一種用于豬牛口蹄疫疫苗的雙相納米乳佐劑及其制備方法和用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種疫苗納米乳佐劑及其制備方法和用途，特別涉及一種用于豬牛口 蹄疫疫苗的雙相納米乳佐劑及其制備方法和用途，本發明屬于獸醫學領域。
【背景技術】
[0002] 納米科技是20世紀80年代末期誕生并正在迅速崛起的新興邊緣學科，由于納米微 粒具有小尺寸效應、表面效應、量子尺寸效應和宏觀量子隧道效應等特點，能產生許多不同 于常規物態所具有的新奇特性，顯示出非常廣闊的應用前景。因此，應用納米技術和材料開 發靶向、控釋藥物，已經成為現代生物制品學的研究熱點。近年來，納米材料在醫學免疫領 域，特別在疫苗佐劑方面受到了極大的重視，與傳統油佐劑、氫氧化鋁佐劑相比，納米化佐 劑與抗原物質結合具有更大的結合表面積，可在同等體積下容納更多的抗原，并借助其在 水相中的均勻性，可使抗原更不易被降解破壞，提高了接種抗原的利用率。其次，由于納米 佐劑的均質性優于傳統佐劑，可將具有抗原遞呈能力的巨噬細胞、樹突狀細胞等集中在一 定區域，使包裹、吸附或結合有抗原表位的納米微粒更有效地被抗原遞呈細胞吞噬、加工、 遞呈，在短時間內激活免疫應答，顯著提高機體免疫反應的水平。在副作用方面，因納米微 粒的利用率極高，使其使用劑量及其副作用顯著降低。更重要的是由于納米佐劑是將抗原 包裹于納米粒子內部或吸附在其表面，或通過化學連接作用與納米粒子結合，從而可持久 地釋放被包裹的抗原，其控制釋放效果更為理想。
[0003] 我國在獸類疫苗生產佐劑使用方面，最常用的是礦物油佐劑蒙特耐得 (Montnanide) ISA 206，因為它的如下優越性:第一內溶成分比較特殊，在與水相的混和乳 化中不需再添加其他乳化劑即可與水相結合成穩定的乳劑;第二在油水相混和乳化過程中 對硬件設備要求較低。但隨著疫苗質量標準的不斷提高，其缺點不斷突顯，在動物體內不能 被代謝，毒性較大，注射到動物體內會在注射部位局部形成小結、肉芽腫，有些動物甚至會 形成無菌性化膿性炎癥反應，而且不能實現隔離、保護、控制釋放、靶向釋放等多種功能的 作用，因此本發明針對上述問題將納米科技和W/0/W技術相結合研制獲得一種新型佐劑，主 要目的是研究一種穩定性良好、安全性高、成本低且易產業化生產的新型納米乳佐劑來替 代傳統佐劑，為提高防控豬牛等家畜口蹄疫疾病的水平和效率提供新的技術手段。

【發明內容】

[0004] 面對當前養殖業特別是豬、牛等家畜口蹄疫疫病暴發和流行以及疫苗免疫持續期 短，過敏反應等難以控制的嚴峻形勢，本發明提出了一種適用于豬牛口蹄疫疫苗的新型水 包油包水型(W/0/W)雙相納米乳佐劑，其具有安全性高、疫苗副作用小，抗原緩釋能力強等 特點，本發明的提出為提高防控豬牛等家畜口蹄疫疫病的水平和效率提供了新的技術手 段。
[0005] 為實現上述目的，本發明采用了以下技術方案：
[0006] 1、納米乳佐劑配方的篩選
[0007] 通過繪制偽三元相圖及正交試驗設計，篩選出空白納米乳配方。
[0008] 2、口蹄疫納米乳佐劑疫苗的制備
[0009] 在15~25°C條件下，按照篩選的空白納米乳配方，用該佐劑與口蹄疫滅活抗原乳 化配制疫苗。
[0010] 3、口蹄疫納米乳佐劑疫苗的質量評價
[0011] (1)微觀形態:在透射電鏡下觀察口蹄疫納米乳佐劑疫苗的微觀形態。
[0012] (2)粒徑分布:用激光粒度分析儀測定其平均粒徑及強度粒徑分布。
[0013] (3)黏度測定：
[0014] 方法一:取出lml玻璃吸管（下口內徑為1.2mm，上口內徑為2.7mm)，在25°C環境中 吸取納米乳劑lml，令其垂直自然流出，記錄流出0.4ml所需時間，測定三次，取平均值。
[0015]方法二:轉子型黏度計法:動力黏度n(Pas) = κ (Τ/ ω )，其中κ表示已知黏度的標準 液測得的旋轉式黏度計常數，Τ為扭力矩，ω為角速度。
[0016] (4)離心檢測：吸取口蹄疫納米乳佐劑疫苗10ml加入離心管中，以3000r/min離心 30min，觀察是否有水相析出及分層現象出現。
[0017] (5)穩定性檢測：取3批制備好的□蹄疫納米乳佐劑疫苗分別在4°C放置1年、20°C 放置6個月、37°C放置1個月，觀察納米乳佐劑疫苗的外觀。
[0018] 4、安全性試驗
[0019] 5、納米乳佐劑疫苗對小鼠的免疫效力試驗
[0020] 6、納米乳佐劑疫苗對豬的免疫效力試驗 [0021] 7、納米乳佐劑疫苗對牛的免疫效力試驗 [0022] 8、該納米乳疫苗1000L體系的工藝放大
[0023]在上述研究的基礎上，本發明最終篩選得到了一種用于豬牛口蹄疫疫苗的雙相納 米乳佐劑，所述的雙相納米乳佐劑由表面活性劑、助表面活性劑以及油相組成；
[0024]其中，所述的表面活性劑選自TweenSO、油酸聚氧乙烯酯、聚氧乙烯雙油酸酯、 Span80中的一種或兩種以上的組合；
[0025]其中，所述的助表面活性劑選自聚丙醇、PEG 400或二者的組合；
[0026] 其中，所述的油相選自麥芽油、液體石蠟、花生油中的一種或兩種以上的組合；
[0027] 其中，所述的表面活性劑與助表面活性劑的質量比為7:1-4,表面活性劑與助表面 活性劑的混合物與油相的質量比為1 -1 〇: 〇. 1 -1 〇。
[0028]在本發明中，優選的，所述的表面活性劑為TweenSO、油酸聚氧乙烯酯、聚氧乙烯雙 油酸酯以及SpanSO的混合物，其中TweenSO、油酸聚氧乙烯酯、聚氧乙烯雙油酸酯以及 Span80的質量比為3:1-3:1:1;所述的助表面活性劑為聚丙醇以及PEG400的混合物，其中聚 丙醇以及PEG 400的質量比為1:1;所述的油相為液體石蠟。
[0029] 在本發明中，優選的，所述的表面活性劑與助表面活性劑的質量比為7:1-4,所述 的表面活性劑與助表面活性劑的混合物與油相的質量比為3-5:5-7。
[0030] 在本發明中，優選的，所述的表面活性劑為TweenSO、油酸聚氧乙烯酯、聚氧乙烯雙 油酸酯以及SpanSO的混合物，其中TweenSO、油酸聚氧乙烯酯、聚氧乙烯雙油酸酯以及 Span80的質量比為3: 2:1:1;所述的助表面活性劑為聚丙醇以及PEG 400的混合物，其中聚 丙醇以及PEG 400的質量比為1:1;所述的油相為液體石蠟，其中，表面活性劑與助表面活性 劑的質量比為7:1，表面活性劑和助表面活性劑混合物與油相的質量比為4:6。
[0031] 進一步的，本發明還提出了所述的雙相納米乳佐劑在制備豬牛口蹄疫納米乳佐劑 疫苗中的用途。
[0032] 再進一步的，本發明還提出了一種豬牛口蹄疫納米乳佐劑疫苗及其制備方法，所 述的納米乳佐劑疫苗含有本發明所述的雙相納米乳佐劑以及口蹄疫病毒抗原液，其由以下 步驟制備得到：
[0033] (1)將本發明任一項所述的雙相納米乳佐劑采用121°C高溫高壓滅菌30min，冷卻；
[0034] (2)在300-400rpm的轉速下，將口蹄疫病毒抗原液以10-20g/min的流速加入到步 驟(1)的佐劑中；
[0035] (3)15-25Γ下，乳化15-25min即得。
[0036] 其中，優選的，口蹄疫病毒抗原液與雙相納米乳佐劑的質量百分比分別為45%和 55%〇
[0037] 相較于現有技術，本發明的有