濃縮物比較當不同的FVIII濃縮物以相同的FVIIIC濃度加入到FVIII缺乏型血漿中時，獲得的凝血酶產生曲線與濃縮物HP(Mo-Ab)2相似(圖1B，表2)。所有濃縮物在1IU/ml時比正常血漿更快產生凝血酶，且產生量也比正常血漿的要大。rFVIII BDD的T1/2max(48sec)比其它濃縮物(范圍在54-64sec)要短，這種差別具有統計分析上顯著性，p＜0.05。
實施例4嚴重血友病的血漿來自兩個患有嚴重A型血友病的病人的血漿產生非常驚奇的量的凝血酶(圖2，表3)，其AUC 65和69％正常血漿，盡管有低于0.01IU/ml的水平。然而，兩個病人的凝血酶產生的起始點顯著延遲，T1/2max分別為426和318秒。用FVIII抗體與之孵育過夜，可以使之完全不產生凝血酶，凝血酶峰值從22IU/ml至0.2IU/ml(表3)，表明這些血友病血漿的凝血酶的產生歸功于低水平的FVIII。另一個血漿樣品獲自于輸注后61小時的病人HP1(原始樣品是注射后37小時)，該樣品產生微量的凝血酶(AUC為正常血漿的5％)。這表明這些條件下進行的凝血酶產生試驗在低于一步分析法檢測限度即＜0.01IU/ml的水平是敏感的。
實施例5FIXa濃度減低FIXa的濃度以便檢測FIXa對于極低FVIII濃度下產生凝血酶的影響(圖3A)。FIXa濃度從14nM逐漸降低，導致正常血漿的滯后時間延長(在14nM時的T1/2max為114秒，延長到0.2nM時的226秒)，但不改變峰高度或AUC(0.2nM時的AUC為14nM的98％)。與14nM濃度的結果相反，在血友病血漿中FIXa為0.2nM的濃度下，幾乎不產生凝血酶。凝血酶產生試驗因而在低量FVIII時是敏感的，但同時依賴于FIXa的濃度。有實驗(數據未顯示)表明正常血漿和血友病血漿通過玻璃接觸激活產生與高濃度FIXa類似量的凝血酶。
實施例6在低FIXa濃度下的FVIII的劑量反應也用相同濃縮物HP(Mo-Ab)2評定在低FIXa水平下的劑量反應。濃縮物稀釋到血友病血漿中，并用低濃度FIXa(0.2nM)激活血漿(圖3B)。當FVIII濃度下降時，AUC和峰高度也下降，而滯后時間卻延長(如前面所觀察到的)。與高濃度FIXa相反，峰高度和AUC保持異常，只有更高濃度的FVIII使之恢復正常。在較低FIXa濃度下，增加FVIII對凝血酶產生的影響更為明顯。
討論化學法耗竭型血漿被觀察到的更快產生凝血酶的現象被表明是所用特定缺乏型血漿的一種人為現象。在免疫耗竭型和血友病血漿中沒有觀察到相同的現象，但低水平下產生的凝血酶總量仍然很高，這是由于使用高濃度的FIXa的緣故。
使用高濃度FIXa的凝血酶產生試驗(TGT)被發現對低水平的FVIII非常敏感。當FVIII水平低于0.01IU/ml時，在添加FVIII濃縮物至FVIII缺陷型血漿的人工情況以及在兩個嚴重血友病血漿中，均可產生大量的凝血酶。早期針對TGT的工作發現在血友病血漿中只能檢測到非常少量的凝血酶，但只要添加小量的正常血漿即可改善其凝血酶的產生。Macfarlane和Biggs(A thrombin generation testthe application in haemophilia and thrombocytopenia.J ClinPathol 1953；63-8)的血漿研究表明加入0.5％正常血漿到血友病血漿中即可引起可檢測的凝血酶產生，然而，凝血酶的產生十分滯后并只能達到正常樣品平均峰高度的三分之一。Pitney和Dacie發現加入1％正常血漿可改善凝血酶的產生，但需要20％或更高才能使凝血酶的產生達到正常值(Pitney WR and Dacie JV.A simple method forstudying the generation of thrombin in recalcified plasma.JClin Pathol 1953；69-14)。在血友病血樣品(HP1)中使用FVIII抗體表明是由于FVIII導致產生的凝血酶低于0.01IU/ml(表3)。在更長的注射后時間以后取自該病人的重復樣品幾乎不產生凝血酶，這表明最初樣品產生的凝血酶是由于注射殘余的FVIII。另一個病人的血漿(HP2)在輸注后72小時收集，其凝血酶的產生不太可能歸因于注射，而可能是由于內源的FVIII。最近的研究中，aPTT凝塊波形分析顯示在一些嚴重血友病病人中可檢測的FVIII，其水平為0.002至0.01IU/ml(Shima M，Matsumoto T，Fukuda K，Kubota Y，TanakaI，Nishiya K，Giles AR，and Yoshioka A.Theutility of activatedpartial thromboplastintime(aPTT)clot waveform analysisinthe investigation of hemophilia A patients with very lowlevels of factor VIII activity(FVIIIC).Thromb Haemost 2002；87436-441)。由于能夠檢測此低水平FVIII，因此暗示了進行預防的頻率。我們揭示在低于0.01IU/ml時有相當量的凝血酶產生，某些證據表明當波谷水平低于0.01IU/ml時，關節出血仍然非常罕見(Petrini P.What factors should influence the dosage andinterval of prophylactic treatment in patients with severehaemophilia A and B？Haemophilia 2001；799-102)。雖然通常認為預防應當保持在高于該水平，但沒有證明這可改善臨床結果(van den Berg HM，Fischer K，Mauser-Bunschoten EP，Beek FJ，Roosendaal G，van der Bom JG，and Nieuwenhuis HK.Long-termoutcome of individualized prophylactic treatment of childrenwith severe haemophilia.Br J Haematol 2001；112561-565)。
TGT對低水平FVIII的敏感性可以通過在分析中使用用以起始凝結反應的FIXa量解釋。發現FIXa的濃度對于低濃度FVIII產生凝血酶的能力非常重要，但這種效應隨著FVIII的正常化而被最小化。最初選擇高濃度FIXa是因為它產生與內部玻璃接觸激活相同的凝血酶產生情況。Josso et al(Josso F，and Prou-Wartelle O.Interactionof tissue factor and factor VII at the earliest phase ofcoagulation.Thromb Diath Haemorrh Suppl 1965；1735-44)表明需要組織因子(TF)和FVII來替代對體外接觸激活的需求。后來表明是TF、FVII和鈣激活FIX(sterud B，and Rapaport SI.Activation of factor IX by the reaction product of tissuefactor and factor VII.Additional pathway for initiating bloodcoagulation.Proc Natl Acad Sci USA 1977；745260-5264)。這在低濃度TF時也會出現，這可解釋抗血友病因子在凝血酶產生中的作用(Bauer KA.Activation of the factor VII-tissue factorpathway.Thromb Haemost 1997；78108-111；Keularts IM，Zivelin A，Seligsohn U，Hemker HC，and Béguin S.The role offactor XI in thrombin generation induced by low concentrationsof tissue factor.Thromb Haemost 2001；851060-1065)。此外，在低濃度TFF，少于1％的總血漿FIX被激活，得到0.9nM的血漿FIXa濃度(Laws on JH，Kalafatis M，Stram S，and Mann KG.A model forthe tissue factor pathway to thrombin.J Biol Chem 1994；26923357-23366)。在這些實驗中使用的0.2nM的低FIXa濃度因而低于此水平，但可被認為是在凝結級聯反應的起始過程中存在的生理學濃度。雖然與接觸激活相似，用于激發凝血酶產生的較高的14nM FIXa濃度可能高于生理學濃度，盡管在損傷之后的局部FIXa濃度可能高于0.9nM。在TGT中，還使用0.1nM至1.5nM濃度的FIXa進行實驗(Hoffman M，Monroe DM，Oliver JA，and Roberts HR.Factor IXaand Xa play distinct roles in tissue factor-dependentinitiation of coagulation.Blood 1995；8617941-1801；JestyJ.Interactions of feedback control and product inhibition inthe activation of factor X by factors IXa and VIII.Haemostasis1991；21208-218；Kumar R，Béguin S，and Hemker HC.Theinfluence of fibrinogen and fibrin on thrombin generation-evidence for feedback activation of the clotting system byclot bound thrombin.Thromb Haemost 1994；72713-721；SekiyaF，Yoshida M，Yamashita T，and Morita T.Ma gnesium(II)isacrucial constituent of the blood coagulation cascade.Potentiation of coa gulant activities of FIX by Mg2+ions.JBiol Chem 1996；2718541-8544)。不希望受任何特定理論的束縛，當用低濃度FVIII進行分析時，在高濃度FIXa下，FIXa可以保護經降解由血友病血漿產生的極少量的FVIIIa(Lenting PJ，van MourikJA，Mertens K.The lifecycle of coagulation factor VIII inview of its structure and function.Blood 1998；923983-3996)，并且在更高的FIXa濃度下，FIXa可以增強FVIIIC活性(RickME.Activation of factor VIII by factor IXa.Blood 1982；60744-751)。
說明書中提到的所有公開發表的文章被結合進來作為參考。在不偏離本發明的范圍和精神實質的情況下，對本發明描述的方法和體系的各種改進和衍變對本領域技術人員來說均是顯然的。雖然本發明通過具體的優選實施方式來進行了描述，應當理解的是要求保護的本發明并不局限于這些具體的實施方式。實際上，對于生物或相關領域的技術人員，為實施本發明對所述方式進行的各種改進都屬于下面的權利要求的范圍之內。
表1FVIII濃縮物的特性
表21IU/ml FVIII濃縮物的凝血酶產生情況，*＝P＜0.05，曲線下的面積(AUC)，達到半數最大峰高度所需的時間(T1/2max)，n≥3。
表3FVIII缺陷型血漿的凝血酶產生結果。所有缺陷型血漿含有的FVIII＜0.01IU/ml。血友病血漿(HP)，n≥3。
權利要求
1.FIXa和FVIII在制備治療受試者中的A型血友病或B型血友病的組合物中的用途，其中所述受試者不存在抗-FVIII抗體。
2.含有FIXa的組合物和含有FVIII的組合物，用于同時、同時獨立或按順序使用以治療受試者中的A型血友病或B型血友病，其中所述受試者不存在抗-FVIII抗體。
3.根據權利要求1或2的含有FIXa的組合物，進一步含有磷脂。
4.FIXa在制備用于治療A型血友病或B型血友病的含有FVIII的組合物中的用途，其中FIXa的存在允許相對于不含有FIXa的組合物而言，減少所述組合物中FVIII的濃度。
5.根據權利要求4的用途，其中所述組合物被給予不存在抗-FVIII抗體的受試者。
6.根據權利要求4或5的用途，其中所述FVIII和FIXa試劑是通過重組DNA技術產生的。
7.根據權利要求4-6任一項的用途，其中所述組合物進一步包含磷脂。
8.根據權利要求4-7任一項的用途，其中所述組合物被配制以為受試者提供2-10IU/kg劑量的FVIII。
9.一種治療患有A型血友病或B型血友病的受試者的方法，包括給予有此需要的受試者含有FIXa和FVIII的組合物，其中所述受試者不存在抗-FVIII抗體。
10.一種治療患有A型血友病或B型血友病的受試者的方法，包括給予有此需要的受試者含有FIXa和FVIII的組合物，其中所述組合物中含有的FVIII的量低于用不含有FIXa的組合物治療所述受試者所要求的量。
11.根據權利要求9或10的方法，其中所述組合物進一步包含磷脂。
12.根據權利要求9-11任一項的方法，其中所述組合物含有重組FIXa和重組FVIII。
13.根據權利要求9-12任一項的方法，其中所述組合物被配制以為受試者提供2-10IU/kg劑量的FVIII。
14.一種強化FVIII的方法，包括將FVIII因子和FIXa因子混合成組合物的步驟。
15.根據權利要求14的方法，其中所述組合物進一步含有磷脂。
16.根據權利要求14或15的方法，其中所述組合物含有重組FIXa和重組FVIII。
17.一種減少含有FVIII的組合物中的FVIII在受試者中的免疫原性的方法，包括將FVIII與FIXa共同給予所述受試者。
18.FIXa和FVIII在制備治療血友病的組合物中的用途，其中由于FIXa的存在，所述組合物中FVIII的免疫原性降低。
全文摘要
本發明涉及FIXa和FVIII在制備治療體內不存在抗FVIII抗體的A型血友病或B型血友病病人的組合物中的用途。本發明進一步涉及包含FIXa的組合物和包含FVIII的組合物，其用于同時、同時獨立或按順序給藥以治療體內不存在抗FVIII抗體的A型血友病或B型血友病病人。
文檔編號A61P7/04GK1826136SQ200480020861
公開日2006年8月30日 申請日期2004年5月17日 優先權日2003年5月19日
發明者T·巴羅克利菲 申請人:國家生物標準及控制研究所