帕金森病動物模型的制備方法及其用圖
【專利摘要】本發明涉及生物醫學技術領域，具體涉及一種帕金森病動物模型的制備方法及其用途。本發明中的帕金森病動物模型的制備方法包括：(1)在每只動物皮下注射大麻素受體拮抗劑，每天一次，連續5～15天；(2)將步驟(1)中得到的動物樣本進行檢測運動協調性的實驗；(3)取步驟(2)評估后動物的腦部組織進行檢測，即得帕金森病動物模型。通過本發明中的制備方法制備的動物模型具有造模成功率高，無其他毒副作用的優點，且獲得的帕金森病動物模型可用于研究大麻素系統與帕金森病的病理進程的機制，進而篩選用于延緩、治療帕金森病的藥物，具有很好的應用前景。
【專利說明】
帕金森病動物模型的制備方法及其用途
技術領域
[0001]本發明涉及生物醫學技術領域，具體的，本發明涉及一種帕金森病動物模型的制備方法及其用途。
【背景技術】
[0002]帕金森病(Parkinson’sdisease，PD)是繼阿爾茨海默病后最常見的以黑質致密部多巴胺(DA)能神經元的變性、缺失為主要病理學改變的神經退行性疾病，在65-69歲的老年人群中發病率約占0.5%-1%，在80歲以上的老年人中發病率能達到I %-3%。雖然近些年來，隨著對帕金森病研究的深入，已有一些治療方法能夠減輕疾病的某些癥狀，但是都達不到徹底治愈的目的，因此，更深入的研究H)的發病機制和治療方法很有必要，而穩定高效的動物模型是深入研究該疾病的前提。
[0003]目前較為公認的建立PD模型的方法主要有兩種:一種是應用6-羥基多巴胺(6-0HDA)注入黑質紋狀體系統來損毀大鼠黑質-紋狀體系統多巴胺(DA)能神經元所制成的模型，該建模需要三維立體定向注射，技術操作要求較高，存在較高失敗率；另一種是運用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)制備猴等靈長類動物模型和C57B小鼠H)模型，但是MPTP對人類同樣具有不可修復的神經毒性，操作需要嚴格的安全控制。且兩種方法都不能準確模擬帕金森病的病理過程，比如MPTP模型中路易小體(Lewy body)并不出現。上述模型存在的不足之處極大地限制了這些模型的應用。本領域迫切需要開發更可靠的帕金森病動物模型。

【發明內容】

[0004]本發明的目的是提供一種帕金森病動物模型的制備方法及其用途，解決了現有技術中造模成功率低，模型不可靠的問題。
[0005]為解決上述技術問題，本發明的實施方式提供了一種帕金森病動物模型的制備方法，包括以下步驟:(I)在每只動物皮下注射大麻素受體拮抗劑，每天一次，連續5?15天，SP得動物樣本I; (2)將所述動物樣本I進行檢測運動協調性的實驗，即得動物樣本2; (3)取所述動物樣本2的腦部組織進行檢測，即得帕金森病動物模型。
[0006]本發明的另一目的在于是提供上述方法制備的該帕金森病模型的用途，其中，該帕金森病模型被用于大麻素系統參與帕金森病的病理過程機制的研究和藥物開發。
[0007]本發明相對于現有技術而言，在動物體內注射大麻素受體拮抗劑，使動物出現帕金森病樣癥狀，通過對帕金森病樣動物進行行為學評估及腦部組織檢測得到可靠有效的帕金森病動物模型，且提高了造模的成功率。
[0008]進一步地，大麻素受體拮抗劑優選為BML-190，BML-190可穿過血腦屏障，通過抑制CB2受體，抑制帕金森病相關蛋白Parkin/PINKl的活性，抑制PI3K/AKT信號轉導通路，進而加劇多巴胺能神經元的死亡，使動物出現帕金森病的癥狀。
[0009 ]更進一步地，為了使被注射BML-190的動物出現帕金森病的癥狀，BML-190的質量濃度設置為20?40mg/kg。
[00?0]進一步地，檢測運動協調性的實驗為轉棒實驗，轉速為4?40rpm，時間為200?400s，記錄小鼠掉落時間，重復3次。
[0011]進一步地，動物腦部組織包括黑質區組織、海馬區組織、腦干區組織、皮質區組織，黑質區組織、海馬區組織、腦干區組織、皮質區組織為帕金森病變的主要腦區，取上述組織可以更好的檢測到帕金森病變后腦組織的病變。
[0012]進一步地，動物為非人哺乳動物。
[0013]更進一步地，非人哺乳動物選自小鼠、大鼠。
[0014]更進一步地，所述小鼠為C57B小鼠，C57B小鼠為實驗室常用帕金森病模型建立小
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[0015]更進一步地，大麻素受體拮抗劑注射于C57B小鼠的腹腔部位，本發明選取的藥物注射部位為腹腔，小鼠腹腔部具有注射范圍大、操作簡單、易于實現的優點。
【附圖說明】
[0016]圖1是根據本發明實施方式一中的轉棒實驗分析BML-190對小鼠行為學影響的實驗結果圖；
[0017]圖2是根據本發明實施方式一中的蛋白印跡分析BML-190對小鼠作用后腦部CB2受體蛋白和Pakin蛋白表達變化。
【具體實施方式】
[0018]為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明的各實施方式進行詳細的闡述。然而，本領域的普通技術人員可以理解，在本發明各實施方式中，為了使讀者更好地理解本申請而提出了許多技術細節。但是，即使沒有這些技術細節和基于以下各實施方式的種種變化和修改，也可以實現本申請各權利要求所要求保護的技術方案。
[0019]本發明的第一實施方式涉及一種帕金森病動物模型的制備方法，包括以下步驟:
(I)在每只動物皮下注射大麻素受體拮抗劑，每天一次，連續5?15天，即得動物樣本I; (2)將所述動物樣本I進行檢測運動協調性的實驗，即得動物樣本2; (3)取所述動物樣本2的腦部組織進行檢測，即得帕金森病動物模型。
[0020]作為一種非限制性實施方式，動物可以是非人哺乳動物，優選選自小鼠、大鼠。
[0021]作為一種非限制性實施方式，大麻素受體拮抗劑可以為BML-190。
[0022 ]舉例來說:一種帕金森病小鼠模型的制備方法。
[0023]將體重(0.02g)均等的C57B小鼠隨機分成4組，即:A組、B組、C組、D組，每組為12只小鼠，分別為A組小鼠每天腹腔注射ΙΟΟμΙ的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，為正常對照組;B組小鼠每天腹腔注射ΙΟΟμΙ的BML-190、C組小鼠每天腹腔注射ΙΟΟμΙ的MPTP; D組小鼠每天腹腔注射ΙΟΟμΙ的BML-190和ΙΟΟμΙ的ΜΡΤΡ;其中，BML-190和MPTP注射的時間相隔6h。連續注射12天后(注意:每天固定的時間給藥，其中，上午9點注射MPTP，下午3點注射BML-190、PBS)。將4組小鼠進行轉棒實驗分析，將轉棒實驗中運動協調能力明顯下降的小鼠視為帕金森病小鼠模型，其中，B組小鼠的建模成功率高達92 %。
[0024]另外，實驗中每隔四天稱一次小鼠的體重，其中，帕金森病建模組的小鼠比健康對照組體重低8.9%，并觀察小鼠毛色。實驗終點時，小鼠轉棒實驗進行運動協調能力分析，將轉棒的速度從4轉調到40轉，將所有小鼠在旋轉裝置中預培訓以達到一個穩定的行為，記錄小鼠可以停留在旋轉桿上的時間，重復3次。(以小鼠掉落時間的縮短判斷帕金森病程度，帕金森病越嚴重，小鼠的運動能力越差，反應越遲緩，即在旋轉裝置上停留的時間越短)。
[0025]值得注意的是，小鼠在轉棒上停留的時間是判斷帕金森病癥的一個金標準實驗，如圖1所示，BML-190給藥的B組帕金森病小鼠轉棒掉落時間顯著低于(P〈0.001) A組正常對照組小鼠的水平，而BML-190聯合MPTP給藥的D組小鼠轉棒掉落時間則更低，這說明了 CB2受體拮抗劑可以誘發加重帕金森癥狀。
[0026]為分析BML-190對小鼠腦部神經元凋亡的影響，在本實施方式中，將上述四組小鼠處死，并取四組小鼠的黑質、海馬、腦干、皮質等腦部各區的組織，提取各個組織中的總蛋白通過蛋白印跡法分析檢測多巴胺相關蛋白表達情況，如圖2所示，BML-190給藥后的小鼠，抑制了黑質區和海馬區CB2的表達，抑制黑質區和海馬區Par k i n/P INKI的活性，抑制P13K/AKT通路，在病理水平說明CB2小分子措抗劑可誘發帕金森病，需要說明的是，圖2中的Contro I即為PBS正常對照組。
[0027]本領域的普通技術人員可以理解，上述各實施方式是實現本發明的具體實施例，而在實際應用中，可以在形式上和細節上對其作各種改變，而不偏離本發明的精神和范圍。
【主權項】
1.一種帕金森病動物模型的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)在每只動物皮下注射大麻素受體拮抗劑，每天一次，連續5?15天，即得動物樣本I; (2)將所述動物樣本I進行檢測運動協調性的實驗，即得動物樣本2； (3)取所述動物樣本2的腦部組織進行檢測，即得帕金森病動物模型。2.根據權利要求1所述的帕金森病動物模型的制備方法，其特征在于，所述大麻素受體拮抗劑為BML-190。3.根據權利要求2所述的帕金森病動物模型的制備方法，其特征在于，所述BML-190的質量濃度為20?40mg/kg。4.根據權利要求1所述的帕金森病動物模型的制備方法，其特征在于，所述檢測運動協調性的實驗為轉棒實驗，轉速為4?40rpm，時間為200?400s，記錄小鼠掉落時間，重復3次。5.根據權利要求1所述的帕金森病動物模型的制備方法，其特征在于，所述動物腦部組織包括黑質區組織、海馬區組織、腦干區組織、皮質區組織。6.根據權利要求1所述的帕金森病動物模型的制備方法，其特征在于，所述動物為非人哺乳動物。7.根據權利要求6所述的帕金森病動物模型的制備方法，其特征在于，所述非人哺乳動物選自小鼠、大鼠。8.根據權利要求7所述的帕金森病動物模型的制備方法，其特征在于，所述小鼠為C57B小鼠。9.根據權利要求8所述的帕金森病動物模型的制備方法，其特征在于，所述大麻素受體拮抗劑注射于所述C57B小鼠的腹腔部位。10.根據權利要求1至9任一項所述方法制備的帕金森病動物模型，其特征在于，將所述帕金森病動物模型用于大麻素系統參與帕金森病的病理過程機制的研究和藥物開發。
【文檔編號】A61P25/16GK105878251SQ201610257341
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年4月22日
【發明人】靳令經, 朱融融
【申請人】上海市同濟醫院