治療和/或預防心血管疾病的抗pcsk9化合物和方法
【專利說明】治療和/或預防心血管疾病的抗PCSK9化合物和方法
[0001 ] 相關申請的的交叉參考
[0002] 本申請要求2013年3月15日提交的美國臨時申請號61/789867的權益，其全部內容 通過引用并入本文。
[0003] 關于聯邦資助的研究或開發的聲明
[0004] 在國家心臟、肺和血液研究所(NHLBI)的支持下根據SBIR批準號HL092712作出本 發明。美國政府對本發明具有一定的權利。 發明領域
[0005] 本發明涉及調節前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶Kexin 9型(PCSK9)的生理作用的 化合物，包括其與低密度脂蛋白受體（LDLR)的相互作用。更具體地說，本發明涉及包含 PCSK9功能的小分子調節劑的組合物以及使用這些調節劑作為藥物的方法。PCSK9功能的小 分子調節劑可在治療上用于降低血液中的LDL-膽固醇水平，并且可以用于預防和/或治療 膽固醇和脂蛋白代謝紊亂，包括家族性高膽固醇血癥、導致動脈粥樣硬化的血脂異常、動脈 粥樣硬化，和更通常的，心血管疾病(CVD)。
[0006] 發明背景
[0007] 心血管疾病是導致死亡的原因，而動脈粥樣硬化是心血管疾病的首要原因。動脈 粥樣硬化是動脈的疾病并且導致與工業化國家的許多死亡相關的冠狀動脈心臟疾病。現在 已確定冠狀動脈心臟疾病的幾個危險因素:血脂異常，高血壓，糖尿病，吸煙，不良飲食習 慣，缺乏運動和壓力。血脂異常是血漿膽固醇（高膽固醇血癥)和/或甘油三酯（TGs)的提高 或低的高密度脂蛋白（HDL)水平，這促使動脈粥樣硬化發病。它是一種經證明促進心血管疾 病的代謝疾病。在血液中，膽固醇在脂蛋白顆粒中運送，其中，低密度脂蛋白（LDL)膽固醇 (LDL-C)被認為是"壞的"膽固醇，而HDL-膽固醇(HDL-C)被稱為"好的"膽固醇。由于膽固醇 對動脈粥樣硬化的影響，脂質和脂蛋白異常在一般人群中極為常見，并且被認為是心血管 疾病的高度可改變的危險因素。雖然用他汀類藥物治療(護理動脈粥樣硬化的現行標準）， 60-70%的心血管事件、心臟病發作和中風發生，因此，存在關于CVD的長期感到顯著未滿足 的需求。此外，新的指南建議應該實現更低的LDL水平以保護高危患者免受過早的CVD(l)。
[0008] 在PCSK9和膽固醇代謝之間的聯系建立之后，很快就發現PCSK9基因中的選定突變 引起常染色體顯性高膽固醇血癥(2)，這表明突變通過增加 PCSK9的正常活動而賦予功能獲 得(gain-〇f-function)(3)。這通過野生型和突變PCSK9(S127R和F216L)在小鼠的肝臟中高 水平地表達的實驗得到支持;接受野生型或突變PCSK9的小鼠的肝LDLR蛋白水平急劇下降 (4，5)。未觀察到LDLR mRNA水平的相關降低，表明突變或野生型PCSK9的過表達通過轉錄后 機制降低LDLR。
[0009] 由于PCSK9的功能獲得型突變導致高膽固醇血癥，那么產生功能缺失型突變是否 具有相反的效果并導致低膽固醇血癥的疑問是合乎情理的。在非裔美國人中確定了 PCSK9 的三個功能缺失型突變(6)。這些突變降低LDL-C水平28%，并顯示出降低CHD的頻率(解釋 為心肌梗塞，冠心病死亡或冠狀動脈血管重建)88%。Rashid等人(7)研究了其中滅活PCSK9 的小鼠中功能缺失型突變的機制。他們報告說，這些基因敲除小鼠顯示增加的肝臟LDLR蛋 白（而不是mRNA)，增加的循環脂蛋白的清除以及降低的血漿膽固醇水平。PCSK9的天然存在 的突變的結構功能關系分析也已經提供了對PCSK9的作用機制的深刻理解。有趣的是，被發 現與LDL-C血漿水平的最大降低相關的PCSK9的突變是通過擾亂其合成(Y142X)、自催化處 理(L253F)或折疊(C679X)而防止成熟PCSK9分泌的那些（8)。￥142乂突變不產生可檢測的蛋 白，因為其早在轉錄時發生并且據預計啟動無義介導的mRNA降解。催化結構域(L253F)的突 變干擾蛋白質的自催化切割。表達PCSK9-253F的細胞與表達PCSK9-WT的細胞相比，成熟蛋 白質的量降低，這表明突變抑制自催化切割。L253F突變接近催化三聯體(PCSK9是一種絲氨 酸蛋白酶），因此它可能干擾活性位點（8)。由于蛋白質從ER輸出需要PCSK9的自催化切割， L253F突變延遲PCSK9從ER傳輸到細胞表面。PCSK9中的無義突變(C679X)，其截斷蛋白質14 個氨基酸，不干擾蛋白質加工，但成熟蛋白在細胞中積聚并且不分泌，這表明該蛋白正常地 裂解但被錯誤折疊，并保留在ER中（8，9)。
[001 0 ]尚未完全闡明PCSK9引起LDLR降解的機制。然而，很明顯LDLR降解不需要PCSK9的 蛋白酶活性(IOdlhLi等人(10)已經共同表達了前結構域和反式的催化結構域，并表明所 分泌的PCSK9無催化活性，但在降低細胞LDL攝取和LDLR水平方面它功能上等同于野生型蛋 白。McNutt等人（11)也報道了類似的研究。此外，Zhang等人（12)已經繪制PCSK9結合到LDLR 的EGF-A重復，并且表明這樣的結合降低了受體回收并增加其降解。他們還報道了與EGF-A 結構域的結合是鈣依賴性的，并且隨著PH從7降低到5.2顯著地減少。最近，Kwon等人（13)確 定了與LDLR-EGF-AB(EGF-A和EGF-B)復合的PCSK9的晶體結構。該結構顯示明確界定的EGF-A結構域，但EGF-B結構域是無序的并且未出現在它們的電子密度圖中。EGF-A結構域在遠離 催化位點的位點處與PCSK9催化結構域結合，并且不與C末端結構域或前結構域(14)接觸。 [00 11]已經為靶向PCSK9提出了若干策略（15)。策略l:mRNA基因敲除方法包括使用反義 寡核苷酸或RNAi。對小鼠施用的反義寡核苷酸將PCSK9表達降低了 >90 %并且將血漿膽固醇 水平降低了53% (16)。對食蟹猴單次靜脈注射在類脂質（Iipidoid)中遞送的RNAi將血漿 PCSK9水平降低了70%并且將血漿LDL-C水平降低了56% (17)。策略2:用小分子、肽或針對 PCSK9的抗體防止PCSK9與LDLR在細胞表面上結合。添加 EGF-A片段到培養細胞抑制外源添 加的PCSK9介導LDLR降解的能力。策略3:開發PCSK9加工的小分子抑制劑。盡管有證據表明 LDLR降解不需要PCSK9的催化活性（II)，PCSK9催化活性的細胞內抑制劑應該是有效的，因 為蛋白質從ER分泌需要PCSK9的自催化加工。在其合成之后，PCSK9進行脫去前結構域的自 催化裂解反應，但前結構域仍然連接催化結構域（18，19) 1CSK9的分泌需要自催化加工步 驟(20)，可能是因為前結構域充當分子伴侶和促進折疊。前結構域的持續連接部分地阻斷 PCSK9的底物結合口袋（18，19)。此燦《等人(21)證明分泌的？051(9的拮抗作用增加!1叩62細 胞中的LDLR表達。他們表明，導致功能獲得型突變的m相關的LDLR等位基因（H306Y)是由于 PCSK9與LDLR的親和力增加，這將導致增強的LDLR破壞，和降低的血漿LDL-C清除。另外，他 們能夠優雅地表明用LDLR(H306Y)亞片段阻斷分泌的PCSK9導致培養HepG2細胞的LDLR水平 的增加。因此，PCSK9充當引起LDLR降解的分泌因子，并且干擾自催化過程的小分子抑制劑 應該減少成熟分泌的PCSK9的量。本發明涉及使用策略3識別下調PCSK9的功能的小分子。 [0012]最近（22-24)，1^861161'〇11/3311〇;1^和411^611已經報道了證實單克隆抗體阻斷？031(9 的第二階段概念驗證數據，作為使不受標準他汀類藥物治療控制的患者的LDL-C降低的策 略。他們報告說，單次注射他們稱為REGN727的藥物，在臨床試驗中削減LDL水平超過60%。 他們的方法遵循使用抗體而不是小分子的策略2。該策略2也正由 公司進行，而策略1正由Alnylam、Idera和Santaris進行（25)。

【發明內容】

[0013]本發明涉及選擇性地與PCSK9功能相互作用并且下調PCSK9功能的小分子。在第一 實施方案中，在本發明的實行中使用的試劑具有下面的通式：
[0015] 其中R1J2和R3獨立地選自由H和任選取代的低級烷基、烯基、環烷基、芳基、雜環和 雜芳基組成的組；
[0016] X是0和NR4; R4選自由H和低級烷基組成的組；
[0017] A是〇)、〇)順5、302、(：（=0)-0或到1?1的價鍵 ;1?5選自由!1和低級烷基組成的組；
[0018] M是CO和CR6R75R6和R7獨立地選自由H、低級烷基組成的組；
[0019] Q選自由〇和NR8組成的組;R8選自由H、低級烷基組成的組，或任選地當X是NR4并且Q 是NR8時，R4和R8以及R4和R8各自均連接的氮原子形成任選取代的5或6元雜環，如由 (CRa)n 表示的，其中Ra代表H或低級烷基并且n= 1或2;及所述化合物的藥學上可接受的 鹽和所有的立體異構體。式I的化合物被認為是新的化合物，除了 [(3-氯-4-甲基苯基)氨基 甲酰基](苯基）甲基4-(氨基甲酰基氨基)苯甲酸酯之外。
[0020] 在一個實施方案中，本發明提供了在需要這種治療的患者中治療或預防高膽固醇 血癥和/或血脂異常、動脈粥樣硬化、CVD或冠狀動脈心臟疾病的至少一種癥狀的方法，包括 對這樣的患者施用治療有效量的具有以上式I的化合物。
[0021] 在另一個實施方案中，在需要這種治療的患者中治療或預防高膽固醇血癥和/或 血脂異常、動脈粥樣硬化、CVD或冠狀動脈心臟疾病的至少一種癥狀的本方法通過對需要這 種治療或者預防的患者施用以下化合物的至少一種來實行：
[0023]其中，X1J1和Z1相同或不同并且各自表示氫或選自由羥基、鹵素、氨基、烷氧基、羧 基、酰氨基(包括甲酰胺基、烷基酰氨基和芳基酰氨基）、氨基羰基氨基、單烷基氨基羰基氨 基、二烷基氨基羰基氨基、氨基甲酸酯（carbamato)、酰胺基（carboxamido)、單烷基氨基亞 磺酰基、二烷基氨基亞磺酰基、單烷基氨基磺酰基、二烷基氨基磺酰基、烷基磺酰基氨基、羥 基磺酰氧基、烷氧基磺酰氧基、烷基磺酰氧基、羥基磺酰基、烷氧基磺酰基、烷基磺酰基烷 基、單烷基氣基橫醜基烷基、^烷基氣基橫醜基烷基、單烷基氣基亞橫醜基烷基、^烷基氣 基亞磺酰基和任選取代的低級烷基、烯基、炔基、環烷基、芳基、雜環和雜芳基組成的組的取 代基；
[0024] X是0和NR4; R4選自由H和低級烷基組成的組；
[0025] A是(XKCONR5和S02;R5選自由H和低級烷基組成的組。
[0026]在上述方法的替代實施方案中，對需要這樣的治療或預防的患者施用下列化合物 中的至少一個：

[0030] 其中，在每個式III、IV和V中，X1J1和Z 1可以相同或不同并且各自表示氫或選自由 羥基、鹵素、氣基、烷氧基、駿基、氣基幾基氣基、單烷基氣基幾基氣基、^烷基氣基幾基氣 基、氨基甲酸酯、酰氨基(包括甲酰胺基、烷基酰氨基和芳基酰氨基）、氨基羰基氨基、單烷基 氨基羰基氨基、二烷基氨基、羧基氨基、氨基甲酸酯、酰氨基、單烷基氨基亞磺酰基、二烷基 氨基亞磺酰基、單烷基氨基磺酰基、二烷基氨基磺酰基、烷基磺酰基氨基、羥基磺酰氧基、烷 氧基磺酰氧基、烷基磺酰氧基、羥基磺酰基、烷氧基磺酰基、烷基磺酰基烷基、單烷基氨基磺 酰基烷基、二烷基氨基磺酰基烷基、單烷基氨基亞磺酰基烷基、二烷基氨基亞磺酰基和任選 取代的低級烷基、烯基、炔基、環烷基、芳基、雜環和雜芳基組成的組的取代基;R 9選自由H、 ORiq和NR1V1組成的組;Riq和R 11獨立地選自由H和任選取代的低級烷基、烯基、芳基、雜芳基 或雜環組成的組，或者一起形成任選取代的雜環。
[0031] 在另一個實施方案中，本發明的方法涉及施用具有下式的至少一種化合物：
[0033] 其中X1J1和Z1可以相同或不同并且各自表示氫或選自由羥基、鹵素、氨基、烷氧 基、駿基、氣基幾基氣基、單烷基氣基幾基氣基、^?烷基氣基幾基氣基、氣基甲酸醋、醜氣基 (包括甲酰胺基、烷基酰氨基和芳基酰氨基）、酰胺基、單烷基氨基亞磺酰基、二烷基氨基亞 磺酰基、單烷基氨基磺酰基、二烷基氨基磺酰基、烷基磺酰基氨基、羥基磺酰氧基、烷氧基磺 酰氧基、烷基磺酰氧基、羥基磺酰基、烷氧基磺酰基、烷基磺酰基烷基、單烷基氨基磺酰基烷 基、二烷基氨基磺酰基烷基、單烷基氨基亞磺酰基烷基、二烷基氨基亞磺酰基和任選取代的 低級烷基、烯基、炔基、環烷基、芳基、雜環和雜芳基組成的組的取代基;R 12選自由H和任選取 代的低級烷基、烯基、炔基、環烷基、芳基、雜環和雜芳基組成的組；
[0034] A 是 CO 和 SO2;
[0035] Y 是H2或0。
[0036] 在最后提到的實施方案中，施用的化合物可以是下式的至少一種：
[0038] 其中，X1J1和Z1可以相同或不同并且各自表示氫或選自由羥基、鹵素、氨基、烷氧 基、羧基、酰氨基(包括甲酰胺基、烷基酰氨基和芳基酰氨基）、酰胺基、單烷基氨基亞磺酰 基、二烷基氨基亞磺酰基、單烷基氨基磺酰基、二烷基氨基磺酰基、烷基磺酰基氨基、羥基磺 酰氧基、烷氧基磺酰氧基、烷基磺酰氧基、羥基磺酰基、烷氧基磺酰基、烷基磺酰基烷基、單 烷基氣基橫醜基烷基、^烷基氣基橫醜基烷基、單烷基氣基亞橫醜基烷基、^烷基氣基亞橫 酰基和任選取代的低級烷基、烯基、炔基、環烷基、芳基、雜環和雜芳基組成的組的取代基； R12選自由H和任選取代的低級烷基、烯基、炔基、環烷基、芳基、雜環和雜芳基組成的組;R13 選自由H、0R14和NR14R15組成的組;R14和R 15獨立地選自由H和任選取代的低級烷基、烯基、芳 基、雜芳基或雜環組成的組，或者當連接到氮原子時一起形成任選取代的雜環；
[0039] A 是 CO 和 SO2;
[0040] Y 是H2或0。
[0041]在本發明另一實施方案中，所施用的化合物可以是具有式VIII的化合物：
[0043] 其中，X1J1和Z1可以相同或不同并且各自表示氫或選自由羥基、鹵素、氨基、烷氧 基、羧基、酰氨基(包括甲酰胺基、烷基酰氨基和芳基酰氨基）、酰胺基、單烷基氨基亞磺酰 基、二烷基氨基亞磺酰基、單烷基氨基磺酰基、二烷基氨基磺酰基、烷基磺酰基氨基、羥基磺 酰氧基、烷氧基磺酰氧基、烷基磺酰氧基、羥基磺酰基、烷氧基磺酰基、烷基磺酰基烷基、單 烷基氣基橫醜基烷基、^烷基氣基橫醜基烷基、單烷基氣基亞橫醜基烷基、^烷基氣基亞橫 酰基和任選取代的低級烷基、烯基、炔基、環烷基、芳基、雜環和雜芳基組成的組的取代基； R16選自由H和任選取代的低級烷基、烯基、炔基、環烷基、芳基、雜環和雜芳基組成的組;A是 ⑶和SO 2;并且Y是出或0。在式VIII的一個優選的實施方案中，X1J1和Z1中的至少一個是4-NHCOR 17;其中R17選自由H、OR18、和NR18R 19組成的組;R18和R19獨立地選自由H和任選取代的低 級烷基、烯基、芳基、雜芳基或雜環組成的組，或當連接于氮原子時一起形成任選取代的雜 環。
[0044] 在另一個方面，在本發明的實行中使用的試劑可具有以下通式：
[0046]其中R2Q、R21和R22獨立地選自由H和任選取代的低級烷氧基、烷基氨基、烷基、烯基、 環烷基、芳基、雜環和雜芳基組成的組；
[0047] X是0和NR23; R23選自由H和低級烷基組成的組，或任選地與Q或R1以及它們各自都連 接的原子一起形成任選取代的5或6元環；
[0048] A是(》、〇)順24、302、(：（=0)-0或到1?2()的價鍵 ;1?24選自由!1和低級烷基組成的組；
[0049] M是CO和CR25R26;R25和R26獨立地選自由H、低級烷基、到Q的鍵組成的組，或任選地與 R22和它們各自都連接的原子一起形成任選取代的芳基、雜芳基或雜環；
[0050] Q選自自由0、NR27或到R22的價鍵組成的組;R27選自由H、低級烷基組成的組，或任選 地當X為NR 23且Q是NR27時，R23和R27以及R23和R 27各自都連接的氮原子形成任選取代的5或6元 氮原子雜環，如 (CRa)n---表示，其中Ra表示H或低級烷基且n= 1或2;以及該化合物的藥 學上可接受