含生物活性因子的組織工程軟骨支架及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物材料制備領域，特別涉及一種含生物活性因子的組織工程軟骨支架的制備方法與應用。
【背景技術】
[0002]關節軟骨能減少相鄰兩骨間的摩擦，緩沖運動時產生的震動，所以由體育運動造成的軟骨損傷極為普遍。有數據表明，單美國的軟骨相關手術每年就有超過40萬例。由于軟骨無血管、無神經，傳統觀點認為軟骨損傷無法自發修復，如果不采取外加手段干預治療，會導致進一步的軟骨磨損，甚至引發骨關節炎，對其結構和功能造成不可逆的損害，嚴重影響患者的生活工作質量。目前臨床治療表層軟骨損傷的保守治療方法包括關節腔灌洗清創術，微骨折術等只能減輕關節疼痛和暫時緩解臨床癥狀，并不能有效地促進軟骨組織的修復再生，阻止病程的發展。因此，尋找新型的、可有效促進軟骨生理性再生修復的方法具有極其重要的臨床意義。
[0003]近年來，隨著組織工程和再生醫學技術的不斷成熟，為提高軟骨的修復質量帶來嶄新的機會。天然生物材料I型膠原，由于其免疫原性低，生物相容性好，降解速率可控等優點，被廣泛用于軟骨組織工程支架的制備。
[0004]甲狀旁腺激素相關肽(PTHrP)是甲狀腺激素家族中的一員，作為鈣化抑制因子參與生長板發育過程。甲狀旁腺激素相關肽由173個氨基酸組成，其活性片段1-34與甲狀旁腺激素(PTH) —致。
[0005]現有技術中組織工程軟骨支架的在軟骨修復過程中會出現軟骨鈣化的缺點，骨軟骨損傷的修復效果較差。

【發明內容】

[0006]本發明是提供一種含生物活性因子的組織工程軟骨支架的制備方法，即復合活性因子甲狀旁腺激素相關肽的絲素蛋白膠原雙層支架，其可以解決現有技術中的軟骨修復過程中會出現軟骨鈣化的缺點，有效提高骨軟骨損傷的修復效果。
[0007]本發明采用的技術方案是:
[0008]—種含生物活性因子的組織工程軟骨支架的制備方法，
[0009]包括以下步驟:
[0010](1)將I型膠原溶液以體積比1:2比例平鋪在絲素蛋白支架上，真空冷凍干燥，得到絲素蛋白膠原雙層支架；
[0011](2)將得到的絲素蛋白膠原雙層支架浸泡于20?200 μ g/mL甲狀旁腺激素相關肽溶液中，于30?40°C孵育0.5?2小時。
[0012]一種含生物活性因子的組織工程軟骨支架，其通過上述制備方法制備得到。
[0013]—種含生物活性因子的組織工程軟骨支架在制備骨軟骨損傷修復物中的應用。
[0014]步驟⑴中I型膠原溶液的濃度為5?30mg/mL。
[0015]步驟(2)中絲素蛋白膠原雙層支架在甲狀旁腺激素相關肽溶液中孵育的溫度30?40°C，且孵育的時間為0.5?2小時。
[0016]所述步驟(1)中支架冷凍干燥的條件為-40?_110°C條件下真空冷凍干燥5?10天。
[0017]所述絲素蛋白膠原雙層支架制備方法如下:
[0018](1.1)以桑蠶蠶絲為原料，經脫膠、溶解、透析，獲得絲素蛋白溶液；
[0019](1.2)將無水羥基磷灰石與無水氯化鈉顆粒1?5:1混合，以1:1?10比例加入步驟(1.1)得到的5?30%的絲素蛋白溶液；
[0020](1.3)支架交聯:0?4°C交聯30?40小時，20?30°C交聯3?8小時，30?40°C交聯0.5?1小時，60?70°C交聯1?2小時；
[0021](1.4)將步驟(1.3)交聯后的絲素蛋白支架置于滅菌單蒸水中洗去氯化鈉。
[0022]所述步驟(1.2)中無水羥基磷灰石直徑為20?40nm。
[0023]所述步驟(1.2)中無水羥基磷灰石與無水氯化鈉顆粒的混合比例為1?5:1。
[0024]所述步驟(1.2)中無水羥基磷灰石與無水氯化鈉顆粒混合物與絲素蛋白溶液比例為1:1?10。
[0025]步驟(1.1)所述絲素蛋白溶液的制備方法為:A)脫膠:將100g桑蠶蠶絲放入4?8L的2M碳酸鈉水溶液中，90?100°C水浴20?60分鐘，純水清洗，該過程重復3次，脫去絲膠蛋白，留下絲素蛋白，將絲素蛋白在20?60°C烘干，獲得干燥后的絲素蛋白；B)溶解:將上述干燥后的絲素蛋白溶于9?11M的溴化鋰水溶液中，55?65°C水浴30?300分鐘至絲素蛋白充分溶解，獲得含絲素蛋白的混合液；所述干燥后的絲素蛋白與溴化鋰水溶液的質量體積比為0.1?0.2:1 ;C)透析:將含絲素蛋白的混合液用截留分子量1000?20000道爾頓的透析袋進行透析，用10倍混合液體積的無菌去離子水作為透析液在3天透析10?12次，去除溶液中的溴化鋰成分，獲得所述絲素蛋白溶液。
[0026]進一步，步驟(1.4)中所述滅菌單蒸水與絲素蛋白支架的體積比是1:100?200。
[0027]進一步，步驟(1.4)中所述洗去氯化鈉的方法為清洗1天，換液5?10次。
[0028]進一步，所述I型膠原溶液的制備方法為:A)從二月齡健康白豬豬腿處剝取肌腱，去除筋膜和脂肪，剪碎浸泡于體積濃度75%的乙醇水溶液中，4°C過夜；B)將步驟A的肌腱碎片用蒸餾水沖洗5遍，加入0.5mol/L的乙酸水溶液中，調節pH至1，加入胃蛋白酶，4°C放置3天，獲得膠原溶膠液；所述乙酸水溶液的體積用量以肌腱碎片質量計為18.9mL/g，所述胃蛋白酶質量用量以肌腱碎片質量計為94.7mg/g ;C)將步驟B獲得的膠原溶膠液于4°C、4000rpm水平離心25分鐘，棄上層脂肪層，將沉淀a用0.5mol/L乙酸水溶液稀釋3倍體積，在超凈臺中用4層紗布過濾，將濾液與0.9mol/L的NaCl水溶液以體積比1:10混合，間歇震蕩，4 °C過夜，再在4°C、4000rpm水平離心25分鐘，棄上清液及懸浮物，獲得沉淀b ；D)將沉淀b按下述方式之一處理，制備水溶性I型膠原:a)將沉淀b用0.5mol/L的乙酸水溶液在4°C溶解過夜，所述乙酸水溶液與沉淀b的體積比為4:1，獲得所述水溶性I型膠原；b)將沉淀b置于直徑0.25 μ m的再生纖維素透析袋中，以三蒸水作為透析液，每天換水4?6次，透析3天，將透析袋中透析后的沉淀置于培養皿中-80°C過夜，再于凍干機中抽干2?3天，獲得所述水溶性I型膠原。(E)用1M碳酸氫鈉溶液以體積比1?4:1的比例對步驟(5)得到的5?30mg/mL的I型膠原溶液進行中和。
[0029]步驟(2)所述甲狀旁腺激素相關肽溶液選用商品化的人重組蛋白甲狀旁腺激素相關肽粉末配制。
[0030]步驟⑵所述甲狀旁腺激素相關肽溶液由滅菌PBS緩沖液(pH = 7.4)配制成的水溶液。
[0031]步驟(2)所述甲狀旁腺激素相關肽溶液的體積用量是絲素蛋白膠原雙層支架體積的10?20倍。
[0032]本發明所述的軟骨支架，上層為I型膠原層，能夠誘導細胞迀移粘附，適用于骨軟骨損傷中透明軟骨的修復；下層為絲素蛋白-羥基磷灰石層，有利于新骨形成，適用于骨軟骨損傷中軟骨下骨的修復。
[0033]本發明所述的一種含生物活性因子的組織工程軟骨支架，制備工藝中不接觸有毒物質，未使用變性劑、促凝劑和交聯劑等添加劑。
[0034]本發明所述的一種含生物活性因子的組織工程軟骨支架，在絲素蛋白膠原雙層支架制備完成后與甲狀旁腺激素相關肽溶液復合，避免預先復合甲狀旁腺激素相關肽溶液在支架凍干、滅菌時造成的活性因子失活，最大程度保證了甲狀旁腺激素相關肽溶液的生物活性。
[0035]本發明所述的一種含生物活性因子的組織工程軟骨支架，絲素蛋白膠原雙層支架可以有效的緩釋甲狀旁腺激素相關肽，能夠抑制骨軟骨損傷修復過程中的軟骨鈣化現象，從而提高軟骨修復質量。
【附圖說明】
[0036]圖1實施例1中一種含生物活性因子的組織工程軟骨支架的圖片。
[0037]圖2實施例2中新西蘭大白兔軟骨損傷造模照片。圖2A為新西蘭大白兔造模為4mmX 3.5mm的骨軟骨缺損，圖2B為缺損處植入4_X3_大小的組織工程軟骨支架。
[0038]圖3實施例2中新西蘭大白兔骨軟骨損傷修復16周后的大體結果。圖3A為修復16周組織工程軟骨支架組大體圖片，圖3B為修復16周空白對照組大體圖片。
[0039]圖4實施例2中新西蘭大白兔骨軟骨損傷修復16周后的組織學結果。圖4A為4倍鏡下組織工程軟骨支架組S0染色圖片，圖4B為4倍鏡下空白對照組S0染色圖片。
[0040]圖5為本發明的絲素蛋白膠原雙層支架分析圖譜。圖5A為X衍射(XRD)圖譜，圖5B為傅里葉變換紅外光譜(FTIR)圖。
【具體實施方式】
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[0041]下面結合【具體實施方式】，詳細描述本發明。應理解，這些實施方式僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
[0042]實施例1:
[0043](1)絲素蛋白溶液的制備:a)脫膠:將100g桑蠶蠶絲(5A級)放入5L的2M碳酸鈉水溶液中，98°C水浴30分鐘，純水清洗，該過程重復3次，脫去絲膠蛋白，留下絲素蛋白，將絲素蛋白在50°C烘干，獲得70g干燥后的絲素蛋白，備用；b)溶解:將上述干燥后的絲素蛋白以質量濃度16 %溶于9.3M的溴化鋰水溶液中，60°C水浴90分鐘至絲素蛋白充分溶解，獲得含絲素蛋白和少量不溶性顆粒組成的混合液；c)透析:將混合液用再生纖維素透析袋(截留分子量4000道爾頓)透析，用10倍混合液體積的無菌純水在3天透析12次，去除溶液中的溴化鋰離子，獲得截留液a ;d)濃縮:將透析后的透析袋放入5倍體積的質量濃度50%聚乙二醇(PEG，分子量7000)水溶液，室溫靜置濃縮8小時，取截留液b，即獲得截留液a的濃縮液；e)將截留液b在水平轉子5000g，4°C，離心lOmin，除去底部的未溶解絲素蛋白和溴化鋰中可能存在不溶性顆粒，取上清液，即獲得提純后的絲素蛋白溶液300ml，4°C保存備用Ο
[0044](2)絲素蛋白-羥基磷灰石支架制備:a)取10g直徑為20nm的無水羥基磷灰石與10g無水氯化鈉顆粒混合，加入100ml步驟(1)得到的16%的絲素蛋白溶液，混勻；b)支架交聯:將混合溶液置于4°C冰箱交聯30小時，室